Изменение транскрипционного профиля генов в опухолях как предпосылка персонификации лечения больных раком молочной железы

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее актуальной проблемой современной онкологии, что в первую очередь обусловлено высокой заболеваемостью. Согласно данным GLOBOCAN (совместного проекта Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) и Международного агентства исследований рака (IARC)), в 2022 г. в мире зарегистрировано более 2 308 897 новых пациенток с РМЖ, что составляет 11,6% от всех случаев злокачественных новообразований (ЗНО) [1]. В Российской Федерации в 2023 г. было выявлено 82 499 новых случаев РМЖ, при этом заболеваемость составила 105,37 случая на 100 000 женского населения [2].

РМЖ продолжает оставаться ведущей причиной онкологической смертности среди женщин, составляя 6,9% всех случаев смерти от ЗНО в мире и 665 684 случая смерти в год (GLOBOCAN, 2022) [1]. В РФ смертность от РМЖ (грубый показатель) в 2023 г. составила 23,73 случая на 100 000 женского населения. Причем в течение последних 10 лет этот показатель уменьшился на 16,22% [2]. Уменьшение смертности, с одной стороны, связано с улучшением ранней диагностики. В 2024 г. РМЖ на I стадии был диагностирован у 34%, тогда как 10 лет назад этот показатель составлял только 23,6% [3]. С другой стороны, снижение смертности обусловлено внедрением в клиническую практику эффективной адъювантной терапии, которая в первую очередь зависит от максимальной индивидуализации лечения [4, 5].

Персонифицированная терапия ЗНО подразумевает назначение пациентам оптимального лечения согласно их индивидуальных особенностей (включая генетический профиль) и молекулярных характеристик конкретных опухолей.

Серьезной проблемой для онкологов является выбор метода адъювантной системной терапии, которую на основании имеющихся клинических рекомендаций получают практически все пациентки с РМЖ [6—8]. Вместе с тем имеются данные, что практически у 60% этих пациенток, получающих лечение в соответствии с действующими рекомендациями, отмечается значительное ухудшение качества жизни из-за токсичности при незначительном или отсутствующем улучшении выживаемости [9, 10].

Одним из наиболее доступных и дешевых методов персонификации адъювантной терапии РМЖ является предоперационный тест на гормоночувствительность, который заключается в краткосрочном (2—4 нед) назначении гормональных препаратов на дооперационном этапе. Оценка динамики пролиферативной активности опухоли по изменению уровня Ki-67 и экспрессии гормональных рецепторов позволяет спрогнозировать клинический ответ и оценить эффективность эндокринотерапии in vivo и соответственно избавить часть пациенток от ненужной высокотоксичной химиотерапии.

Однако в доступных источниках литературы представлено мало данных о изменениях в экспрессии генов в процессе проведения предоперационного теста на гормоночувствительность.

Цель исследования — оценить изменения экспрессионной активности генов при проведении предоперационного теста на гормоночувствительность опухоли к ингибиторам ароматазы у женщин постменопаузального возраста и к тамоксифену у пациенток в пременопаузе при ESR+/HER2- раке молочной железы.

В исследование включено 174 больных РМЖ, РМЖ в возрасте 49‒84 лет (63,3 года [28—84]), получивших лечение в отделении патологии молочной железы ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России в период с января 2019 по август 2024 г.

Критериями включения были: инвазивный РМЖ, люминальный Her2- негативный подтип опухоли, проведение предоперационного теста на гормоночувствительность, информированное согласие пациентки на участие в исследовании. К критериям исключения относилось неадекватное качество полученного материала трепанобиопсии для проведения молекулярно-генетических исследований.

У 100 (57,5%) пациенток была зарегистрирована менопауза, а у 74 (42,5%) — пременопауза (табл. 1). Размеры опухоли менее 2 см были диагностированы в 62,6% случаев. У 158 (90,8%) пациенток метастазы в региональных лимфатических узлах не выявлены. Во всех случаях заболевания отсутствовали отдаленные метастазы.

Таблица 1. Характеристика пациенток (n=174, 100%)

Примечание. ЭР — эстроген-рецептор, ПР — прогестерон-рецептор.

Среди гистологических вариантов преобладал неспецифический вариант — 131 (75,3%). В исследование включено 19% образцов с низкой степенью злокачественности (G1), 71,8% — с умеренной (G2) и 9,2% — с высокой степенью (G3). Все опухоли были гормонозависимыми, средний уровень Ki-67при этом составил 24,08±14,32.

При определении подтипа РМЖ методом ИГХ в 76 (44%) случаях был диагностирован люминальный А подтип и в 98 (56%) — люминальный В Her2-негативный подтип опухоли.

После проведения трепанобиопсии на дооперационном этапе пациентки в постменопаузе в течение 1‒8 нед принимали ингибиторы ароматазы (летрозол в дозе 2,5 мг или анастрозол в дозе 1 мг один раз в сутки), в пременопаузе — тамоксифен в дозе 20 мг один раз в сутки. У каждой пациентки исследован материал трепанобиопсии до проведения теста на гормоночувствительность и образец опухоли, полученный в результате хирургического вмешательства.

Проведены гистологическое и иммуногистохимическое исследования биопсийного и операционного материала. Образцы отбирали в течение 30 мин после удаления опухоли и фиксировали в течение 48 ч в нейтральном забуференном формалине. После фиксации образцы помещали в автоматический микроволновой гистопроцессор LOGOS (Milestone, Италия) для ускоренной проводки тканей. Полученные срезы толщиной 4—5 мкн окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопические препараты исследовали методом обзорной микроскопии, которую осуществляли на световом микроскопе Olympus BX46 (Olympus Corp., Япония). Иммуногистохимическую диагностику проводили на иммуногистостейнере BenchMark ULTRA (Ventana, Roche) с использованием антител к рецепторам эстрогенов (ER, клон SP1, VENTANA), прогестерона (PgR, клон 1E2, VENTANA), к Ki-67 (клон MIB-1, VENTANA), к онкопротеину гена эпидермального фактора роста 2-го типа человека (c-erbB2).

При проведении молекулярно-генетических исследований использовали транскрипционную панель, включающую 45 целевых и 3 референсных гена (табл. 2).

Таблица 2. Гены, включенные в состав транскрипционной сигнатуры

Для проведения исследования парафиновые срезы толщиной 4—5 мкн в количестве 2—3 штук помещали в сухие пластиковые пробирки объемом 1,5 мл. Подбор и подготовку материала осуществлял врач-патоморфолог с учетом результатов патоморфологического исследования.

Выделение тотальной РНК проводили после предварительной обработки образцов протеиназой К (набор реагентов «Проба-ПК»; «НПФ ДНК-Технология», Россия), далее использовали набор реагентов для выделения нуклеиновых кислот на основе спиртового осаждения «Проба НК-плюс» («НПФ ДНК-Технология», Россия). Полученные препараты РНК сразу использовали для постановки реакции обратной транскрипции со смесью олигонуклеотидов, специфичных для каждого гена. Реакцию обратной транскрипции проводили в течение 30 мин при температуре 40 °C с последующей инактивацией обратной транскриптазы в течение 10 мин при температуре 95 °C.

Транскрипционный профиль генов определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР в реальном времени. Постановку ПЦР осуществляли с использованием детектирующих амплификаторов «ДТпрайм» («НПФ ДНК-Технология», Россия) по программе: 94 °C 5 мин; 5 циклов 94 °C 30 с — 64 °C 15 с; далее 45 циклов 94 °C 10 с — 64 °C 15 с и хранение. В состав реакционных смесей входили олигонуклеотиды, специфичные в отношении мРНК, не амплифицирующие с матриц геномной ДНК, фланкирующие ампликоны размером до 100‒120 п.н., что важно при работе с ДНК после фиксации в формалине. Детекцию продуктов амплификации осуществляли при температуре отжига праймеров за счет использования флюоресцентно-меченных Taq-Man проб (Fam, Cy5).

По завершении амплификации уровень представленности транскриптов рассчитывали методом сравнения индикаторных циклов (метод ∆Ct) с нормировкой относительно референсных генов B2M, GUSB, HPRT1. Данные представлены в относительных единицах (о.е.) в ln-шкале.

Для лучшего восприятия результатов исследования было рассчитано соотношение уровня экспрессии до терапии к уровню экспрессии после терапии (R) по формуле: R = Eb/Ea, где Eb — нормированный уровень экспрессии до терапии; Ea — нормированный уровень экспрессии после терапии; R > 1 расценивали как снижение экспрессии, R<1 — как повышение экспрессии.

Статистические методы. Полученные результаты представлены в виде Me [1Q—3Q] (медиана, 1-й и 3-й квартили). При сравнении транскрипционных профилей генов до и после теста на гормоночувствительность использовали T-критерий Уилкоксона для сравнения двух зависимых выборок. Критерий статистической значимости результатов принимали во внимание при значении p<0,01. Расчет проводили с помощью программы статистической обработки результатов SPSS 17 (IBM, США).

После применения ингибиторов ароматазы в качестве предоперационного теста на гормоночувствительность в исследуемых образцах опухолей определены статистически значимые изменения в экспрессии мРНК 37 генов, из них снижение уровня экспрессии установлено для 35 генов (ESR1, PGR, AR, ERBB2, FGFR4, MKI67, MYBL2, CCNB1, AURKA, BIRC5, CCND1, CCNE1, CDKN2A, KIF14, PPP2R2A, PTTG1, TMEM45B, TPX2, ANLN, MMP11, CTSL2, EMSY, PAK1, BCL2, BAG1, PTEN, TYMS, EXO1, UBE2T, NAT1, SCGB2A2, GATA3, FOXA1, ZNF703, CD274/PD-L1), повышение — для двух генов SFRP1 и KRT5(табл. 3).

Таблица 3. Изменения экспрессии мРНК маркеров после применения ингибиторов ароматазы

После применения тамоксифена в предоперационном тесте на гормоночувствительность статистически значимые различия в экспрессии мРНК генов получены для 36 генов с уровнем значимости p<0,01 и для 5 генов с уровнем значимости p<0,05. Статистически значимое снижение уровня экспрессии мРНК установлено для 35 генов: ESR1, PGR, AR, EGFR, ERBB2, FGFR4, MKI67, MYBL2, CCNB1, AURKA, BIRC5, CCND1, CCNE1, CDKN2A, KIF14, PPP2R2A, PTTG1, TMEM45A, TMEM45B, TPX2, ANLN, MMP11, EMSY, PAK1, BCL2, BAG1, PTEN, TYMS, EXO1, UBE2T, NAT1, GATA3, FOXA1, ZNF703, CD274/PD-L1, а повышение — только для одного гена MYC(табл. 4).

Таблица 4. Изменения в экспрессии мРНК маркеров после применения тамоксифена

У женщин в пременопаузе основным источником эстрогенов являются яичники. Тамоксифен связывается с эстрогеновыми рецепторами, не позволяя тем самым эстрогенам связываться с рецепторами. При этом уменьшается биологическая активность эстрогенов и прерывается сигнальный путь к стимуляции пролиферативных процессов. У женщин в постменопаузе эстрогены образуются преимущественно при участии фермента ароматазы, который превращает синтезирующиеся в надпочечниках и жировой ткани андрогены (тестостерон и андростендион) в эстрадиол и эстрон. Поэтому для данной когорты пациенток при лечении опухолей молочной железы люминальных подтипов используют селективные ингибиторы ароматазы (летрозол, анастрозол). Ингибиторы ароматазы блокируют синтез эстрогенов путем высокоспецифичного конкурентного связывания с субъединицей ароматазы, кодируемой геном цитохрома Р450 CYP19A1 [11—13].

В рамках настоящей работы мы проанализировали различия в экспрессии ключевых генов при использовании в качестве теста на гормоночувствительность тамоксифена и нигибиторов ароматазы, которые представлены в табл. 5.

Таблица 5. Эффекты препаратов на критически важные биологические процессы

Примечание. ИА — ингибиторы ароматазы; ТАМ — тамоксифен; ER — эстроген-рецептор.

Превосходство ингибиторов ароматазы особенно очевидно в контексте подавления пролиферации. Снижение экспрессии гена MKI67 (Ki-67) в 3,7 раза против 2,1 раза является прямым свидетельством более мощного цитостатического действия. Этот эффект распространяется на всю сеть генов, контролирующих деление клетки (AURKA, CCNB1, CCNE1 и др.), что формирует целостный и глубокий антипролиферативный ответ.

Наиболее показательным биохимическим маркером эффективности блокады эстрогенового сигнала является ген PGR. Его выраженность напрямую регулируется активированным рецептором эстрогена. Факт того, что ингибиторы ароматазы снижают уровень мРНК PGR в 5,5 раза, в то время как тамоксифен — лишь в 2,2 раза, свидетельствует о качественно разной степени подавления функциональной активности ER-пути. Это позволяет предположить, что лишение опухоли лиганда (эстрогена) является более эффективной стратегией для «отключения» зависимой от него транскрипционной программы, чем конкурентная блокада самого рецептора [14, 15].

При этом анализ выявил и важные специфические эффекты тамоксифена. Во-первых, это статистически значимое повышение экспрессии онкогена MYC. Данный факт нельзя игнорировать, так как MYC является центральным регулятором клеточного роста, метаболизма и пролиферации, а его гиперэкспрессия часто связана с агрессией опухоли и резистентностью к терапии. Этот сигнал может указывать, что блокада рецептора в части случаев быстро запускает компенсаторные механизмы, которые не возникают при подавлении синтеза гормона. Во-вторых, более сильное подавление гена MMP11 тамоксифеном требует отдельного изучения, но может говорить о его особом влиянии на микроокружение опухоли и пути инвазии.

Полный сравнительный анализ экспрессии мРНК подтверждает, что короткий предоперационный курс ингибиторами ароматазы вызывает более мощный и однородный молекулярный ответ, характеризующийся глубоким подавлением пролиферации и полным угнетением эстрогензависимой сигнализации. Терапия тамоксифеном также эффективна, но приводит к менее выраженному подавлению ключевых мишеней и, что критически важно, может сопровождаться ранней активацией онкогена MYC — потенциального маркера развития резистентности. Эти данные подчеркивают различную биологическую эффективность данных классов препаратов и поддерживают позицию ингибиторов ароматазы как препаратов выбора у пациенток в постменопаузе, в то время как выявленные уникальные эффекты тамоксифена требуют дальнейшего изучения для персонализации лечения.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке научных исследований в рамках Государственного задания «Персонификации адьювантной терапии больных с люминальными Her2-негативными подтипами рака молочной железы с использованием предоперационного теста на гормоночувствительность» (номер государственного учёта в системе ЕГИСУ НИОКТР — 124020600031-3).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Кометова В.В., Ашрафян Л.А., Михалёва Л.М.

Сбор и обработка материала — Кометова В.В., Родионова М.В.

Статистическая обработка — Бурменская О.В.

Написание текста — Бурменская О.В., Родионов В.В.

Редактирование —Трофимов Д.Ю.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.