Рак желудка (РЖ) занимает 4-е место по заболеваемости и 5-е по смертности в мире в структуре обоих полов среди всех видов злокачественных новообразований, согласно статистике Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) за 2022 г. [1]. По данным отечественной статистики, РЖ занимает 5-е место среди мужчин и 8-е среди женщин по уровню заболеваемости и является одной из ведущих причин смерти от онкологических заболеваний среди обоих полов [2]. Выбор метода лечения и оценка прогноза при РЖ в первую очередь зависят от распространенности онкологического процесса согласно классификации TNM [3], однако для более персонифицированного подхода к лечению пациентов необходим поиск дополнительных предиктивных характеристик опухоли. В последние годы все больше внимания уделяется феномену опухолевого почкования (tumor budding, TB) — фактору агрессивного течения опухолевого процесса и неблагоприятного прогноза [4].

Высокий уровень TB может быть взаимосвязан не только с неблагоприятным прогнозом выживаемости, но и с показателями, оцениваемыми при назначении иммунотерапии, которая активно используется в лечении РЖ в последние годы. Основными маркерами, использующимися для персонализированного подхода и позволяющими назначать иммунотерапевтические препараты, являются статус системы репарации неспаренных оснований ДНК, определенный методом ПЦР или ИГХ, PD-L1-статус и количество опухолеинфильтрирующих лимфоцитов (TILs).

Наиболее подробно связь TB и показателей, использующихся для назначения иммунотерапии, описана при колоректальном раке. Исследование, проведенное J.R. Jass и соавт. [5], показало, что частота как соматических мутаций, так и степень TB увеличиваются при раке толстой кишки с высоким уровнем микросателлитной нестабильности (MSI-H). Низкая степень TB при колоректальном раке MSI-H является фактором благоприятного прогноза для этой подгруппы пациентов. Напротив, в исследовании, проведенном в 2023 г., обнаружено, что наличие опухолевых почек в колоректальных карциномах не зависит от статуса сохранности системы репарации неспаренных оснований ДНК, определенной методом ИГХ [6]. С другой стороны, есть данные, что в опухолях с сохранной ядерной экспрессией MLH1 и/или PMS2 (pMMR/MSS) вероятность образования опухолевых почек выше, чем у пациентов с утраченной экспрессией [7].

Известно, что PD-L1 — это лиганд для молекулы-контроллера реакций на поверхности иммунных клеток (PD-1), который экспрессируется на опухолевых клетках. Благодаря связыванию PD-L1 и PD-1 опухолевые клетки избегают противоопухолевого иммунного ответа [8]. В исследовании S. Korehisa и соавт. [9] сообщалось, что экспрессия PD-L1 в клетках колоректального рака не коррелировала с TB высокой степени, однако экспрессия PD-L1 в клетках иммунного микроокружения была достоверно связана с наличием большого количества опухолевых почек. В исследовании J.H. Kim и соавт. [10] получены другие результаты. Авторы сообщили, что высокая степень опухолевого почкования достоверно коррелирует с экспрессией PD-L1 в клетках колоректального рака с dMMR [10]. Похожие данные получены I.E. Secinti и соавт. [11], которые показали, что в случае положительного PD-L1-статуса количество опухолевых почек в инвазивном крае было выше (p = 0,023). Различия в результатах приведенных исследований могут быть связаны с разными методами определения ТВ, поэтому необходимо дополнительно проанализировать связь между количеством опухолевых почек и экспрессией белков системы MMR/PD-L1 в соответствии со стандартными классификационными критериями TB.

В настоящее время существуют единичные исследования [12, 13], посвященные корреляции опухолевого почкования с dMMR/pMMR- и PD-L1-статусом при РЖ. При РЖ усиление перитуморального воспаления приводит к снижению количества опухолевых почек из-за связанного с воспалением разрушения опухолевых клеток в инвазивном крае [12]. Однако возможен и другой механизм, при котором опухолевые почки создают вокруг себя привилегированную иммунную среду, снижая количество TILs [13].

Таким образом, учитывая интересные и противоречивые данные относительно взаимосвязи степени TB с dMMR/pMMR- и PD-L1-статусом, изучение данного вопроса при РЖ является чрезвычайно актуальным.

Материал и методы

Мы ретроспективно проанализировали операционный материал от 173 пациентов, оперированных по поводу РЖ в период 2010–2021 гг. В исследование были включены только подтвержденные гистологически аденокарциномы тубулярного строения с инвазивным краем. Исключены пациенты с неадекватным качеством образцов или метастатическим РЖ. Данное исследование было одобрено локальным этическим комитетом (номер протокола 10/21, МГУ им. М.В. Ломоносова).

Оценка опухолевого почкования (TB). TB оценивали тремя методами, соответствующими рекомендациям ITBCC, адаптированным для РЖ:

1. H. Ueno и соавт. [14]: окраска гематоксилином и эозином, анализ «горячей точки» (hot spot) в инвазивном крае с увеличением в 20 раз; TB подсчитывали как число одиночных клеток или кластеров 5 клеток и менее в поле зрения.

2. L. Wang и соавт. [15]: окраска гематоксилином и эозином, подсчет TB в 5 зонах максимального почкования с увеличением в 20 раз и последующим вычислением среднего значения.

3. E. Karamitopolou и соавт. [16]: иммуногистохимическая окраска панцитокератином (PanCK, клон AE1/AE3, 1:100, Dako), оценка TB в 10 зонах максимального почкования с увеличением в 40 раз и вычислением среднего значения.

По методу Ueno был проанализирован материал от 173 пациентов, а по методам L.Wang и E. Karamitopolou — от 171 пациента.

Пациенты были разделены на группы с низкой (TB1) и высокой (TB2) степенью TB на основе пороговых значений: менее 5 почек для LG-TB и 5 и более для HG-TB по всем методам [10]. Оценку проводили два независимых патоморфолога (согласованность Kappa более 0,85). Группы обозначены как UBd1/UBd2 — метод H. Ueno, как WBd1/WBd2 — метод L. Wang и как KBd1/KBd2 — метод E. Karamitopolou.

Определение dMMR/pMMR- и PD-L1-статуса. Статус dMMR/pMMR определяли с помощью иммуногистохимического окрашивания антителами к MSH2 (клон FE-11, 1:50, Cell Marque), MSH6 (клон EP49, RTU, Ventana), MLH1 (клон ES05, 1:50, Dako), PMS2 (клон EP51, 1:40, Ventana). Опухоли считали dMMR (MMR deficient) при отсутствии ядерной экспрессии в опухолевых клетках хотя бы одного маркера при сохраненной экспрессии в нормальных клетках (эпителий, гладкомышечные клетки, лимфоциты). При сохранности экспрессии всех маркеров опухоли относили к группе pMMR (MMR proficient) (рис. 1). PD-L1-статус оценивали с использованием клонов SP263 и SP142 (Ventana) с порогом Combined Positive Score (CPS) >1 для положительного результата (рис. 2). Все слайды анализировали с использованием автоматизированной системы сканирования (Aperio, Leica) для минимизации субъективности.

Рис. 1. Экспрессия маркеров микросателлитной нестабильности в раке желудка.

Наличие ядерной экспрессии в опухолевых клетках пары MSH2/MSH6, отсутствие ядерной экспрессии в опухолевых клетках пары MLH1/PMS2. Положительная экспрессия маркеров в клетках стромы (положительный внутренний контроль).

Иммуногистохимическая реакция с антителами к: а — MLH-1; б — MSH2; в — MSH6; г — PMS2. Об. ×20.

Рис. 2. PD-L1-статус опухолевой ткани.

Положительная иммуногистохимическая реакция с антителами к PD-L1: а — клон SP263 (Ventana); б — клон SP142 (Ventana). Об ×20.

Статистический анализ. Корреляции между TB, dMMR, pMMR и PD-L1 анализировали с использованием χ²-теста и логистической регрессии для многовариантного анализа, корректирующего стадию (TNM), возраст, пол и гистологический подтип. Уровень статистической значимости установлен при p<0,05. Мощность исследования рассчитана для обнаружения эффекта размера 0,3 при α=0,05, что дало 80% мощности для подгруппы (n=21) dMMR. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы PASW Statistics 22.

Результаты

При подсчете количества случаев dMMR и pMMR, а также сопоставлении их со степенью почкования, определенной различными методами, были получены результаты, указанные в табл.1.

Таблица 1. Статус сохранности системы репарации неспаренных оснований ДНК в раке желудка с низкой и высокой степенями TB, определенной методами H. Ueno (UBd), L. Wang (WBd), E. Karamitopolou (KBd)

При подсчете методом H. Ueno в группе опухолей с TB низкой степени обнаружено 19 (15,6%) случаев новообразований dMMR и 103 (84,4%) карцином pMMR (рис. 3, а, 4, а, б). В группе с TB высокой степени (рис. 4, в, г) количество новообразований dMMR составило лишь 4% (2 наблюдения из 51), а число карцином pMMR — 96% (49 случаев). При статистической обработке данных установлено, что в группе с TB низкой степени число карцином dMMR, оцененных с помощью метода H. Ueno, значимо превышает количество опухолей pMMR (p=0,035).

Рис. 3. Распределение по статусу сохранности и дефицита системы репарации неспаренных оснований ДНК рака желудка с низкой и высокой степенью ТВ.

Степень опухолевого почкования, определенная по методу: а — H. Ueno; б — L. Wang; в — E. Karamitopolou; г — низкая степень TB. Об. ×20.

Рис. 4. Экспрессия маркеров микросателлитной нестабильности в раке желудка с низкой и высокой степенью TB в области инвазивного края.

Рак желудка с низкой степенью TB в области инвазивного края: а — окраска гематоксилином и эозином; б - отсутствие ядерной экспрессии одного из маркеров микросателлитной нестабильности MLH1, иммуногистохимическая реакция. Об. ×40.

Наличие ядерной экспрессии одного из маркеров микросателлитной нестабильности в раке желудка с высокой степенью TB в области инвазивного края: в — окраска гематоксилином и эозином; г –ядерная экспрессия MLH1, иммуногистохимическая реакция. Об. ×40.

С другой стороны, при рассмотрении группы опухолей dMMR обнаружено 19 (90,5%) случаев с TB низкой степени и лишь 2 (9,5%) с TB высокой степени. В группе новообразований pMMR также преобладали опухоли с TB низкой степени, но соотношение было другим: 103 (68,2%) наблюдения против 49 (31,8%) в группе TB2.

При подсчете методом L. Wang в группе опухолей с TB низкой степени обнаружено 18 (16,5%) случаев новообразований dMMR и 92 (83,5%) карцином pMMR (рис. 3, б; см. рис. 4, а, б). В группе с TB высокой степени (см. рис. 4, в, г) количество новообразований dMMR составило лишь 4,9% (3 наблюдения из 61), а число карцином pMMR — 95,1% (58 случаев). При статистической обработке данных установлено, что в группе с TB низкой степени число карцином dMMR, оцененных с помощью метода L. Wang, значимо превышает количество опухолей pMMR (p=0,028).

С другой стороны, при рассмотрении группы опухолей dMMR обнаружено 18 (85,7%) случаев с TB низкой степени и лишь 3 (14,3%) с TB высокой степени. В группе новообразований pMMR также преобладали опухоли с TB низкой степени, но соотношение было другим: 92 (61,3%) наблюдения против 58 (38,7%) в группе TB2.

При подсчете методом E. Karamitopolou в группе опухолей с TB низкой степени обнаружено 16 (15,7%) случаев новообразований dMMR и 87 (84,3%) карцином pMMR (рис. 3, в; см. рис. 4, а, б). В группе с TB высокой степени (см. рис. 4, в, г) количество новообразований dMMR составило уже 7,4% (5 наблюдений из 68), а число карцином pMMR — 92,6% (63 случая). При статистической обработке данных установлено, что в группе с ТВ низкой степени число карцином dMMR, оцененных с помощью метода E. Karamitopolou, превышает количество опухолей pMMR, однако не достигает статистической значимости (p=0,106).

С другой стороны, при рассмотрении группы опухолей dMMR обнаружено 16 (76,2%) случаев с TB низкой степени и 5 (23,8%) с TB высокой степени. В группе новообразований pMMR также преобладали опухоли с TB низкой степени, но соотношение было другим: 87 (58%) наблюдений против 63 (42%) в группе TB2.

Таким образом, опухоли с низкой степенью TB, определенной методами H. Ueno или L. Wang, статистически значимо коррелируют с dMMR-статусом. Опухоли с высокой степенью TB, напротив, ассоциированы с наличием ядерной экспрессии всех 4 маркеров (см. рис. 4).

При подсчете количества случаев с PD-L1-позитивным и PD-L1-негативным статусом в РЖ и сопоставлении их со степенью почкования, определенной различными методами, были получены результаты, указанные в табл. 2.

Таблица 2. PD-L1-статус в раке желудка с низкой и высокой степенью TB, определенной методами H. Ueno, L. Wang, E. Karamitopolou

При подсчете методом H. Ueno в группе опухолей с TB низкой степени обнаружено 25 и 14 (43,9 и 28,6%) случаев PD-L1-позитивных новообразований (для клонов SP263 и SP142 соответственно); 32 и 35 (56,1 и 71,4%) случаев PD-L1-негативных карцином. В группе с TB высокой степени количество PD-L1-позитивных новообразований составило 32,5 и 23,7% (14 и 10 случаев для клонов SP263 и SP142 соответственно), а число PD-L1-негативных карцином — 67,5 и 76,3% (27 и 29 наблюдений). При статистической обработке данных установлено, что в группе карцином с TB низкой степени, оцененной с помощью метода H. Ueno, количество PD-L1-негативных случаев превышает количество PD-L1-позитивных опухолей, однако значение не достигает статистической значимости (p=0,259; p=0,608 для каждого из клонов (рис. 5, а, б)).

Рис. 5. Распределение по PD-L1-статусу рака желудка с низкой и высокой степенью TB, клоны SP263 (Ventana) и SP142 (Ventana).

Степень опухолевого почкования, определенная по методу: а, б — H. Ueno; в, г — L. Wang; д, е — E. Karamitopolou.

При рассмотрении группы PD-L1-позитивных опухолей обнаружено 25 и 14 (64,1 и 58,3%) случаев с TB низкой степени и 14 и 10 (35,9 и 41,7%) с TB высокой степени (для клонов SP263 и SP142 соответственно). В группе PD-L1-негативных новообразований также незначительно преобладали опухоли с TB низкой степени: 32 и 35 (54,2 и 54,7%) наблюдений против 27 и 29 (45,8 и 45,3%) в группе TB2.

При подсчете методом L. Wang в группе опухолей с TB низкой степени обнаружено 22 и 13 (44,7 и 32,5%) случаев PD-L1-позитивных новообразований (для клонов SP263 и SP142 соответственно); 26 и 28 (55,3 и 67,5%) PD-L1-негативных карцином. В группе с TB высокой степени количество PD-L1-позитивных новообразований составило 34,0 и 23,4% (17 и 11 случаев для клонов SP263 и SP142 соответственно), а число PD-L1-негативных карцином — 66,0 и 76,6% (33 и 36 наблюдений). При статистической обработке данных установлено, что в группе карцином с TB низкой степени, оцененной с помощью метода L. Wang, количество PD-L1-негативных случаев превышает количество PD-L1-позитивных опухолей, однако значение не достигает статистической значимости (p=0,281; p=0,344 для каждого из клонов (рис. 5, в, г)).

При рассмотрении группы PD-L1-позитивных опухолей обнаружено 20 и 12 (56,4 и 54,2%) случаев с TB низкой степени и 19 и 12 (43,6 и 45,8%) с TB высокой степени (для клонов SP263 и SP142 соответственно). В группе PD-L1-негативных новообразований было несколько меньше с TB низкой степени: 25 и 26 (44,1 и 43,7%) наблюдений против 33 и 36 (55,9 и 56,3%) в группе TB2.

При подсчете методом E. Karamitopolou в группе опухолей с TB низкой степени обнаружено 20 и 12 (43,2 и 31,6%) случаев PD-L1-позитивных новообразований (для клонов SP263 и SP142 соответственно); 25 и 26 (56,8 и 68,4%) PD-L1-негативных карцином. В группе с TB высокой степени количество PD-L1-позитивных новообразований составило 37 и 24 % (19 и 12 случаев для клонов SP263 и SP142 соответственно), а число PD-L1-негативных карцином — 63 и 76% (34 и 38 наблюдений). При статистической обработке данных установлено, что в группе карцином с TB низкой степени, оцененной с помощью метода E. Karamitopolou, количество PD-L1-негативных случаев превышает количество PD-L1-позитивных опухолей, однако значение не достигает статистической значимости (p=0,536; p=0,429 для каждого из клонов (рис. 5, д, е)).

При рассмотрении группы PD-L1-позитивных опухолей обнаружено 22 и 13 (56,4 и 54,2%) случаев с TB низкой степени и 17 и 11 (43,6 и 45,8%) с TB высокой степени (для клонов SP263 и SP142 соответственно). В группе PD-L1-негативных новообразований было несколько меньше с ТВ низкой степени: 25 и 26 (42,3 и 40,6%) наблюдений против 34 и 38 (57,6 и 59,4%) в группе TB2.

Таким образом, вне зависимости от выбранного метода подсчета TB в группе PD-L1-положительных карцином (клоны SP263 и SP142) преобладали опухоли с TB низкой степени, однако при обработке данных было установлено, что результаты не достигали статистической значимости как для клона SP263 (p=0,259/0,281/0,536), так и для клона SP142 (p=0,608/0,344/0,429) для каждого из выбранных методов (см. рис. 5).

Обсуждение

В настоящее время опухолевое почкование является важным прогностическим фактором при РЖ. Система подсчета опухолевых почек при РЖ несовершенна, во многих исследованиях для оценки прогноза использовались системы, разработанные для колоректального рака. Система градации степени TB также имеет большое значение для персонализированного подхода при лечении больных РЖ, однако неоднородное гистологическое строение этих опухолей не позволяет в полной мере адаптировать методику ко всем пациентам, страдающим РЖ.

В настоящем исследовании впервые использована самая крупная когорта (173 пациента) с тремя методами оценки TB, адаптированными для РЖ. Низкая степень опухолевого почкования, оцененная по методикам H. Ueno и L. Wang, статистически значимо связана с дефицитом системы опухолей MMR. Высокая степень опухолевого почкования, напротив, достоверно коррелирует с сохранным статусом системы опухолей MMR. При подсчете опухолевых почек по методу E. Karamitopolou статистически значимой связи обнаружено не было. Известно, что для опухолей с дефицитом системы MMR характерна высокая степень лимфоидной инфильтрации стромы. Учитывая наши результаты, можно предположить, что причина невысокого уровня ТВ в опухолях dMMR кроется в разрушении опухолевых клеток воспалительным инфильтратом. Данные о создании иммуносупрессивной среды в инвазивном крае РЖ пока не подтверждены, однако такое направление требует дальнейших исследований, в том числе подсчета CD8-позитивных клеток в инвазивном крае опухолей.

Статистически значимой связи TB с экспрессией PD-L1 (клонов SP236 и SP142) обнаружено не было при использовании любого из методов для подсчета опухолевых почек в инвазивном крае карциномы желудка.

Связь TB с dMMR может оптимизировать выбор пациентов для иммунотерапии особенно в регионах с ограниченным доступом к молекулярной диагностике. Однако утверждение об экономической эффективности подсчета TB требует дополнительных данных, таких как сравнение затрат на иммуногистохимическое исследование и ПЦР, что станет целью наших будущих работ.

Заключение

Наибольшая степень корреляции между уровнем опухолевого почкования и сохранностью системы репарации неспаренных оснований ДНК опухоли обнаружена при подсчете методом H. Ueno. PD-L1-статус опухолей не связан с уровнем TB. Таким образом, оценка TB как легкодоступного и экономически эффективного биомаркера имеет важное прогностическое, предиктивное и потенциальное терапевтическое значение. Более глубокое понимание молекулярных и патогенетических механизмов, лежащих в основе опухолевого почкования, может привести к разработке новых методов лечения рака желудка.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования —Данилова Н.В.

Сбор и обработка материала —Полушкина Т.В., Данилова Н.В.

Статистическая обработка данных —Полушкина Т.В., Данилова Н.В., Калинин Д.В.

Написание текста —Полушкина Т.В.

Редактирование —Данилова Н.В., Калинин Д.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.