Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто диагностируемым типом рака во всем мире по состоянию на 2020 г., по данным международного агентства по исследованию рака GLOBOCAN [1], и также ведущей онкологической патологией у женского населения Российской Федерации [2]. Наряду с увеличением заболеваемости, по статистике Американского онкологического общества, уровень смертности от РМЖ, напротив, снизился за период с 1989 по 2020 г. Это в первую очередь связано с широким использованием маммографического скрининга и, соответственно, с более ранним выявлением опухолей. В то же время увеличение продолжительности жизни пациенток в первую очередь обусловлено изменением подхода к терапии различных молекулярных подтипов РМЖ, выделяемых с помощью иммуногистохимических (ИГХ) и молекулярно-генетических исследований [3]. Помимо определения гистологического варианта и степени дифференцировки опухоли, клинически значимо и закреплено в утвержденных Минздравом клинических рекомендациях определение молекулярно-генетического подтипа РМЖ с использованием суррогатных ИГХ-маркеров [4]. В соответствии с клиническими рекомендациями для ИГХ-исследования в настоящее время используется определение четырех маркеров: рецептора эпидермального фактора роста человека 2-го типа (human epidermal growth factor receptor 2; HER2/neu или ERBB2), рецепторов эстрогенов, рецепторов прогестерона и маркера пролиферативной активности Ki-67 [4, 5].

Экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона наблюдается в большинстве случаев высокодифференцированных карцином молочной железы и при обнаружении позитивного статуса (ER/PR не менее 1% клеток в опухоли) позволяет назначить гормонотерапию [4—7]. Негативный рецепторный статус опухоли при ИГХ-исследовании можно считать достоверным только в случае наличия внутреннего контроля (гетерогенное окрашивание ядер протоков и долек нормальной молочной железы в исследуемом материале) или позитивного окрашивания внешнего контроля. Для определения чувствительности к различным вариантам таргетной терапии оценивается наличие гиперэкспрессии белка HER2/neu ИГХ-методом и/или амплификации гена HER2 методом гибридизации in situ. Статус HER2 определяется в инвазивном компоненте карциномы молочной железы и метастазах. Позитивный статус HER2 оценивается в баллах с учетом пограничного значения 10% окрашенных клеток, полноты и интенсивности окрашивания мембран клеток опухоли [8]. Для неопределенного HER2-статуса (2+) по ИГХ-исследованию статуса требуется проведение дополнительного исследования методом гибридизации in situ [9].

Пролиферация, оцениваемая по экспрессии белка Ki-67, при РМЖ является важным параметром. Уровень экспрессии Ki-67 в 20% принят как медианное значение в клинических рекомендациях Минздрава России, при этом в интервале от 20 до 30% для определения тактики лечения требуется учитывать другие факторы. Экспрессия Ki-67 более чем в 30% опухолевых клеток однозначно говорит о высокой пролиферативной активности [4].

Для достоверной диагностики молекулярного подтипа РМЖ ИГХ-исследование должно проводиться с использованием валидированных антител. В настоящее время в клинической практике на различных автоматизированных платформах (Ventana, DAKO, Leica) используются валидированные и имеющие регистрационные удостоверения Российской Федерации антитела, указанные в табл. 1.

Таблица 1. Валидированные клоны антител различных производителей

В настоящее время в Российской Федерации зарегистрированы новые клоны моноклональных антител к рецепторам эстрогенов — GM030 (РУ №РЗН 2021/14397), рецепторам прогестерона — PBM-5B8 (РУ №РЗН 2021/15913), HER2/neu — PBM-46A6 (РУ №РЗН 2021/15916), Ki-67 — GM010 (РУ №РЗН 2021/13454) («ПраймБиоМед»).

Однако применение новых клонов антител для рутинного диагностического использования в патолого-анатомических отделениях онкологических клиник требует проведения сравнительного исследования с антителами, которые применяются в патолого-анатомических отделениях в течение многих лет. Поэтому исследования по сравнению результатов, полученных с помощью антител различных клонов на одном из наиболее распространенных иммуностейнеров, являются актуальными и своевременными.

Цель исследования — сравнение уровней экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, HER2/neu и Ki-67, выявленных ИГХ-методом с использованием антител производства «Roche Ventana» (США) и «ПраймБиоМед» (Россия) с одной и той же системой детекции UltraView на автоматическом иммуностейнере Ventana Benchmark ULTRA (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение клонов «Roche Ventana» (США) и «ПраймБиоМед» (Россия)

Материал и методы

Материалом для исследования послужили 37 образцов операционного и биопсийного материала инвазивного РМЖ неспецифического типа различной степени злокачественности.

Все образцы были зафиксированы 10% нейтральным формалином в течение 6—24 ч для биопсийного материала и 24—72 ч для операционного материала при комнатной температуре. С каждого блока изготовлено по 9—10 срезов толщиной 3—4 мкм. Срезы высушивали при температуре 37 °C в течение 18—24 ч в термостате. По 1 срезу в каждом из случаев окрашивали гематоксилином и эозином, 8 срезов использовали для проведения ИГХ-реакции с антителами к четырем маркерам (ER, PR, HER2/neu, Ki-67) двумя клонами сравниваемых антител. На каждое стекло с исследуемым срезом также были помещены срезы внутрилабораторного позитивного контроля (шейка матки для PR, ER, миндалина для Ki-67, РМЖ с известным уровнем экспрессии HER2 — 3+ для HER2/neu).

Ранее, на этапе регистрации антител, были проведены исследования по определению чувствительности и специфичности с использованием антител GM030, PBM-5B8, PBM-46A6, GM010 и системы детекции «Универсальная двухстадийная система детекции PrimeVision (антитела к IgG мыши/кролика — HRP/DAB)» «ПраймБиоМед» в сравнении с референсными антителами от других производителей в ручном режиме на 250 биопсиях РМЖ для антител к Ki-67 и на 150 биопсиях РМЖ для антител к рецепторам и HER2. Полученные значения были выше 98%.

Учитывая широкое использование в медицинских учреждениях Российской Федерации иммуностейнеров Ventana Benchmark было принято решение о проведении следующего этапа сравнительного исследования с использованием первичных антител «ПраймБиоМед» и антител «Roche Ventana» в автоматическом режиме с использованием системы детекции UltraViewDAB Ventana и сопутствующих реагентов Ventana.

Иммуногистохимическое исследование

ИГХ-исследование проводилось с антителами к рецепторам эстрогенов (клон SP1 и клон GM030), рецепторам прогестерона (клон 1E2 и клон PBM-5B8), HER2 (клон 4B5 и клон PBM-46A6) и Ki-67 (клон 30-9 и клон GM010) в рабочих разведениях в автоматическом иммуностейнере Ventana BenchMark Ultra с использованием системы детекции UltraView Universal DAB Detection Kit. Для антител Ventana применяли стандартные протоколы, рекомендованные производителем для системы детекции UltraView, приведенные в табл. 3. Для антител «ПраймБиоМед» предварительно были разработаны собственные протоколы, приведенные в табл. 4. Для антител к HER2 (PBM-46A6) с использованием системы детекции UltraView оптимальным оказался протокол, рекомендованный для системы детекции iView (см. табл. 3, 4).

Таблица 3. Стандартные протоколы ИГХ-исследований с антителами («Roche Ventana», США)

Примечание. Здесь и в табл. 4: * — буфер для демаскировки антигена Cell Conditioning 1 (CC1); ** —температура демаскировки 95 °C.

Таблица 4. Протоколы ИГХ-исследования с антителами «ПраймБиоМед» и системы детекции UltraView Universal DAB Detection Kit

Интерпретация результатов иммуногистохимического исследования

Оценка каждого препарата с ИГХ-окрашиванием проводилась независимо 3 специалистами. Все препараты были отсканированы на сканере PANNORAMIC 250 Flash III («3DHISTECH», Венгрия).

Оценка окрашивания антителами к ER и PR проводилась по шкале Allred score в баллах. Отдельно оценивались доля окрашенных опухолевых клеток и интенсивность окрашивания [10].

HER2/neu-статус определялся в соответствии с рекомендациями Американского общества клинической онкологии (ASCO/CAP) 2023 г. [7, 8].

Уровень экспрессии Ki-67 определялся по общепринятым критериям [7, 8, 11].

Для каждого препарата сначала оценивалась ИГХ-реакция на внутрилабораторных позитивных контролях и затем — на исследуемых образцах с использованием светового микроскопа Leica DMRB2500.

Результаты оценки ИГХ-препаратов были оформлены в таблицы, статистические расчеты проводились в программе RStudio в среде R4.3.2.

Количественные переменные сравнивались при помощи методов Вилкоксона и Спирмена. Сравнение категориальных переменных проводилось при помощи точного критерия Фишера, были определены чувствительность и специфичность методов. В качестве образца при статистических расчетах использовались данные, полученные при анализе препаратов с ИГХ-исследованием с антителами и системой детекции Ventana.

Результаты

Все внутрилабораторные контрольные образцы для использованных в работе антител имели адекватное окрашивание, что позволило оценивать образцы опухолей пациенток.

Исследование выявления ER с антителами GM030 показало схожие результаты окрашивания по интенсивности с чувствительностью не ниже 95,24% и специфичностью не ниже 87,5% (табл. 5). Коэффициент корреляции количества окрашенных опухолевых клеток составил 0,98, что говорит о крайне высокой степени корреляции результатов между клонами (рис. 1).

Таблица 5. Чувствительность и специфичность для интенсивности окрашивания ER

Рис. 1. Соотношение долей окрашенных опухолевых клеток между образцами, окрашенными антителами «Roche Ventana» и «ПраймБиоМед».

Интенсивность окрашивания антителами к рецептору эстрогена клонов SP1 и GM030 совпала в 36 (97,30%) из 37 случаев.

В случае 0 и 1 баллов отмечается полное совпадение в интенсивности окрашивания, т.е. чувствительность и специфичность совпали в 100% случаев.

При 2 и 3 баллах количество выявляемых клеток с позитивной реакцией совпало для обоих антител, но была разница в интенсивности: 1 случай с интенсивностью 3 балла продемонстрировал яркость в 2 балла.

Интенсивность окрашивания антителами к рецептору прогестерона клонов 1E2 и PBM-5B8 в данной выборке совпала в 31 (83,78%) из 37 случаев.

Для клона PBM-5B8 отмечается снижение интенсивности окрашивания, но при этом нет значительных потерь в количестве окрашенных клеток.

Ни в одном из случаев без экспрессии, определяемой антителами Ventana, не было выявлено ложнопозитивной реакции. Для оценки 1, 2, 3 балла наблюдалось значительное расхождение в чувствительности и специфичности, однако за счет сохранения количества окрашенных клеток сумма баллов по Allred не показала значительных отклонений (табл. 6).

Таблица 6. Чувствительность и специфичность для интенсивности окрашивания PR

Реакция с антителами к HER2/neu оценивалась по 4-балльной системе, чувствительность и специфичность для результатов 0, 1+, 2+ и 3+ рассчитывались отдельно. Результаты анализа окрашивания антителами к HER2/neu двух клонов — 4B5 и PBM-46A6 — совпали в 36 (97,30%) из 37 случаев (табл. 7). Один случай с результатом для антител Ventana был оценен как 2+, тогда как для антител «ПраймБиоМед» — как 1+, однако эта разница была статистически незначима (p=0,3173) (рис. 2). На этом образце было проведено исследование методом гибридизации in situ (SISH). Соотношение количества генов HER2 и CEP17 составило 1,58, т.е. амплификация не была обнаружена. Результаты ROC-анализа приведены на рис. 3.

Таблица 7. Чувствительность и специфичность для интенсивности окрашивания HER2

Рис. 2. Результат сравнения клонов HER2 4B5 и PBM-46A6.

Рис. 3. Результаты ROC-анализа для клона HER2 PBM-46A6.

Уровень экспрессии Ki-67, оцененный с использованием двух клонов антител 30-9 и GM010, совпал в 32 (86,48%) из 37 случаев.

При оценке Ki-67 сравнивалось количество позитивно окрашенных опухолевых клеток. Количество окрашенных клеток было ниже в среднем на 0,27%, при этом не более чем на 4% в пределах 1 случая (см. рис. 1). Коэффициент корреляции составил 0,998 (p<0,01).

По данным сравнения результатов анализа методом Вилкоксона, выборки сравнения ER, PR, HER2/neu, Ki-67 статистически достоверно не отличались между собой (p=0,097, p=0,06, p=0,32, p=0,057 соответственно).

Статистическая обработка данных ИГХ-исследования продемонстрировала высокую конкордантность результатов окрашивания антител разных клонов ER SP1 и GM030, PR 1E2 и PBM-5B8, HER2 4B5 и PBM-46A6, Ki-67 30-9 и GM010.

Обсуждение

Появление новых производителей реагентов для ИГХ-исследования и новых клонов антител для практического применения при диагностике РМЖ привело к необходимости исследования конкордантности между различными клонами антител к одному и тому же маркеру.

В данном исследовании было изучено 296 препаратов, окрашенных с помощью 8 антител к 4 маркерам РМЖ: ER SP1 и GM030, PR 1E2 и PBM-5B8, HER2 4B5 и PBM-46A6, Ki-67 30-9 и GM010.

Для пробоподготовки материала была использована стандартная методика, рекомендованная Колледжем американских патологов (College of American Pathologists — CAP), ткани фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 6—72 ч [12, 13]. Внутрилабораторные позитивные контроли были взяты в соответствии с рекомендациями Руководства для врачей [5].

Результаты сравнительного исследования для антител к ER и HER2/neu показали высокую (97,30%) конкордантность результатов (рис. 4).

Рис. 4. Сравнительная экспрессия антител различных клонов к ER, PR, HER2 и Ki-67 производства «Roche Ventana» и «ПраймБиоМед».

Для антител к PR и Ki-67 был выявлен более низкий процент совпадений результатов исследования: 83,78 и 86,48 соответственно. Расхождение результатов было обусловлено более низкой интенсивностью окрашивания, при этом специфичность реакции была высокой. В нашем исследовании показана высокая корреляция результатов, полученных при использовании первичных антител производства «ПраймБиоМед» на автоматическом иммуностейнере Ventana BeachMark с системой детекции UltraView Ventana, с результатами, установленными при использовании полного набора реагентов производства Roche «Ventana».

В аналогичном исследовании по определению HER2-статуса РМЖ с использованием диагностикумов разных производителей HercepTest mAb pharmDx (Dako Omnis; HercepTest (mAb)) и PATHWAY anti-HER-2/neu (4B5; PATHWAY 4B5) в 119 случаях РМЖ с разной степенью экспрессии HER2 была показана степень соответствия двух систем окрашивания 98,2% [14]. Эти данные сходны с результатами нашего исследования для HER2/neu и ER.

В заключение следует отметить, что проведенное исследование показало высокую чувствительность и специфичность моноклональных антител ER GM030, PR PBM-5B8, HER2/neu PBM-46A6, Ki-67 GM010 («ПраймБиоМед»). Продемонстрирована возможность применения этих клонов антител на иммуностейнерах BenchMarkVentana с системой детекции UltraView DAB Detection Kit с созданием и использованием внутрилабораторных валидированных протоколов для определения молекулярно-генетического подтипа РМЖ для выбора адекватной терапии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Д.В. Самойлова, Л.Э. Завалишина

Сбор и обработка материала — Д.В. Калинин, Д.В. Самойлова, Н.Ю. Германович, О.А. Кузнецова

Статистическая обработка — Н.В. Данилова, О.А. Кузнецова, Л.Э. Завалишина

Написание текста — Д.В. Калинин, Д.В. Самойлова, Л.Э. Завалишина

Редактирование — Д.В. Калинин

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.