Формирование атеросклеротических поражений в крупных артериях обусловлено влиянием как ряда местных факторов (турбулентность кровотока, утолщение интимы, локальная продукция цитокинов и пр.), так и множеством системных воздействий [1, 2]. К последним, в частности, относятся расстройства, связанные с ожирением, такие как дислипидемия, резистентность к инсулину, гипертензия [1]. В развитии указанных нарушений, по крайней мере, частично участвуют адипокины — белки, продуцируемые жировой тканью. Помимо этого, адипокины могут оказывать влияние на функцию эндотелиальных клеток, макрофагов и сосудистых гладкомышечных клеток и тем самым на формирование атеросклеротических поражений [3]. Секретируемый в наибольшем количестве адипокин (адипонектин) способствует нормализации спектра липидов и липопротеинов плазмы и повышает чувствительность тканей к инсулину [4—6]. Однако прямое участие этого адипокина в формировании атеросклеротических поражений является предметом дискуссий [7—9]. Исследования in vitro показали, что адипонектин модулирует выработку цитокинов макрофагами и эндотелиальными клетками [10, 11], уменьшает адгезию моноцитов на эндотелии [12], предотвращает образование пенистых клеток, уменьшает пролиферацию и миграцию гладкомышечных клеток сосудов [13—15]. Все перечисленные типы клеток экспрессируют два типа рецепторов адипонектина (AdipoR1 и AdipoR2), опосредующих передачу адипонектинового сигнала [12, 14, 16].

Ранее мы обнаружили отложения адипонектина в стабильных и нестабильных атеросклеротических поражениях аорты человека [17]. При этом остается открытым: во-первых, происходит ли избирательное накопление адипонектина в области атеросклеротических бляшек аорты или адипокин присутствует и в нормальной интиме у тех же пациентов; во-вторых, синтезируется ли адипонектин в интиме аорты человека или поступает туда из плазмы? Поиску ответов на эти вопросы и посвящено данное исследование.

Материал и методы

Иммуногистохимический анализ проводили на аутопсийных сегментах аорты (дуга аорты, грудной и брюшной отделы), полученных от трех мужчин 50, 59 и 64 лет, умерших от острых сердечно-сосудистых событий. Образцы фиксировали в 4% параформальдегиде, затем анализ проводили в криостатных срезах толщиной 3—5 мкм. Характер поражений был подтвержден гистологически, как описано ранее [17]. Серийные срезы каждого образца анализировали на наличие адипонектина с использованием специфических антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (Biovendor, Чехия), тоже согласно работе [17]. Ядра окрашивали метиловым зеленым (Dako, США).

ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР) осуществляли с использованием образцов артерий человека, полученных во время операций. Протокол клинического исследования одобрен комитетом по этике НМИЦ им. В.А. Алмазова. Информированное согласие получено от всех пациентов. Неповрежденные фрагменты восходящей части дуги аорты иссечены во время операции аортокоронарного шунтирования. Адвентицию и парааортальную жировую ткань удаляли из образцов сосудов под контролем бинокулярного микроскопа. Атеросклеротические бляшки сонных и бедренных артерий (по три бляшки на каждый тип артерии) были взяты в ходе эндартерэктомий, а фрагменты жировой ткани брюшной стенки — у трех пациентов во время липосакции. Эндотелиальные клетки аорты человека получены из фрагментов восходящей аорты во время трансплантации сердца, как описано ранее [18]. РНК из указанных образцов выделяли методом фенол-хлороформной экстракции (Евроген, Россия) либо с помощью набора Qiagen miRNeasy. Качество РНК оценивали, опираясь на соотношение интенсивности поглощения при длинах волн A260/280 (≥1,8) и появление специфических полос при электрофорезе в агарозном геле. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора M-MLV (Promega, США). Для обратной транскрипции взяли 0,5—1 мкг РНК, выделенной из интимы-медии аорты и эндотелиальных клеток аорты, 80 нг РНК полученной из атеросклеротических бляшек, 250 нг РНК — из образцов жировой ткани. ПЦР в реальном времени проводили с использованием наборов «Синтол» (Россия) с праймерами к двум транскриптам адипонектина (ADIPOQ) [17] или к общей кДНК ADIPOQ [19], к гену молекулы адгезии тромбоцитов и эндотелиальных клеток 1 (PECAM1) [17], липопротеинлипазы (LPL, 5’-GCAGAGTCCGTGGCTACC-3’, 5’- TTTTGGCACCCAACTCTCA-3’) и рецепторов адипонектина ADIPOR1 (5’- CCTGGAAAATTTGACATATGGTTC-3’, 5’-AGGCTCAGAGAAGGGTGTCA-3’) и ADIPOR2 (5’-CGGGGAGTAAGAGCAGGAG-3’, 5’- GGGCAGCTCCTGTGTGTAG-3’). Экспрессию искомых генов нормировали по среднему геометрическому уровню мРНК генов домашнего хозяйства, пептидилпролилизомеразы A (PPIA) и рибосомного белка P0 (RPLP0) [17] либо по относительному уровню мРНК глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (GAPDH) [19].

Трансэндотелиальный транспорт АН оценивали с использованием монослоя клеток эндотелиальной гибридомы EA.Hy926 в двухкамерной модели. Верхняя камера представляет собой вставку с полупроницаемой мембраной, установленную в лунку 24-луночного планшета (нижнюю камеру). Клетки выращивали в указанных вставках, покрытых коллагеном 1-го типа, с диаметром пор 1 мкм (Costar, США) в 200 мкл среды DMEM (Sigma, США) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Hyclone, США) в течение 3—4 дней до образования монослоя в виде булыжной мостовой. В нижние камеры добавляли по 700 мкл культуральной среды. После формирования монослоя во вставки добавляли 10 мкг/мл АН (Biovendor, Чехия) либо фосфатно-солевой буфер («Биолот», Россия) в присутствии или в отсутствие 50 нг/мл фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) (MACS, Германия). После 24-часовой инкубации питательные среды из нижних камер отбирали для анализа содержания АН методом вестерн-блоттинга. Для выявления отдельных молекулярных форм АН проводили градиентный электрофорез (3—10%) в полиакриламидном геле без тепловой обработки проб и добавления восстановителей. Нитроцеллюлозную мембрану (Amersham, США) инкубировали с антителами к АН, конъюгированными с пероксидазой хрена (Biovendor, Чехия). Детекцию сигналов проводили при помощи эффективной хемилюминесценции с использованием системы ChemiDoc XRS+ (Biorad, США).

Жизнеспособность клеток определяли методом проточной цитофлуориметрии (Navios, Beckman Coulter, США) с использованием маркеров раннего апоптоза (YO-PRO-1) и позднего апоптоза и некроза (пропидиум йодид). Результаты анализировали в программе Kaluza (Beckman Coulter, США). Достоверность различий — процент живых и мертвых клеток между группами оценивали при помощи U-критерия Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования проведено сравнительное изучение наличия и локализации АН в интиме нормальных и пораженных атеросклерозом участках аорты человека (рис. 1). Очаговые отложения АН выявлены вокруг мононуклеарных клеток фиброзных покрышек стабильных и нестабильных атеросклеротических бляшек аорты (см. рис. 1, в, г), а также в адвентиции (см. рис. 1, д). В то же время в нормальных участках интимы этих же сосудов АН не обнаружен (см. рис. 1, а, б). Негативная реакция на АН также наблюдалась в контрольных срезах стабильных бляшек, обработанных в отсутствие антител к АН (см. рис. 1, е). Полученные результаты указывают на наличие отложений АН в атеросклеротических поражениях аорты и на его отсутствие в нормальной интиме.

Рис. 1. Иммуногистохимический анализ локализации адипонектина.

а, б — нормальная интима; в — стабильная атеросклеротическая бляшка аорты человека; г — нестабильная бляшка; д — отложения адипонектина вокруг адипоцитов в адвентиции аорты человека. Показаны репрезентативные фотографии трех случаев аутопсий; е — отрицательный контроль: окраска препарата стабильной бляшки в отсутствие антител. Иммунопероксидазный метод. Ядра клеток окрашены метиловым зеленым. Звездочки указывают на отложения адипонектина; ×400. Масштабный отрезок соответствует 50 мкм.

Для проверки возможности локального синтеза АН в стенке аорты, в первую очередь в клетках, накапливающихся в интиме при развитии атеросклероза, провели анализ содержания мРНК гена данного адипокина в образцах интимы-медии аорты (рис. 2). Оказалось, что оба транскрипта ADIPOQ не обнаруживались в интиме-медии нормальной аорты, в том числе в изолированных из аорты эндотелиальных клетках, тогда как в парааортальной жировой ткани эти транскрипты присутствовали (см. рис. 2, а). Такая же картина экспрессии наблюдалась и для адипоцитспецифичной мРНК LPL (см. рис. 2, а). В то же время мРНК рецепторов АН, ADIPOR1 и ADIPOR2 (см. рис. 2, б), а также мРНК PECAM1 (см. рис. 2, в), маркера эндотелиальных клеток были обнаружены во всех исследованных образцах (в аорте последний имел низкий уровень экспрессии). При этом мРНК ADIPOQ не выявлялась также в атеросклеротических бляшках сонных и бедренных артерий (см. рис. 2, г).

Рис. 2. Экспрессия гена адипонектина в нормальной интиме-медии аорты и атеросклеротических бляшках.

Относительный уровень мРНК ADIPOQ, LPL (а), ADIPOR1, ADIPOR2 (б) и PECAM1 (в) в образцах парааортальной жировой ткани (n=8), интимы-медии аорты (n=6) и в эндотелиальных клетках, изолированных из аорты (n=5); г — относительный уровень мРНК ADIPOQ в бляшках сонных и бедренных артерий, нормированный на уровень мРНК GAPDH (n=3 на каждый тип). Показаны средние значения ± SEM.

Далее в связи с отсутствием свидетельства о локальном синтезе АН в интиме мы проверили способность данного адипокина проникать через эндотелий. Для этого использовали монослой эндотелиальных клеток линии EA.Hy926, выращенных на полупроницаемых вставках, установленных в лунки культурального планшета. Выяснилось, что транспорт АН через эндотелиальные клетки из верхних камер в нижние был низким, однако добавление во вставки 50 нг/мл провоспалительного цитокина ФНОα приводило к значительной стимуляции транспорта гексамеров (100—130 кДа) и мультимеров (~250 кДа) АН (рис. 3, а). ФНОα не оказывал существенного влияния на жизнеспособность эндотелиальных клеток (рис. 3, б). Это свидетельствует, что увеличение проницаемости монослоя под влиянием ФНОα не вызвано возможной цитотоксичностью указанного цитокина.

Рис. 3. Влияние ФНОα на транспорт адипонектина через монослой клеток EA.Hy926 (репрезентативные данные одного из трех экспериментов).

а — содержание адипонектина определяли в культуральных средах верхних камер на момент добавления и в нижних камерах через 24 ч с помощью вестерн-блоттинга; б — влияние ФНОа на жизнеспособность клеток EA.Hy926. Определяли % живых клеток, клеток в состоянии раннего апоптоза, позднего апоптоза и некроза. Адипо — 10 мкг/мл адипонектина; ФНО — 50 нг/мл фактора некроза опухоли-альфа; ММ — молекулярные массы, кДа; М и Г — мультимеры и гексамеры адипонектина.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что очаговое накопление АН в атеросклеротических поражениях аорты обусловлено поступлением адипокина из плазмы через активированный эндотелий, а не локальным синтезом его в интиме. Активация эндотелиальных клеток может быть вызвана провоспалительными цитокинами, такими как ФНОα. Ранее было показано, что ФНОα повышает трансэндотелиальный транспорт липопротеинов низкой плотности [20]. Данный процесс происходит путем активации кавеолинзависимого транспорта, но не исключен вклад в действие ФНОα парацеллюлярного механизма [20]. Будущие исследования позволят расшифровать механизм, с помощью которого ФНОα увеличивает проницаемость эндотелия для АН.

В отличие от наших данных K. Gasbarrino и соавт. [21], используя материал сонных артерий, обнаружили АН не только в атеросклеротических бляшках, но и в непораженной интиме. При этом содержание АН в интиме сонной артерии прогрессивно возрастало от нормальной сосудистой стенки к стабильным бляшкам и далее к нестабильным атеросклеротическим поражениям [21]. Имеются также доказательства того, что АН проникает через поврежденный, но не интактный эндотелий аорты [22, 23]. Авторы предполагают, что накопление АН в поврежденных сосудах происходит за счет взаимодействия адипокина с коллагенами некоторых типов, расположенных в интиме [22]. При этом остается неясным, оказывает ли связанный с коллагеном АН биологическое действие на клетки сосудистой стенки.

Данные, полученные у нас и у других исследователей [21, 24], указывают на экспрессию рецепторов АН в клетках интимы крупных артерий. Наряду с этим установление локализации АН вблизи эндотелиальных клеток, мононуклеаров и гладкомышечных клеток атеросклеротических бляшек [17, 21, 23, 25], а также данные in vitro [10—15, 23] позволяют предположить, что АН оказывает влияние на процессы атерогенеза. Для проверки этого предположения необходимо исследовать влияние модуляции экспрессии АН или его рецепторов в интиме крупных артерий на развитие атеросклероза.

Заключение

Таким образом, согласно полученным результатам, АН накапливается в атеросклеротической, но не в нормальной интиме аорты. Данный адипокин не синтезируется в нормальной и атеросклеротической интиме. ФНОα стимулирует транспорт АН через эндотелий in vitro. Следовательно, накопление АН в атеросклеротической интиме, вероятно, объясняется увеличением его трансэндотелиального транспорта из плазмы, вызванного проатерогенными стимулами, такими как ФНОα. Синтез рецепторов АН в интиме крупных артерий обеспечивает участие этого адипокина в атерогенезе.

Благодарность

Мы признательны с.н.с. Н.Г. Давыдовой, ФГБНУ «ИЭМ» (Санкт-Петербург), за предоставление образцов аутопсии, зав. лаб. А.В. Федорову, ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова», за предоставление образцов бляшек сонных артерий и нижних конечностей и некоторых данных ОТ-ПЦР, зав. лаб. И.В. Кудрявцеву и н.с. М.К. Серебряковой, ФГБНУ «ИЭМ» (Санкт-Петербург), за помощь в проведении проточной цитофлуриметрии.

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда, грант №22-25-00366.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Д.А. Танянский, П.В. Пигаревский, А.Д. Денисенко

Сбор и анализ данных — Д.А. Танянский, П.В. Пигаревский, С.В. Мальцева, А.Б. Малашичева, П.М. Докшин, В.Е. Успенский, А.В. Лизунов, С.В. Орлов, О.Н. Мальцева, Е.В. Агеева, А.Д. Денисенко

Написание текста — Д.А. Танянский

Редактирование — Д.А. Танянский, П.В. Пигаревский, А.Д. Денисенко

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.