В начале 2000-х годов 5 внутренних подтипов рака молочной железы (РМЖ) были идентифицированы путем иерархической кластеризации значений экспрессии наиболее стабильно экспрессируемых генов до и после химиотерапии в опухолях молочной железы человека [1, 2]. Основанное на результатах этих работ иммуногистохимическое профилирование РМЖ, включающее 3 основных маркера (ER, PR и HER-2), используется в настоящее время и считается лучшим клинически значимым выбором для прогностической патоморфологической оценки РМЖ. Однако хотя молекулярное профилирование обеспечивает важные прогностические показатели, стратификация рисков РМЖ была и остается проблемой в случае с тройным негативным раком, демонстрирующим наибольшую гетерогенность. В 2007 г. J. Herschkowitz и соавт. [3], проводя сравнительный анализ экспрессионного профиля трансгенных моделей РМЖ и РМЖ человека, впервые описали потенциально новый молекулярный подтип, который назвали «низкоклаудиновый» («claudin-low»). В оригинальной характеристике этот подтип отличался стабильно низкой экспрессией генов, принимающих участие в формировании межклеточных контактов, включая, помимо окклюдина и E-кадгерина, также клаудины 3, 4 и 7. Известно, что клаудины, представленные целым суперсемейством трансмембранных белков, являются основными компонентами плотных контактов, обеспечивающих наиболее тесную связь между соседними клетками в эпителиальных и эндотелиальных слоях. После открытия клаудинов в 1998 г. [4] и оценки их ведущей роли в организации плотных контактов сформировалось предположение, что потеря межклеточной адгезии в ходе опухолевой прогрессии может быть обусловлена значительным изменением профилей экспрессии клаудинов, о чем накоплено большое количество свидетельств [5].
По данным J. Herschkowitz и соавт. [3], низкоклаудиновые опухоли РМЖ человека, помимо низкой экспрессии клаудинов 3, 4 и 7, исходно показали также низкую экспрессию генов люминальной дифференцировки, в силу чего их изначально отнесли к трижды негативной группе опухолей. После этой публикации большое количество исследований было посвящено сбору данных в пользу обоснованного выделения низкоклаудиновых опухолей в самостоятельный молекулярный подтип тройного негативного спектра, а также изучению его биологических особенностей, клинической и прогностической значимости. Целый ряд групп исследователей дополнительно охарактеризовали этот новый подтип и показали, что низкоклаудиновые опухоли составляют, по разным оценкам, 7—14% всех случаев инвазивного РМЖ, отличаются высокой активацией генов, связанных с эпителиально-мезенхимальным переходом, а также характеризуются экспрессией маркеров стволовых опухолевых клеток и высокой иммунной инфильтрацией [6—9]. Гистологическое исследование ограниченного количества опухолей, подходящих для этой категории, показало также более высокую, чем ожидалось, распространенность медуллярно-подобных и метапластических опухолей специального типа [10—12]. По свидетельству большинства авторов, низкоклаудиновые опухоли молочной железы обладают повышенной агрессивностью, связаны с плохим прогнозом с некоторыми свидетельствами того, что они могут быть относительно устойчивы к обычным химиотерапевтическим агентам [7, 8, 13]. Существование низкоклаудинового подтипа РМЖ позже подтвердилось на транскрипционном уровне в нескольких независимых когортах [14—16], и аналогичный низкоклаудиновый подтип был позже идентифицирован при раке мочевого пузыря [17], раке желудка [18] и серозном раке яичника [19].
Принципиально считается, что низкоклаудиновая подгруппа опухолей может быть достоверно определена только путем профилирования экспрессии генов. Однако понимание того, что иммуногистохимическая оценка предполагает гораздо более удобный и дешевый подход к типированию РМЖ, толкает исследователей к разработке суррогатных иммуногистохимических панелей для выделения отдельного молекулярного подтипа «claudin-low». На сегодняшний день попытки разработать такую панель касаются только РМЖ. Исключительным стимулом в этом отношении является тот факт, что внутренние молекулярные подтипы, также первоначально идентифицированные путем профилирования генной экспрессии, были чрезвычайно успешно подтверждены иммуногистохимическим профилированием и быстро вошли в клиническую практику. Однако в отличие от уже установленных внутренних подтипов, основанных на оценке ER, PR и HER-2, иммуногистохимическая идентификация нового низкоклаудинового подтипа РМЖ оказалась связанной с рядом проблем.
Прежде всего, авторы расходятся во мнениях о наборе критериев, что является одним из основных препятствий для иммуногистохимической идентификации данного иммунофенотипа, не говоря уже о возможности валидации суррогатной панели. Так, в иммуногистохимическом исследовании J. Choi и соавт. [20] низкоклаудиновый подтип определялся как подтип тройного негативного рака с низким уровнем экспрессии клаудинов 3, 4, 7, в то время как низкая иммуноэкспрессия E-кадгерина не была строго обязательной. По мнению S. Lu и соавт. [11], экспрессия сразу 5 типов клаудина — 1, 3, 4, 7 и 8 — должна быть снижена или отсутствовать при иммуногистохимическом анализе для присвоения статуса «claudin-low», при этом, по оценкам тех же авторов, 3% опухолей с такой панелью все же имели люминальный фенотип, а 20% были HER-2-позитивными. K. Dias и соавт. [12] на основании результатов крупномасштабного исследования пришли к выводу, что достаточной суррогатной панелью для выявления низкоклаудиновых опухолей будет тройной негативный иммунофенотип в сочетании с низкой экспрессией как минимум любых 2 из 4 маркеров адгезии: клаудинов 3, 4, 7 и E-кадгерина.
Помимо отсутствия унифицированной панели маркеров, иммуногистохимическая идентификация низкоклаудинового фенотипа также осложняется отсутствием стандартизированного подхода к оценке самих клаудинов, учитывающей выраженность и распространенность реакции. A. Jääskeläinen и соавт. [21] использовали определение «claudin-low» для РМЖ, когда любая выраженность белковой экспрессии клаудинов 3 и 4 была зарегистрирована менее чем в 50% злокачественных клеток, а в случае клаудина-7 — менее чем в 5% клеток, в то время как другие авторы использовали иные критерии для оценки тех же типов клаудина при РМЖ. Так, в работе A. Logullo и соавт. [22] для полуколичественного анализа клаудинов 4 и 7 при РМЖ использована шкала в градации 0—3+ по принципу модели HercepTest, предполагающая одновременную оценку интенсивности и полноты мембранного окрашивания и процента окрашенных клеток [22]. A. Katayama и соавт. [23] использовали умножение интенсивности (0—3) на долю окрашенных клеток так, чтобы получить оценку иммуноокрашивания клаудинов в диапазоне от 0 до 9. A. Blanchard и соавт. [24, 25] умножали интенсивность окрашивания (0—3) на процент клаудинположительных клеток (0—100%), чтобы получить балл в диапазоне от 0 до 300. A. Szasz и соавт. [26] для той же цели разработали собственную специальную числовую шкалу от 0 до 11.
Отдельным аспектом иммуногистохимической оценки клаудинов является их субклеточная локализация, которая при малигнизации может отклоняться от типичной для клаудинов мембранной локализации. Так, наряду с мембранной описана также парадоксальная цитоплазматическая и даже ядерная локализация клаудинов (транслокация в цитоплазму и ядро), которая, по свидетельству целого ряда работ, может иметь особую прогностическую значимость. Несмотря на это, предпринимаемые попытки разработать иммуногистохимические суррогаты для РМЖ почти всегда фокусируются на экспрессии мембранных клаудинов. В этом отношении исследование A. Jääskeläinen и соавт. [21] в серии из 197 случаев РМЖ, из которых 119 были тройными негативными, является наиболее показательным, поскольку в нем отдельно оценивалось цитоплазматическое и мембранное окрашивание и были обнаружены совершенно разные корреляции с клинико-патологическими параметрами в зависимости от локализации клаудинов. Так, низкая мембранная экспрессия клаудинов 3, 4 и 7 в совокупности была достоверно связана только с отрицательной реакцией лимфатических узлов, а низкий уровень сочетанной цитоплазматической экспрессии тех же клаудинов коррелировал с более высокой степенью злокачественности, большим размером первичной опухоли и фенотипом, отличным от тройного негативного. Этот «комбинированный» параметр тем не менее не имел прогностического значения по сравнению с прогностической значимостью выраженности отдельных клаудинов, прежде всего, цитоплазматического клаудина 3, высокая экспрессия которого была достоверно связана со всеми видами показателей плохой выживаемости у пациентов с тройным негативным фенотипом, и цитоплазматического клаудина 7, высокий уровень которого указывал на короткую безрецидивную выживаемость в той же группе пациентов. Обращает на себя внимание и тот факт, что высокий, а не низкий уровень каждого из клаудинов обладал статистически подтвержденной прогностической значимостью и был более характерным для трижды негативной группы опухолей [21].
Основываясь на выявленной на транскрипционном уровне взаимосвязи низкой экспрессии клаудинов с активацией генов, характерных для стволовых опухолевых клеток [6—8], были предприняты отдельные попытки дополнить низкоклаудиновую иммуногистохимическую панель соответствующими маркерами. Однако это также пока не привело к желаемому результату. Так, по свидетельству K. Dias и соавт. [12], низкоклаудиновый подтип был значительно более вероятным для экспрессии маркера ALDH1, чем опухоли, не относящиеся к низкоклаудиновым, однако не было найдено достоверной ассоциации между низкой экспрессией клаудинов и иммунофенотипом стволовых клеток CD44+/CD24low/–. Сравнительно недавно A. Logullo и соавт. [22] провели обширное (по числу пациентов и глубине ретроспективы) иммуногистохимическое исследование, где соотнесли статус рецепторов ER, PR и HER-2 с экспрессией клаудинов 4 и 7 и профилем СОК CD44+/24– и определили связь с прогнозом и выживаемостью в 803 случаях инвазивного РМЖ, применив стратегию тканевого микрочипа. По результатам анализа, фенотип CD44+/24– никак не коррелировал с молекулярными подтипами или уровнями клаудинов 4 и 7, а профиль иммуноэкспрессии клаудинов не смог различить пациентов с лучшим или худшим прогнозом и не имел связи с тройным негативным иммунофенотипом. Интересно, что наиболее важным открытием в этом исследовании авторы считают обратную связь между клаудином 4 и экспрессией ER/PR, которая указывает на то, что большинство (71,3%) случаев с негативной экспрессией клаудина 4 на самом деле было сгруппированно среди опухолей люминального A подтипа. Клаудин 4 демонстрировал самую низкую экспрессию в люминальном A, был более выражен при тройном негативном раке и проявлял самую высокую частоту экспрессии в HER-2-позитивном, тогда как окрашивание на клаудин 7 не выявило связи с каким-либо из подтипов РМЖ. По мнению авторов, иммуноэкспрессия клаудинов 4 и 7 как по отдельности, так и в обычном иммуногистохимическом контексте в сочетании с ER, PR и HER-2 не дает дополнительной прогностической информации о подтипах РМЖ и не уточняет типизацию тройного негативного подтипа [22]. Существуют и другие исследования, ставящие под сомнение принадлежность низкоклаудинового иммунофенотипа сугубо тройному негативному подтипу. По данным исследования A. Katayama и соавт. [23] 222 случаев первичного инвазивного РМЖ, включавших 68 тройных негативных, высокие, а не низкие, уровни экспрессии клаудинов 1, 3, 4 и 7 были более частыми в группе тройного негативного РМЖ, чем при других подтипах (11,8% против 0,7%, 26,5% против 2,0%, 48,5% против 11,1% и 32,4% против 8,7% соответственно; p≤0,001).
Действительно, как сочетанная, так и индивидуальная иммуноэкспрессия клаудинов 3, 4 и 7, исходно назначенных для идентификации низкоклаудинового фенотипа РМЖ на основании профиля экспрессии генов, оказалась ограниченной и противоречивой не только в контексте, но и помимо профилирования внутренних подтипов РМЖ. Большинство данных на самом деле свидетельствует о большей частоте высокой белковой экспрессии, в частности клаудинов 4 и 7, которые считаются специфическими для РМЖ и были отмечены в литературе как потенциальные маркеры клинических исходов [24, 27, 28]. A. Szasz и соавт., как и A. Logullo и соавт., свидетельствуют, что клаудин 4 наименее выражен в люминальных подтипах и, наоборот, отличается высокой экспрессией в ER/PR-негативных опухолях [22, 26], а Y. Myal и соавт. [29] даже предложили выделить высококлаудиновый подтип, который включает ER-негативные опухоли, демонстрирующие высокую экспрессию клаудина 4.
В совсем недавней работе C. Fougner и соавт. [30] приводят доказательства, оспаривающие существование низкоклаудинового как отдельного подтипа РМЖ даже на уровне генной экспрессии, применив отчасти противоположный аналитический подход по отношению к оригинально описанному в основополагающей работе J. Herschkowitz и соавт. [3]. Для этого были идентифицированы опухоли с низкой экспрессией клаудинов в трех независимых когортах METABRIC, TCGA-BRCA и Oslo2, включающих случаи РМЖ: 1886, 1082 и 381 соответственно, при использовании того же предиктора для идентификации низкоклаудиновых опухолей, который был описан с оригинальной характеристикой подтипа [30]. Авторы стратифицировали выделенные низкоклаудиновые опухоли по внутреннему подтипу и обнаружили, что различия между низкоклаудиновыми опухолями в целом совпадают с таковыми между подтипами РМЖ почти по всем проанализированным критериям. В частности, было установлено, что частота ER-позитивности различалась между низкоклаудиновыми опухолями, при этом 58% низкоклаудиновых опухолей оказались ER-положительными, указывая на то, что характеристика «claudin-low» опухолей как подгруппы тройного негативного РМЖ в исходном варианте классификации является чрезмерно упрощенной [30]. В данном исследовании также не было найдено никаких доказательств того, что низкоклаудиновый статус повышает опухолевую агрессию и связан с плохими показателями выживаемости при РМЖ [30], в отличие от предыдущих сообщений о низкоклаудиновом подтипе как агрессивном с плохим прогнозом [7, 8]. По мнению C. Fougner и соавт. [30], выделение низкоклаудиновых опухолей в самостоятельную подгруппу РМЖ было связано с недоучтенными ограничениями специфики прогностического экспрессионного профиля PAM50, изначально использованного оригинаторами данного подтипа [3, 7]. Согласно интерпретации C. Fougner и соавт. [30], не существует самостоятельного низкоклаудинового подтипа РМЖ, а скорее, в пределах каждого подтипа имеются опухоли, отличающиеся низкой экспрессией клаудинов в дополнение к своему внутреннему набору биологических критериев. Таким образом, каждый внутренний подтип РМЖ может быть гетерогенным по набору биологических признаков, соответствующих низкоклаудиновому фенотипу.
В совокупности накопленные данные указывают на то, что на сегодняшний день подгруппа опухолей с низкой экспрессией клаудинов может быть достоверно определена только на транскрипционном уровне. Попытки разработать суррогатную панель для иммуногистохимической идентификации низкоклаудинового подтипа РМЖ по аналогии с другими внутренними молекулярными подтипами пока не увенчались успехом. Отсутствие единого мнения в выборе маркеров, а также стандартизированного подхода к их оценке делают иммуногистохимическое профилирование данного подтипа, по меньшей мере, преждевременным. Важно также отметить, что ни один из предложенных иммуногистохимических подходов пока еще не был подтвержден в независимых когортах. Кроме того, недавнее появление доказательств, основанных на анализе генной экспрессии и определяющих низкую регуляцию клаудинов как непрерывную особенность, присутствующую в различной степени во всех внутренних подтипах РМЖ, может сделать иммуногистохимическую идентификацию низкоклаудинового подтипа совершенно недостижимым событием.
Работа выполнена в рамках раздела Государственного задания ИБР РАН 2022 года No. 0088-2021-0017.