Данилова Н.В.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздрава РФ; ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования", Москва

Михайлов И.А.

ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия

Олейникова Н.А.

ФГБОУВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», Москва, Россия

Мальков П.Г.

ГУНУ "Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова"; ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования", Москва

Экспрессия белка LMP-1 в опухолевых клетках и железистом эпителии перитуморальной области при раке желудка

Журнал: Архив патологии. 2019;81(6): 24-33

Просмотров : 108

Загрузок : 8

Как цитировать

Данилова Н. В., Михайлов И. А., Олейникова Н. А., Мальков П. Г. Экспрессия белка LMP-1 в опухолевых клетках и железистом эпителии перитуморальной области при раке желудка. Архив патологии. 2019;81(6):24-33. https://doi.org/10.17116/patol20198106124

Авторы:

Данилова Н.В.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздрава РФ; ГБОУ ДПО "Российская медицинская академия последипломного образования", Москва

Все авторы (4)

Введение

Вирусогенетическая теория возникновения опухолей была предложена акад. Л.А. Зильбером, и основной ее тезис состоял в том, что опухолевая трансформация клеток происходит в результате интеграции вирусной ДНК в геном клетки-хозяина, которая вследствие этого приобретает новые свойства. Л.А. Зильбер также ввел понятие «инфекционные» и «онкогенные» вирусы задолго до открытия большинства из них. Генетический материал онкогенных вирусов имеет высокую степень гомологии с участками ДНК клеток, которые являются мишенями этих вирусов; онкогенные вирусы не приводят к гибели клетки-хозяина и способны к внутриклеточной персистенции [1].

В последующем установлено, что онкогенность вируса определяют транскрипты его генов. Одним из таких транскриптов является латентный мембранный белок (LMP-1) вируса Эпшейна—Барр (EBV), способный встраиваться в мембрану клетки-хозяина и функционировать как псевдорецептор благодаря высокой гомологии с внутриклеточными доменами рецепторов TNF-α, что приводит к нарушениям процессов пролиферации и дифференцировки клеток [2]. Онкогенная роль LMP-1 считается доказанной для EBV-ассоциированных лимфомы Беркитта, лимфомы Ходжкина, экстранодальной NK/T-клеточной лимфомы и др. [3]. Учитывая повсеместное распространение EBV, не исключена онкогенная роль LMP-1 и при других опухолях. Так, в классификации рака желудка был недавно выделен EBV-ассоциированный молекулярный подтип [4].

Рак желудка занимает 3-е место по смертности среди всех онкологических заболеваний в мире и Российской Федерации [5, 6]. Онкогенная роль белка LMP-1 в развитии рака желудка не доказана. Большинство исследований экспрессии LMP-1 при раке желудка было выполнено более 20 лет назад, в ходе их установлено, что LMP-1 экспрессируется в 0—5% случаев [7—11]. Последнее исследование [12] в этой области касается изучения взаимодействия LMP-1-позитивных и LMP-1-негативных клеток на культурах опухолевых клеток (линия AGS). Установлено, что экспрессия LMP-1 изменяет характер межклеточных взаимодействий при раке желудка [12].

Низкий уровень экспрессии LMP-1 при раке желудка ряд авторов [10] связывают с феноменом уклонения клеток от иммунного ответа. Также не исключена иммунологическая толерантность к LMP-1 по аналогии с таковой к поверхностному антигену гепатита B (HBsAg), персистенция которого обнаруживается и при отсутствии вирусной ДНК [13].

Не описана связь экспрессии LMP-1 с некоторыми классическими характеристиками рака желудка (глубина инвазии — T, количество метастазов в регионарных лимфатических узлах — N, наличие отдаленных метастазов — M, клиническая стадия, степень дифференцировки — G, гистологические типы); отсутствуют данные о характере экспрессии LMP-1 в прилежащих к опухоли участках слизистой оболочки обычного строения.

Материал и методы

В исследование включены образцы операционного материала рака желудка от 67 пациентов. Важным критерием отбора парафиновых блоков было наличие в одном кусочке участков опухолевой ткани рака желудка с фрагментами железистого эпителия перитуморальной области. Половозрастные характеристики выборки пациентов представлены в табл. 1, распределение

Таблица 1. Половозрастные характеристики выборки пациентов
пациентов по клиническим стадиям рака желудка — в табл. 2.
Таблица 2. Распределение пациентов по клиническим стадиям рака желудка

Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, для постановки иммуногистохимических реакций использовали первичные мышиные моноклональные антитела к белку LMP-1 (клон CS1−4, «Dako», Дания). Депарафинирование и демаскировку антигенов проводили с помощью буфера Thermo Dewax и HIER BuferL (pH 6,0). Производителем рекомендован буфер с pH 9,0 для депарафинирования и демаскировки антигенов, однако при его использовании наблюдали выраженное фоновое окрашивание, вследствие чего был выбран буфер с pH 6,0. Окраску проводили с помощью иммуностейнера Autostainer 480S («Thermo Fisher Scientific», СШA).

Окрашивание на LMP-1 для всех 67 случаев осуществляли 2 раза. В качестве положительного контроля при каждой постановке реакции использовали образец назофарингеальной карциномы, который был любезно предоставлен профессором А.М. Ковригиной (патологоанатомическое отделение НМИЦ гематологии Минздрава России).

Результаты реакций оценивали с помощью светового микроскопа DM2500 («Leica Microsystems», Германия) двумя независимыми исследователями. Сканер SCN400 и микроскоп DM4000B/DFC495 («Leica Microsystems», Германия) использовали для получения микрофотографий.

Истинной положительной реакцией в эпителиальных клетках считается мембранная или гранулярная цитоплазматическая экспрессия LMP-1 [7, 14].

Использовали оригинальный метод оценки экспрессии LMP-1. Экспрессию в тканевом компартменте (опухолевая ткань или железистый эпителий перитуморальной области) считали положительной, если из выбранных 10 полей зрения при об. ×40 хотя бы в одном соотношение числа клеток с экспрессией LMP-1 и общего числа клеток превышало 10%.

Полученные результаты были сопоставлены с клинико-морфологическими характеристиками рака желудка: гистологический тип по классификации ВОЗ [15]; гистологический тип по классификации по P. Lauren [16, 17]; степень дифференцировки опухоли (G); глубина инвазии (T); количество метастазов в регионарных лимфатических узлах (N); наличие отдаленных метастазов (M); клиническая стадия опухоли; локализация опухоли.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программного пакета Statistica 10 («StatSoft Inc.», США). Для статистической обработки результатов использовали точный критерий Фишера, непараметрический U-критерий Манна—Уитни для попарного сравнения групп опухолей и критерий Краскела—Уоллиса для множественного сравнения.

По характеру экспрессии белка LMP-1 в опухолевой ткани и эпителии перитуморальной области исследуемые случаи были разделены на три группы:

— LMP-1-позитивные опухоли — 9 случаев из 67 (положительное окрашивание опухоли и отсутствие окрашивания эпителия перитуморальной области);

— LMP-1-негативные опухоли — 32 случая из 67 (отрицательное окрашивание опухоли и отсутствие окрашивания эпителия перитуморальной области);

— LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области — 26 случаев из 67 (отрицательное окрашивание опухоли и положительное окрашивание эпителия перитуморальной области) — данная группа описана нами впервые.

Ядерная экспрессия LMP-1 в опухолевых клетках встречалась часто (в 22 случаях; 32,8%). Ранее этот феномен расценивался как ложноположительная реакция вследствие кросс-реактивности антител с другими вирусными белками (EBNA-1, EBNA-2) из-за высокой степени гомологии [11, 14].

Результаты и обсуждение

Для изучения характерных свойств трех выделенных групп результаты оценки экспрессии LMP-1 сопоставляли с клинико-морфологическими характеристиками рака желудка.

Гистологический тип рака желудка оценивали по классификации опухолей пищеварительной системы ВОЗ [15] и классификации P. Lauren [16, 17].

Исследованные случаи рака желудка были разделены на аденокарциномы (AC, ICD-O 8140/3) и перстневидно-клеточные раки (SRC, ICD-O 8490/3), отдельно выделена группа низкодифференцированных аденокарцином с наличием перстневидных клеток (AC-SRC), поскольку перстневидные клетки являются важным прогностическим признаком, влияющим на выживаемость пациентов.

Среди LMP-1-позитивных опухолей выявлено 7 AC и 2 AC-SRC (табл. 3, строки

Таблица 3. Экспрессия LMP-1 в сопоставлении с основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка
№ 1—4; рис. 1, а),
Рис. 1. Экспрессия LMP-1 в сопоставлении с основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка. Распределение: а — по гистологическим типам (классификация ВОЗ); б — по гистологическим типам (по P. Lauren); в — по степеням дифференцировки (G); г — по глубине инвазии (Т); д — по количеству метастазов в регионарных лимфатических узлах (N); е — по наличию отдаленных метастазов (М); ж — по клиническим стадиям; з — по локализации опухоли.
преобладание типа AC было статистически значимо. Это соответствует распространенному мнению ряда авторов о том, что аденокарциномы желудка, характеризующиеся экспрессией вирусных транскриптов, как правило, представляют собой высокодифференцированные аденокарциномы с хорошим прогнозом [4, 18].

Среди LMP-1-негативных опухолей и LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области преобладание ни одного из гистологических типов не было статистически значимо (см. табл. 3, строки № 1—4; см. рис. 1, а).

Структура распределения по гистологическим типам впервые описанной группы LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области соответствует структуре распределения LMP-1-негативных опухолей: среди обеих групп AC-SRC и SRC встречались значительно чаще, чем в группе LMP-1-позитивных опухолей, что косвенно свидетельствует о том, что эта группа имеет большее сродство с группой LMP-1-негативных опухолей, которые ассоциированы с низкой степенью дифференцировки и худшим прогнозом [18].

Классификация рака желудка по P. Lauren 1965 г. [16] включает два гистологических типа — кишечный и диффузный. Опухоли, содержащие как кишечный, так и диффузный компоненты, не редки и до 2010 г. в классификации ВОЗ выделялись в качестве отдельного промежуточного («смешанного») типа [17]. Анализ полученных результатов проводили с учетом этой ранее принятой концепции.

Среди LMP-1-позитивных опухолей и LMP-1-негативных опухолей преобладание опухолей диффузного типа не было статистически значимо (см. табл. 3, строки № 5—8; см. рис. 1, б).

Среди LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области выявлены 4 опухоли кишечного типа, 19 промежуточного типа и 3 диффузного типа (см. табл. 3, строки № 5—8; см. рис. 1, б), преобладание опухолей промежуточного типа было статистически значимо.

Экспрессия LMP-1 при опухолях кишечного, диффузного и промежуточного типов представлена на рис. 2—4.

Рис. 3. Экспрессия LMP-1 в опухолях диффузного типа. а — положительное цитоплазматическое окрашивание в опухоли диффузного типа, инфильтрирующей мышечный слой; в — отрицательная цитоплазматическая реакция в опухоли диффузного типа; д — LMP-1-негативная опухоль диффузного типа и положительная реакция в эпителии перитуморальной области.
Рис. 4. Экспрессия LMP-1 в опухолях промежуточного типа. а — положительное цитоплазматическое окрашивание в опухоли промежуточного типа; в — отрицательная цитоплазматическая реакция в опухоли промежуточного типа; д — положительное цитоплазматическое окрашивание эпителия перитуморальной области, инфильтрированной клетками LMP-1-негативой опухоли промежуточного типа.
Рис. 2. Экспрессия LMP-1 в опухолях кишечного типа. Здесь и на рис. 3 и 4: а, в, д — иммуногистохимическое окрашивание с антителами к LMP-1, об. ×20; б, г, е — окраска гематоксилином и эозином, об. ×20. а — положительное цитоплазматическое окрашивание в опухоли кишечного типа; в — отрицательная цитоплазматическая реакция в опухоли кишечного типа; д — LMP-1-негативная опухоль кишечного типа и положительное цитоплазматическое окрашивание эпителия перитуморальной области (верхний правый угол). Здесь и на рис. 3 и 4: б, г, е — парные обзорные микрофотографии тех же случаев.

Группа LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области выделена впервые и гистологически преимущественно соответствовала промежуточному типу. Опухоли промежуточного типа встречались в группе LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области значительно чаще, чем опухоли диффузного типа в группе LMP-1-негативных опухолей.

Можно предположить, что латентная экспрессия LMP-1 в эпителии перитуморальной области путем неизвестных межклеточных взаимодействий может оказывать влияние на формирование фенотипа прилегающих участков LMP-1-негативной опухоли, но рассуждения по этому поводу должны быть корректными, особенно вследствие убиквитарной персистенции антигенов EBV, роль которых, помимо новообразований, рассматривается также в патогенезе инфекционного мононуклеоза, синдрома Алисы в Стране чудес, острой церебеллярной атаксии у детей, дерматомиозита, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, рассеянного склероза, синдрома хронической усталости и др. [3], однако точные механизмы не изучены.

С точки зрения современных представлений о канцерогенезе вирусные антигены могут оказывать либо прямое онкогенное воздействие, либо выступать в роли фонового или сопутствующего процесса.

При оценке распределения по степени дифференцировки среди LMP-1-позитивных опухолей статистически значимые различия не выявлены (см. табл. 3, строки № 9—13; см. рис. 1, в). Среди LMP-1-негативных опухолей выявлены 14 опухолей G3 и 9 опухолей SRC (см. табл. 3, строки № 9—13; см. рис. 1, в), отличие от групп G1 и G2 было статистически значимым. Среди LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области значимо преобладали опухоли G3 (см. табл. 3, строки № 9—13; см. рис. 1, в).

Глубину инвазии оценивали в соответствии с классификацией TNM (AJCC, 8-е издание [19]). В связи с отсутствием клинических данных по трем исследованным случаям сопоставление экспрессии LMP-1 с клиническими характеристиками рака желудка (TNM и локализация) приведено для 64 случаев. Значимых различий по глубине инвазии не наблюдали (см. табл. 3, строки № 14—20; см. рис. 1, г).

Количество метастазов в регионарных лимфатических узлах оценивали в соответствии с классификацией TNM (AJCC, 8-е издание [19]), однако ни в одной из групп не выявлено статистически значимых различий (см. табл. 3, строки № 21—26; см. рис. 1, д). Распределение экспрессии LMP-1 в зависимости от количества метастазов в регионарных лимфатических узлах оказалось неоднородным, требуется проведение исследования на большей выборке.

Наличие отдаленных метастазов оценивали в соответствии с классификацией TNM (AJCC, 8-е издание [19]), однако ни в одной из групп не выявлено статистически значимых различий (см. табл. 3, строки № 27—29; см. рис. 1, е). Опухоли с отдаленными метастазами преобладали (статистически незначимо) в группе LMP-1-негативных опухолей по сравнению с двумя другими группами, что соответствует распространенному мнению о том, что опухоли желудка, характеризующиеся отсутствием экспрессии вирусных транскриптов, как правило, ассоциированы с большим количеством метастазов и худшим прогнозом [18, 20].

Клиническую стадию определяли в соответствии с классификацией TNM (AJCC, 8-е издание [19]), исходя из совокупности характеристик T, N и М. Опухоли в рамках одной клинической стадии характеризовались высокой неоднородностью; статистически значимых различий между группами опухолей не получено (см. табл. 3, строки № 30—37; см. рис. 1, ж).

LMP-1-негативные опухоли встречали в кардиальном отделе желудка чаще, чем в двух других группах, хотя, по данным литературы [18], эти опухоли чаще являются EBV-ассоциированными в сравнении с другими локализациями. LMP-1-негативные опухоли с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области определяли в теле желудка значительно чаще, чем LMP-1-позитивные опухоли, и чаще характеризовались субтотальным распространением (cм. табл. 3, строки № 38—43; см. рис. 1, з).

Заключение

Предложены новые принципы оценки экспрессии белка LMP-1 вируса Эпштейна—Барр при раке желудка. Показано, что результаты иммуногистохимической реакции с моноклональными антителами к LMP-1 (клон CS1−4) непостоянны, что может быть связано с техническими особенностями, которые пока не определены, поэтому необходимы повторные постановки реакции.

Не обнаружено значимых связей между характеристиками экспрессии LMP-1 и клинико-морфологическими характеристиками рака желудка, что, вероятно, связано с высокой гетерогенностью его молекулярно-генетических свойств.

Не выявлено значимых различий экспрессии LMP-1 в зависимости от гистологического типа по классификации ВОЗ и классификации P. Lauren, однако при выделении промежуточного гистологического типа обнаружено, что большинство этих опухолей являются LMP-1-негативными с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области, что может отражать феномен персистенции антигенов EBV, однако для доказательства наличия латентной EBV-инфекции требуется верификация методом гибридизации in situ. Группа LMP-1-негативных опухолей с экспрессией LMP-1 в эпителии перитуморальной области выделена впервые. Антигены EBV могут либо оказывать прямое онкогенное воздействие, либо выступать в роли фонового или сопутствующего процесса.

Работа выполнена по гос. заданию МГУ им. М.В. Ломоносова и с использованием оборудования, приобретенного по программе развития МГУ им. М.В. Ломоносова до 2020 г.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.В.Д., И.А.М., П.Г.М.

Сбор и обработка материала — Н.В.Д., И.А.М., Н.А.О.

Статистическая обработка данных — И.А.М.

Написание текста — И.А.М., Н.В.Д.

Редактирование — П.Г.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Данилова Н.В. — https://orcid.org/0000-0001-7848-6707; e-mail: ndanilova@mc.msu.ru

Михайлов И.А. — https://orcid.org/0000-0001-8020-369X

Олейникова Н.А. — https://orcid.org/ 0000-0001-8564-8874

Мальков П.Г. — https://orcid.org/0000-0001-5074-3513

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Данилова Н.В., Михайлов И.А., Олейникова Н.А., Мальков П.Г. Экспрессия белка LMP-1 в опухолевых клетках и железистом эпителии перитуморальной области при раке желудка. Архив патологии. 2019;81(6):-33. https://doi.org/10.17116/patol201981061

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail