Занозин А.С.

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Демура Т.А.

Кафедра патологической анатомии им. И.М. Струкова Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова

Колосовский Д.Ю.

ООО «Доктор Колосовский», Москва

Файзуллина Н.М.

ФГБУ "НЦАГиП им. акад. В.И Кулакова" Минздрава России, Москва

Коган Е.А.

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова, Москва

Нарушение рецептивности эндометрия при первичном бесплодии женщин с синдромом недифференцированной дисплазии соединительной ткани и наследственными тромбофилиями

Журнал: Архив патологии. 2016;78(6): 23-29

Просмотров : 227

Загрузок : 6

Как цитировать

Занозин А. С., Демура Т. А., Колосовский Д. Ю., Файзуллина Н. М., Коган Е. А. Нарушение рецептивности эндометрия при первичном бесплодии женщин с синдромом недифференцированной дисплазии соединительной ткани и наследственными тромбофилиями. Архив патологии. 2016;78(6):23-29. https://doi.org/10.17116/patol201678623-29

Авторы:

Занозин А.С.

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Все авторы (5)

Рецептивность эндометрия — это комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с конкретными пространственными и временны́ми константами, определяющими способность эндометрия к имплантации [1, 2]. Согласно данным Е. Norwitz и соавт. [3], лишь около 50—60% всех зачатий может привести к беременности с достижением срока 20 нед и более. При этом 75% потерь беременностей обусловлено нарушениями имплантации, поэтому их клинически невозможно распознать как беременность. В целом каждая 9-я семейная пара в Европе и США имеет потери беременности, обусловленные нарушениями имплантации [4].

Женщины, страдающие наследственными тромбофилиями (НТ) и синдромом недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ), имеют высокий риск первичного и вторичного бесплодия, а также высокий риск неудачных попыток ЭКО, что было подтверждено в ряде работ и связано с нарушениями рецептивности эндометрия [2, 5, 6].

Дисплазия соединительной ткани (ДСТ) — это полиорганная и полисистемная патология с прогредиентным течением, в основе которой лежат дефекты синтеза или катаболизма компонентов внеклеточного матрикса или регуляторов морфогенеза соединительной ткани [2]. Имеется две основные разновидности ДСТ — дифференцированная (дДСТ) и недифференцированная (нДСТ) формы [7]. Генетически гетерогенная группа заболеваний мультифакториальной природы — нДСТ, в основе которых лежат нарушения синтеза и распада внеклеточного матрикса, возникающие под действием неблагоприятных факторов внешней среды у индивидуумов с определенной генетической предрасположенностью уже в периоде раннего эмбриогенеза или постнатально и характеризующиеся нечеткой клинической картиной [2].

Согласно определению ВОЗ и Международного общества по тромбозу и гемостазу, тромбофилия — необычная наклонность к тромбозу с ранним возрастным началом, отягощенностью семейного анамнеза, степенью тяжести тромбоза, непропорциональной известному причинному фактору и эпизодам рецидивов тромбоза [8]. В клинических рекомендациях Американской коллегии торакальных врачей по антитромботической и тромболитической терапии диагноз тромбофилии устанавливается при наличии не менее одного критерия из следующего списка: дефицит антитромбина III, дефицит протеина С и S, резистентность фактора V к активированному протеину С, мутация фактора V Лейдена, мутация протромбина G20210A, гипергомоцистеинемия, гомозиготное носительство термолабильного варианта метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), антифосфолипидных антител или волчаночного антикоагулянта, увеличение активности фактора VIII, а также сниженный уровень протеина Z [8, 9].

НТ и нДСТ нередко являются сочетанной патологией, что обусловлено общностью молекулярно-генетических механизмов развития: во-первых, многие гены, обусловливающие развитие нДСТ и НТ, находятся в соседних локусах: гены PAI-1 α2-цепей коллагена I типа расположены в одном локусе 7q22.1; ген α-цепи коллагена IV типа и гены факторов свертывания VII и X расположены в одном локусе — 13q34; а гены β3-субъединицы ламинина и фактора свертывания V находятся в соседних локусах 1q31 и 1q22 [10]. Также белок PAI-1 играет важную роль в развитии этих синдромов: с одной стороны, ингибирует фибринолиз, с другой — стимулирует процессы фиброза [11, 12]. Однако до сих пор остаются неясными морфологические и молекулярно-генетические особенности эндометрия, в первую очередь его стромы, влияющие на рецептивность эндометрия у пациенток с НТ и нДСТ.

Целью исследования является изучение морфологических и иммунофенотипических особенностей эндометрия у пациенток с первичным бесплодием на фоне НТ и синдрома нДСТ.

Материал и методы

Исследование выполнено на пайпель-биоптатах эндометрия от пациенток (81), разделенных на 4 группы: 1-я группа — 19 пациенток с клиническим диагнозом нДСТ (средний возраст 31,9±4,5 года), 2-я группа — 40 пациенток с клиническим диагнозом НТ (средний возраст 32,6±4,8 года), 3-я группа — 13 пациенток с сочетанием клинических диагнозов нДСТ и НТ (средний возраст 32,3±4,7 года) и 4-я группа, состоящая из 9 пациенток, — группа контроля, здоровые суррогатные матери.

Критерии включения в основные группы: репродуктивный возраст, бесплодие в анамнезе, диагнозы нДСТ либо сочетание этих заболеваний. Критерии исключения: гиперпластические процессы эндометрия, тяжелая сопутствующая патология (ревматические болезни, онкологические заболевания, сахарный диабет). Критерий постановки диагноза нДСТ — набор симптомов, выявляемых при объективном осмотре, в соответствии с рекомендациями Т.И. Кадуриной и соавт. [13]. Диагноз Н.Т. ставился по результатам проведенного ранее генетического исследования на основании клинических рекомендаций Американской коллегии торакальных врачей по антитромботической и тромболитической терапии [8, 9].

От каждой пациентки исследовались пайпель-биоптаты эндометрия, взятые в период «окна имплантации» (6—8-й день после овуляции по данным УЗИ).

Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Приготавливали ступенчатые парафиновые срезы толщиной 4 мкм. Часть срезов окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, толуидиновым синим; другую часть использовали для постановки иммунопероксидазных реакций со следующими первичными антителами: к коллагену I (поликлональные кроличьи антитела, 1:500, «GeneTex», США), коллагену III (поликлональные кроличьи антитела, 1:1000, «GeneTex», США), фибронектину (кроличьи антитела, 1:100, «Dako», Дания), ламинину β2γ1 (мышиные моноклональные антитела, 1:200, «GeneTex», США), MMP-2 (поликлональные кроличьи антитела, 1:200, «Abbiotec», США), MMP-9 (поликлональные кроличьи антитела, 1:200, «Abbiotec», США), к рецепторам эстрогена (ER, клон 1D5, «Dako», Дания, готовый к употреблению), к рецепторам прогестерона (PgR, клон 636, «Dako», Дания, готовый к употреблению), к белку PAI-1 (PAI-1, клон H-135, разведение 1:100, «SantaCruz», США), к белку VEGF-A (разведение 1:100, «Abbiotec», США), к белку LIF (разведение 1:100, «Sigma», Швеция).

Депарафинирование срезов осуществляли в растворе Bioclear («Bio-Optica», Италия). Антигенную демаскировку проводили путем инкубации в 10 мМ цитратном буфере; рН 6,0 («Dako», Дания), при автоматическом нагреве буфера до 96 °C, поддержании этой температуры в течение 20 мин. Ставили положительные и отрицательные контроли. Контрастирование ядер осуществляли раствором гематоксилина Майера (ООО «ЭргоПродакшн», Россия) [14].

Морфометрическое исследование проводили с помощью микроскопа Zeiss Axioplan 2 imaging, оборудованного фотокамерой Zeiss AxioCam Hrc, и программного обеспечения AxioVision v.4.6.2.

Оценку площади очагов склероза при окраске по Ван Гизону и экспрессии маркеров коллагена I, III проводили с помощью морфометрического исследования: оценивали площадь экспрессии программным методом с помощью программного обеспечения AxioVision v.4.6.2.

Оценку степени экспрессии маркеров LIF, PAI-1, VEGF, MMP-2, MMP-9, фибронектина, ламинина осуществляли посредством подсчета окрашенных клеток одного типа. Оценку 0 баллов ставили, если окрашенные клетки отсутствовали, 2 балла — от 0 до 20% включительно окрашенных клеток, 4 балла — от 20 до 40%, 6 баллов — более 40% окрашенных клеток. Для каждой из групп рассчитывали средний балл экспрессии маркеров MMP-2, MMP-9, фибронектина, LIF, PAI-1, VEGF, ламинина и стандартное отклонение.

Оценку экспрессии ER, PgR осуществляли с помощью шкалы Histoscore. Также считали стромальный прогестерон-эстрогеновый индекс (СПЭИ) — отношение экспрессии прогестероновых рецепторов к экспрессии эстрогеновых рецепторов в эндометриальной строме по шкале Histoscore.

Статистическое исследование проводили с помощью пакетов программ IBM SPSS Statistics 22 и MS Excel.

При статистическом исследовании сравнивали средние значения различных величин, для чего использовали непараметрические статистические критерии: Манна—Уитни, Краскалла—Уоллеса, поскольку в группах отсутствовало Гауссовское распределение.

Результаты

Для оценки рецептивности эндометрия морфологическому исследованию подвергали эндометрий в период «окна имплантации». В 4-й группе в 22% случаев обнаружили признаки ранней стадии фазы секреции — в железистом эпителии эндометрия определяется множество базально расположенных вакуолей, при этом апикальный край клеток все еще ровный, строма в структурном отношении имеет сходство с таковой поздней фазы стадии пролиферации. В 78% случаев выявлены изменения эндометрия, характерные для средней стадии фазы секреции — железы извитые с широким просветом, ядра везикулярные, располагались базально, апикальный край клеток неровный с признаками апокринной секреции в просвете желез и образованием пиноподий — микропротрузий диаметром около 6 мкм в апикальной части поверхностного эпителия эндометрия, экспрессирующих на своей поверхности ряд белков, необходимых для адгезии бластоцисты к поверхности эндометрия, а также признаки васкуляризации и отека стромы.

В 1-й группе эндометрий средней стадии секреции был найден в 38% случаев, в остальных 62% — эндометрий стадии ранней секреции.

Во 2-й и 3-й группах в 25 и 37% случаев соответственно были выявлены морфологические признаки стадии пролиферации в эндометрии: железы извитые с митозами, ядра клеток железистого эпителия округлой формы, некоторые с ядрышками, отмечалась тенденция к расположению ядер в базальной части клеток, строма компактная, ядра фибробластоподобных клеток округлой формы, относительно крупные фибробластоподобные клетки располагаются в густой сети ретикулиновых волокон.

При морфологическом исследовании эпителия эндометрия также оценивался процент зрелых пиноподий — булавовидных выростов эпителиоцитов слизистой оболочки матки в поверхностном слое эндометрия. В 1-й группе выявлено в среднем 5% зрелых пиноподий в поверхностном эпителии эндометрия, во 2-й и 3-й — по 1%, в 4-й группе — 13% зрелых пиноподий.

При оценке стромы эндометрия при окраске толуидиновым синим в 1-й и 3-й группах в строме эндометрия выявлены очаги фиолетовой метахромазии — признаки мукоидного набухания. Во 2-й и 3-й группах во всех исследованных случаях выявлены сладж и кровоизлияния в микроциркуляторном русле стромы эндометрия. Микроскопические очаги фибриноидного некроза стромы эндометрия в 1-й группе выявлены в 68% случаев, во 2-й и 3-й группах — во всех исследованных случаях, в группе контроля — лишь в 45% случаев. Очаги склероза, расположенные нередко периваскулярно, выявлены в 25% случаев в 1-й группе, в 53 и 68% случаев во 2-й и 3-й группах соответственно, в группе контроля они выявлены не были. При оценке суммарной площади очагов склероза при окраске пикрофуксином по Ван Гизону в 3-й группе они составляли наибольший процент — в среднем 1,77% от всей площади препарата; в 1-й и 2-й группах он отличался незначительно — 0,85 и 1,05% соответственно, в группе контроля очаги склероза выявлены не были (рис. 1, табл. 1).

Таблица 1. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика очагов склероза в исследуемых группах Примечание. * — р<0,05 по сравнению с другими исследуемыми группами.

Рис. 1. Изменения стромы эндометрия при нДСТ и НТ. а — кровоизлияния и сладж в микрососудах стромы эндометрия, окраска гематоксилином и эозином, ×200; б — мелкие очаги некроза стромы эндометрия, окраска гематоксилином и эозином, ×630; в — очаг склероза стромы эндометрия, окраска гематоксилином и эозином, ×200; г — очаг склероза стромы эндометрия, окраска пикрофуксином по Ван Гизону, ×400.

На основании морфологического исследования получены следующие результаты: 1) в исследуемых группах, особенно в 3-й, замедлены процессы созревания эндометрия, что выражено в более частом выявлении морфологических стадий ранней секреции и пролиферации в период «окна имплантации»; 2) снижение среднего процента зрелых пиноподий в поверхностном эпителии эндометрия в исследуемых группах, особенно во 2-й и 3-й, по сравнению с группой контроля, что вместе с п. 1 говорит о снижении рецептивности эндометрия; 3) в 1-й и 3-й группах — очаги дезорганизации соединительной ткани (мукоидное набухание) стромы эндометрия при окраске толуидиновым синим; 4) в 1-й и 3-й группах — мелкие очаги фибриноидного некроза стромы и очаги склероза стромы эндометрия; 5) в 3-й группе — очаги склероза наибольших размеров, что подтверждается данными морфометрии — наибольшим соотношением между суммарной площадью очагов склероза стромы и общей площадью препарата.

При иммуногистохимическом исследовании рецептивности эндометрия исследовали экспрессию эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, а также изучали соотношение их экспрессии в строме эндометрия. Эстрогеновые рецепторы экспрессировались в ядрах эпителия и стромы эндометрия. Отмечалась различная степень экспрессии этого маркера в ядрах, при этом не выявлено статистически значимых различий в экспрессии между исследуемыми группами. Прогестероновые рецепторы экспрессировались в ядрах эпителия и стромы эндометрия, при этом не выявлено статистически значимых различий в экспрессии между исследуемыми группами. Также отмечалась различная степень экспрессии этого маркера в ядрах.

При анализе средних значений экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в строме эндометрия выявили, что во 2-й и 3-й группах высокий процент (более 65%) пациенток с ненормальным СПЭИ. В группе пациенток с нДСТ этот процент достигал 55 от всех вошедших в группу женщин.

При исследовании маркера рецептивности LIF выявляли его экспрессию в цитоплазме поверхностного и железистого эпителия эндометрия, в пиноподиях и цитоплазме клеток стромы эндометрия, при этом наиболее важной считалась экспрессия LIF в пиноподиях поверхностного эпителия эндометрия. При анализе экспрессии выявили, что в основных группах существенно снижены показатели экспрессии этого маркера в поверхностном эпителии эндометрия, особенно в 1-й и 3-й группах больных. Также у женщин в основных группах повышалась экспрессия маркера в строме, особенно в 3-й группе.

При исследовании маркера PAI-1, играющего важную роль в механизмах гемостаза и фиброгенеза, отмечали его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы и эндотелия сосудов эндометрия. При анализе экспрессии в основных группах выявили резкое статистически достоверное повышение уровня экспрессии маркера в эпителии, эндотелии сосудов и строме, особенно во 2-й группе пациенток, по сравнению с группой контроля.

При исследовании VEGF отмечали его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы эндотелия сосудов эндометрия. При анализе экспрессии VEGF выявили, что синдром нДСТ сопровождается понижением, а НТ — статистически достоверным повышением экспрессии маркера в эпителии, строме и эндотелии сосудов эндометрия по сравнению с группой контроля.

При исследовании ММП-2 и ММП-9 отмечали их экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы, эндотелия сосудов эндометрия. Стромальная экспрессия ММП-2 в исследуемых группах, особенно в 3-й, снижена по сравнению с группой контроля, при этом при оценке экспрессии ММП-9 статистически значимых различий выявлено не было.

При исследовании ламинина отмечали его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы эндотелия сосудов эндометрия. При исследовании фибронектина отмечали его экспрессию в цитоплазме клеток стромы, эндотелия сосудов эндометрия. Выявлено снижение эпителиальной экспрессии ламинина в 1-й и 3-й группах, экспрессия фибронектина была одинаковой во всех исследуемых группах (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительная оценка среднего балла экспрессии молекулярных маркеров в эндометрии Примечание. * — p<0,05 по сравнению с 1-й и 3-й группой; ** — p<0,05 по сравнению с 3-й и 4-й группой; *** — p<0,05 по сравнению с остальными группами.

При исследовании коллагена I и III типов отмечали их экспрессию в волокнистом компоненте стромы и очагов склероза эндометрия. Выявлено, что экспрессия коллагена I типа в волокнистом компоненте стромы была одинаково низкой во всех четырех группах. В 4-й группе отмечалась выраженная экспрессия коллагена III типа в волокнистом компоненте стромы, при этом в 1-й и 2-й группах она слабее, чем в группе контроля, а в 3-й группе наиболее слабая. Также оценивали соотношение площадей экспрессии коллагенов I и III типов в очагах склероза — во 2-й группе среднее соотношение равно 0,896, в 1-й и 3-й группах — 0,623 и 0,661 соответственно, т. е. содержание коллагена III типа в очагах склероза было наибольшим при нДСТ и сочетании нДСТ + НТ (см. табл. 1, рис. 2).

Рис. 2. Экспрессия коллагенов I и III типов в очагах склероза в различных группах. Иммунопероксидазный метод, ×400. а — коллаген I типа, 2-я группа; б — коллаген III типа, 2-я группа; в — коллаген I типа, 3-я группа; г — коллаген III типа, 3-я группа.

На основании результатов иммуногистохимического исследования выявлены следующие результаты: 1) в исследуемых группах снижены иммуногистохимические показатели рецептивности эндометрия (СПЭИ, эпителиальная экспрессия LIF); 2) анализ экспрессии PAI-1 и VEGF показал увеличенную вероятность тромбоза и склероза стромы эндометрия в исследуемых группах, при этом в группах с НТ ангиогенез усиливается, а в группах с нДСТ, наоборот, что свидетельствует в свою очередь о снижении трофики стромы эндометрия при нДСТ; 3) анализ экспрессии матриксных металлопротеиназ, фибронектина и ламинина показал, что при нДСТ и НТ замедлены процессы созревания эндометрия и ухудшены условия для имплантации бластоцисты; 4) анализ экспрессии коллагенов I, III типов показал замедление созревания стромы эндометрия в ходе менструального цикла, а также ремоделирования эндометриальной стромы в исследуемых группах.

Обсуждение

В результате исследования уточнен морфологический субстрат нарушений эндометрия при нДСТ и Н.Т. Изменения фазы менструального цикла, частота выявления дисциркуляторных расстройств и очагов склероза в строме эндометрия, изменения числа зрелых пиноподий и других морфологических особенностей, влияющих на рецептивность эндометрия, сопоставимы с данными полученными в нашем предыдущем исследовании [15]. Уточнены данные по экспрессии VEGF: в настоящем исследовании несколько изменен состав группы пациенток с диагнозом нДСТ — выше средний балл выраженности признаков нДСТ по Т.И. Кадуриной по сравнению с предыдущим исследованием, поэтому получены более четкие результаты — статистически значимое снижение экспрессии VEGF при нДСТ и ее статистически значимое повышение при Н.Т. Уровень экспрессии VEGF при сочетании патологий сопоставим с контролем, поскольку действия нДСТ и НТ уравновешивают друг друга.

Очаги склероза, по нашему мнению, являются результатом рубцевания мелких очагов некроза. Эти очаги некроза имеют двоякую природу: при нДСТ они являются проявлением процессов дезорганизации соединительной ткани (фибриноидный некроз), в то время как при НТ — следствием микроинфарктов.

На основании данных литературы, предыдущего и настоящего исследований сформирована схема патогенеза нарушений рецептивности эндометрия, представленная на рис. 3.

Рис. 3. Механизмы нарушения рецептивности эндометрия у пациенток с нДСТ и НТ.

Заключение

Синдромы нДСТ и НТ, и особенно их сочетание, могут являться факторами риска развития первичного бесплодия у женщин в результате нарушения рецептивности эндометрия. При синдроме нДСТ существенно замедляются процессы ремоделирования соединительной ткани, что может приводить к усилению процессов склероза эндометриальной стромы, снижению рецептивности эндометрия и бесплодию. Установлено, что наиболее выраженные изменения морфологических и иммунофенотипических характеристик развиваются при нДСТ + Н.Т. Полученные данные могут быть использованы для прогноза и разработки новых методов лечения бесплодия у пациенток с нДСТ + НТ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: З.А.С., К.Е.А.

Сбор и обработка материала: З.А.С., Д.Т.А., К.Д.Ю., Ф.Н.М.

Статистическая обработка: З.А.С.

Написание текста: З.А.С.

Редактирование: К.Е.А.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail