Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Аллина Д.О.

ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования»

Кекеева Т.В.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздрава России

Москвина Л.В.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздрава России

Шикеева А.А.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздрава России

Андреева Ю.Ю.

ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России

Завалишина Л.Э.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздравсоцразвития России

Франк Г.А.

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий, Москва

Диагностическая значимость оценки экспрессии ERG в аденокарциноме предстательной железы и простатической интраэпителиальной неоплазии высокой степени

Журнал: Архив патологии. 2015;77(5): 36‑42

Просмотров : 204

Загрузок : 1

Как цитировать

Аллина Д.О., Кекеева Т.В., Москвина Л.В., Шикеева А.А., Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э., Франк Г.А. Диагностическая значимость оценки экспрессии ERG в аденокарциноме предстательной железы и простатической интраэпителиальной неоплазии высокой степени. Архив патологии. 2015;77(5):36‑42.
Allina DO, Kekeeva TV, Moskvina LV, Shikeeva AA, Andreeva YuYu, Zavalishina LÉ, Frank GA. Diagnostic value of estimation of ERG expression in prostate adenocarcinoma and high-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Arkhiv Patologii. 2015;77(5):36‑42. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/patol201577536-42

Авторы:

Аллина Д.О.

ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования»

Все авторы (7)

Рак предстательной железы (РПЖ) занимает второе место в структуре онкологической заболеваемости среди мужчин и пятое место в структуре онкологической смертности. В 2012 г. число впервые диагностированных случаев по всему миру составило 1,1 млн и представляло собой 15% всех впервые выявленных злокачественных новообразований у мужчин [1]. Золотым стандартом диагностики является патологоанатомическое исследование биопсийного материала. Тем не менее существует ряд диагностических трудностей, наибольшую из которых представляет дифференциальный диагноз предракового процесса — простатической интраэпителиальной неоплазии высокой степени (вПИН) — с доброкачественными и злокачественными состояниями, способными ее имитировать, в частности с внутрипротоковой карциномой и атипическими крибриформными поражениями. Согласно исследованию D. Bostwick и J. Ma, гипердиагностика вПИН оставляет 23,9% [2].

Другими не менее важными проблемами в диагностике новообразований предстательной железы являются оценка агрессивности опухоли и определение прогноза заболевания. По результатам многих исследований, к прогностическим факторам при аденокарциноме предстательной железы относят клиническую стадию, в том числе местную распространенность процесса (наличие инвазии за пределы капсулы или в семенные пузырьки), размер опухолевого узла (узлов), степень дифференцировки опухоли по шкале Глисона и уровень простатического специфического антигена (ПСА) в сыворотке крови [3—10]. Ни один из параметров не является абсолютно достаточным, подход к оценке прогноза должен быть комплексным.

Накопленные к настоящему моменту данные генетического и протеомного анализа неоплазий в предстательной железе свидетельствуют в пользу связи канцерогенеза с прогрессирующим накоплением аномалий фенотипа и генотипа, что открывает новые дифференциально-диагностические возможности. Особенностью канцерогенеза в предстательной железе является образование химерных онкогенов, приводящих к активации факторов транскрипции семейства ETS. Простатспецифические промоторные элементы химерных генов TMPRSS2/ETS обеспечивают высокую стойкую экспрессию онкогенов, запуская процессы пролиферации и трансформации клеток в предстательной железе. Конечным результатом всех перестроек ETS является аномальная гиперэкспрессия измененных вариантов транскрипционных факторов. Наиболее частым вариантом (в 50—60%) является слияние TMPRSS2 с расположенным рядом геном ERG4 [11, 12]. Исследования S. Tomlins и соавт. [13] показали, что в 95% случаев гиперэкспрессия ERG4 ассоциирована с наличием химерного гена TMPRSS2/ERG4. В результате слияния 1 экзона TMPRSS2 и 3’-конца ERG4 образуется химерный ген, который после альтернативного сплайсинга дает 8 вариантов химерных транскриптов, наиболее частым (86%) является вариант 1 экзон TMPRSS2 — 4 экзона ERG4. Данное химерное событие, приводящее к гиперэкспрессии измененного белка ERG, можно наблюдать с помощью иммуногистохимического метода наравне с анализом химерного транскрипта методом ОТ-ПЦР.

Целью работы являются оценка диагностической и прогностической значимости анализа экспрессии ERG, а также анализ химерного транскрипта TMPRSS2/ERG в неоплазиях предстательной железы.

Материал и методы

За период с 2011 по 2012 г. последовательно отобраны 100 пациентов с раком предстательной железы, перенесших радикальную простатэктомию. Средний возраст пациентов составил 62 года (от 41 года до 76 лет). Наличие в образцах аденокарциномы и вПИН подтверждалось иммуногистохимическими реакциями с антителами P504S и 34βE12 на серийных срезах. Анализ экспрессии ERG проводился иммуногистохимическим методом на тех же сериях срезов. В качестве морфологических факторов прогноза опухоли выбраны размер и распространенность опухоли (pT), наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах и степень дифференцировки по шкале Глисона.

Иммуногистохимическое исследование. С выбранных блоков (100 наблюдений) изготавливали срезы толщиной 3 мкм и монтировали на высокоадгезивные стекла (Superfrost plus «Thermo Scientific»). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов проводили при помощи специализированной системы EnVision Flex («Dako», Дания) по стандартному протоколу в модуле предобработки (РТ-Module) к автостейнеру Autosteiner Plus («Dako», Дания). Постановку иммуногистохимических реакций осуществляли в автоматическом режиме с помощью автостейнера Autosteiner Plus («Dako»). В качестве системы детекции использовали набор EnVision Flex («Dako», Дания) с DAB-хромогеном. В каждой серии препаратов присутствовал соответствующий положительный и отрицательный контроль. В качестве первичных антител использовали моноклональные кроличьи антитела в готовом разведении к белку ERG, клон EP111 Flex («Dako», Дания), к белку P504S, клон 13H4 Flex («Dako», Дания) и моноклональные мышиные антитела к цитокератинам высокой молекулярной массы, клон 34βE12 Flex («Dako», Дания). Результаты реакции экспрессии P504S и 34βE12 оценивали качественно, ERG (маркер ядерной локализации) — в процентах окрашенных опухолевых клеток. Критерием гиперэкспрессии выбрано положительное окрашивание 1% и более клеток аденокарциномы или вПИН.

Оценку статистической значимости результатов исследования выполняли методом точного теста Фишера и χ2. Уровень значимости (р) приняли равным 0,05.

Анализ хромосомных перестроек. По результатам иммуногистохимического исследования отобрано по 15 образцов с выраженной гиперэкспрессией ERG и с достоверным ее отсутствием в опухолевой ткани. Анализ химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 проводили на соседних блоках, отобранных по принципу наличия в блоке не менее 40% опухолевой ткани. РНК из парафиновых блоков выделяли с использованием набора RNeasy FFPE Kit («Qiagen», Германия) по соответствующему фирменному протоколу. Обратную транскрипцию РНК проводили методом случайного праймирования с использованием High-Capacity cDNA Archive kit («Applied Biosystems», США) по протоколу фирмы-производителя в термоциклере («ДНК-технология», Россия) по следующей температурной схеме: 60 °C — 20 мин, 37 °C — 120 мин. Образцы кДНК хранили при температуре –20 °С.

Перед анализом экспрессии целостность и количество выделенной РНК оценивали по экспрессии гена GAPD. Анализ химерных генов TMPRSS/ERG осуществляли с праймерами, последовательность которых описана ранее [14]. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1—2 ед. Taq-полимеразы, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМ MgCl2. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95 °C в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95 °C — 30 с, отжиг и элонгация при 60 °C — 2 мин 30 с. Продукты ПЦР разделяли в 6% денатурирующем полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра. Секвенирование осуществляли по протоколам ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits («Applied Biosystems», США). Анализ хроматограмм секвенированных последовательностей проводили с помощью программы Chromas. Компьютерный анализ кДНК проводили с использованием баз данных Blast и Blat.

Результаты и обсуждение

Экспрессия ERG отмечена в 46% аденокарцином и 26% вПИН. Следует отметить, что во всех наблюдениях ERG-положительной вПИН экспрессия белка выявлена в структурах, расположенных вблизи аденокарциномы (рис. 1). У 8 (8%) пациентов отмечена гетерогенная экспрессия ERG: выраженная экспрессия в одних участках сочеталась с полным ее отсутствием в других участках опухоли (рис. 2). Клинико-морфологические характеристики и экспрессия ERG в новообразованиях представлены в таблице.

Клинико-морфологические характеристики и экспрессия ERG Примечание. * — опухоли без метастазов в регионарных лимфатических узлах; ** — с метастазами в регионарных лимфатических узлах.

Рис. 1. Положительная экспрессия ERG в аденокарциноме и прилежащих очагах вПИН. Наличие опухоли подтверждено экспрессией P504S и отсутствием 34βЕ12, вПИН — экспрессией P504S при сохраненной 34βЕ12. ×100.

Рис. 2. Гетерогенная экспрессия ERG в аденокарциноме предстательной железы. Синим выделены очаги аденокарциномы с отрицательной экспрессией ERG, красным — с положительной. ×20.

При оценке зависимости экспрессии ERG и морфологических факторов прогноза отмечено равномерное распределение EGR+— и ERG-опухолей по стадии процесса и распространенности первичной опухоли (рТ). По данным некоторых авторов [15], экспрессия ERG ассоциирована с более агрессивным ее течением: наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах и большим объемом поражения. В нашей выборке различия между группами по данным признакам оказались статистически незначимыми (p=0,2 и p=0,12 соответственно), прогностическое значение экспрессии ERG на текущем этапе исследования выявить не удалось.

Оценка взаимосвязи экспрессии ERG и степени дифференцировки опухоли оказалась невозможной в связи с небольшим количеством наблюдений низкодифференцированной аденокарциномы.

Анализ химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4. Частота перестройки TMPRSS2/ERG4 в образцах РПЖ составила 57% (17/30) (рис. 3). Подлинность химерного гена TMPRSS2/ERG4 подтверждена секвенированием исследуемого фрагмента кДНК (рис. 4). При этом перестройка обнаружена во всех 15 случаях с наличием гиперэкспрессии ERG в опухоли и в 2 случаях с отсутствием гиперэкспрессии. В двух случаях с несовпадающими результатами при повторном пересмотре препаратов предположили, что в связи с мультицентрическим характером роста опухоли в образцах для иммуногистохимического анализа и для ПЦР оказались разные очаги опухоли, при этом в одном случае с одинаковой градацией по шкале Глисона, в другом — с различной. Для подтверждения гипотезы о причине несоответствия результатов повторно проведено иммуногистохимическое исследование на срезах блоков, с которых проводилось выделение РНК для ПЦР, в ходе которого выявлена выраженная экспрессия ERG в анализируемых образцах.

Рис. 3. Анализ экспрессии TMPRSS2/ERG4 в образцах РПЖ. М — маркер молекулярной массы; К — отрицательный контроль; дорожки 2, 3 — наличие химерного транскрипта; 1, 2, 3 — наличие транскрипта B2M.

Рис. 4. Результаты секвенирования химерного гена TMPRSS2/ERG4.

Атипические крибриформные поражения и концепция внутрипротоковой карциномы. Большие диагностические трудности вызывают атипические крибриформные поражения предстательной железы — крибриформные железы, выстланные люминальным эпителием с цитологическими признаками злокачественности и сохранением базального слоя. Подобные структуры могут представлять вПИН или внутрипротоковую (неинвазивную) карциному, в большинстве случаев ассоциированную с агрессивным вариантом инвазивной аденокарциномы предстательной железы. Термин «внутрипротоковая карцинома» впервые введен в 1973 г. для обозначения гетерогенной группы, включающей уротелиальную, плоскоклеточную, протоковую и ацинарную аденокарциному, распространяющуюся по просвету протоков и ацинусов.

Впервые вопросами внутрипротокового распространения интенсивно занялась группа ученых под руководством J. Kovi. Внутрипротоковый рост обнаружен ими в 48% аденокарцином предстательной железы, что было расценено как возможность опухоли к внутрипротоковому распространению с вытеснением нормального эпителия в прилежащих доброкачественных структурах при сохранении общей структуры пораженных протоков [16]. Позднее идея была развита J. McNeal и C. Yemoto, отметившими, что внутрипротоковая карцинома чаще всего ассоциирована с инвазивной аденокарциномой с градацией по шкале Глисона 4 балла, а также экстракапсулярным распространением опухоли, с выраженной периневральной инвазией, наличием метастазов в лимфатических узлах и высокой частотой рецидивов, при этом редко обнаруживалась в опухолях небольшого объема (менее 2 мл), на основании чего высказано предположение, что внутрипротоковая аденокарцинома является формой распространения опухоли, а не предопухолевым поражением [17]. Позднее R. Cohen и соавт. [18] предложили большие и малые морфологические критерии дифференциальной диагностики внутрипротоковой аденокарциномы и вПИН. Пять больших критериев присутствуют, как правило, всегда: 1 — большой калибр желез, более чем в 2 раза превосходящий диаметр нормальных желез периферической зоны, 2 — сохранение слоя базальных клеток, 3 — клеточная атипия, 4 — экспансивный рост клеточных масс в просвет ацинуса, 5 — комедонекроз (присутствует не всегда). К малым критериям относятся: 1 — железы с ветвлением прямоугольной формы или 2 — железы c ровными, округлыми границами, 3 — наличие двух популяций клеток: вытянутые полиморфные клетки с низкой митотической активностью, не экспрессирующие ПСА, — по внешнему периметру, мономорфные клетки кубической формы без признаков митотической активности, с обильной цитоплазмой, содержащей большое количество ПСА — по внутреннему периметру.

В настоящем исследовании во всех 6 случаях с наличием структур внутрипротоковой карциномы отмечена близость их расположения к инвазивной ацинарной аденокарциноме. При этом во всех данных структурах отмечена выраженная экспрессия ERG (рис. 5). Таким образом, определение экспрессии ERG может быть рекомендовано при наличии изолированных атипических крибриформных поражений в игольных биоптатах.

Рис. 5. Инвазивная крибриформная аденокарцинома предстательной железы 4-й градации по Глисону и внутрипротоковая аденокарцинома. ×40.

Заключение

В результате проведенного исследования было отмечено, что относительно низкая частота ERG-положительной вПИН свидетельствует в пользу ограниченной роли данного маркера в дифференциальном диагнозе между вПИН и имитирующими ее доброкачественны-ми процессами. Экспрессия ERG в вПИН вблизи рака служит свидетельством образования химерного гена TMPRSS2/ERG на раннем этапе канцерогенеза и подтверждает теорию опухолевого поля. Наличие ERG+— и ERG-паттернов в пределах одной опухоли подтверждает мультицентрический рост аденокарциномы предстательной железы, объясняет высокую частоту расхождений клинической и патологоанатомической стадии, различия в определении степени дифференцировки опухоли по результатам пункционной биопсии и радикальной простатэктомии. Согласованность результатов иммуногистохимического анализа и ОТ-ПЦР позволяет использовать иммуногистохимический метод в качестве альтернативы молекулярно-генетическим методам в клинической практике.

Относительно невысокая частота ERG+-карцином и низкая ERG+ вПИН не позволяет изолированно использовать ERG как маркер дифференциальной диагностики. Панель ERG, P504S и 34βE12 может быть использована в дифференциальной диагностике вПИН и внутрипротоковой карциномы.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 15−04−03629 а.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Ю.Ю.А., Л.Э.З., Г. А.Ф.

Сбор и обработка материала: Д.О.А., Ю.Ю.А., Т.В.К., А.А.Ш.

Статистическая обработка: Д.О.А., Л.В.М.

Написание текста: Д.О.А., Т.В.К.

Редактирование: Л.В.М., Ю.Ю.А., Л.Э.З., Г. А.Ф.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail