Основными патоморфологическими признаками болезни Паркинсона (БП) служат дегенерация нейронов черной субстанции среднего мозга и наличие внутриклеточных белковых включений — телец Леви (ТЛ). Ключевым, но не единственным их компонентом является белок α-синуклеин (α-Syn), функцию которого связывают с синаптической передачей [1, 2]. По современным представлениям, токсичные фибриллярные формы и агрегаты α-Syn ответственны за гибель нейронов при БП [1, 2]. Синуклеинпозитивные включения обнаруживают также при нормальном старении и нейродегенеративной патологии — мультисистемной атрофии, деменции с ТЛ, и в каждом из этих случаев их структура и локализация имеют свои особенности [1, 2]. В эксперименте образование агрегатов α-Syn показано при повреждении убиквитин-протеасомной системы, дисфункции митохондрий, избыточной экспрессии α-Syn [1], однако их структура отличается от наблюдаемой при БП [3].

Белковые агрегаты при БП выявляются различными методами, в том числе импрегнацией серебром и окрашиванием тиофлавином, однако более специфична иммуногистохимическая реакция на α-Syn [4]. В соответствии с формой и локализацией ТЛ выделяют округлые белковые агрегаты в перикарионах и отростках нейронов, а также вытянутые веретеноподобные включения и деформированные отростки (нейриты Леви). Кроме того, различают ТЛ и бледные тельца — последние эозином не окрашиваются, а в ТЛ эозином окрашивается только ядро [3, 4].

При электронно-микроскопическом исследовании в ТЛ обнаруживают наружный радиально организованный фибриллярный слой и более плотное гранулярное ядро, причем наружный слой ТЛ интенсивно окрашивается на α-Syn, а ядро — на убиквитин [3, 4]. Методом инфракрасной Фурье-спектроскопии показано, что по сравнению с периферической частью ядро ТЛ содержит больше белков с β-структурой и более плотную липидную составляющую [5]. Несмотря на то что морфогенез ТЛ изучен слабо, предполагают, что бледные тельца и нейриты Леви являются их предшественниками [6, 7].

Совершенствование методов обнаружения агрегатов α-Syn важно для патоморфологической диагностики БП, в том числе прижизненной, основанной на их выявлении в структурах периферической нервной системы в биопсийном материале [8]. В настоящее время растет интерес к методам интерференционной микроскопии, в связи с тем что современные алгоритмы количественной фазовой микроскопии [9, 10] позволяют не только выявлять клеточные структуры без окрашивания, но и определять для каждой точки изображения оптическую разность хода, которая пропорциональна сухой массе вещества и содержанию белка в клетке [11]. Показано, что анализ фазовых изображений информативен при оценке патологических изменений в тканях [9], в том числе для выявления агрегатов β-амилоида при моделировании болезни Альцгеймера [12]. Хотя в ранних работах отмечены особенности ТЛ при использовании фазового контраста [13], данных об их исследовании методом интерферометрии в доступной литературе мы не обнаружили.

Несмотря на расширяющиеся методические возможности, существующая классификация гистопатологических изменений в структурах мозга при БП [14] не учитывает количественные характеристики белковых агрегатов и особенности их структуры. Комплексный анализ строения ТЛ может служить основой для разработки новых подходов к оценке выраженности и определению стадий нейродегенеративного процесса при БП и других синуклеинопатиях.

Цель исследования — количественно оценить морфохимические характеристики ТЛ, выявляемых в черном веществе головного мозга при болезни Паркинсона.

Использовали образцы среднего мозга умерших от интеркуррентных заболеваний с диагнозом «БП, 3-я стадия по шкале Хен—Яра»: женщины 47 лет (смешанная форма) и 2 мужчин 59 лет (дрожательно-ригидная форма) и 70 лет (смешанная форма), средняя продолжительность заболевания составила 7 лет. Аутопсийный материал получен из архива лаборатории патологической анатомии с прозектурой ФГБНУ НЦН. Фиксированные в 4% формалине образцы мозга проводили через изопропанол и заливали в парафин. Фронтальные срезы в области черной субстанции толщиной 10 мкм готовили на микротоме Leica SR2000 и раскладывали на покрытые желатином стекла.

Для выявления α-Syn использовали кроличьи поликлональные антитела («Sigma», 1:250), демаскировку антигенов проводили в муравьиной кислоте 10 мин. Кроме того, исследовали локализацию белка нейрофиламентов (антитела мыши к легкой цепи L-NF, «Dako», 2F11, 1:100) и белка синаптических везикул синаптофизина (антитела мыши, «Dako», SY38 1:100). Иммуноферментную реакцию проводили с биотинилированными антителами козы к иммуноглобулинам кролика и экстравидинпероксидазой (набор EXTRA3-KIT, «Sigma») с хромогеном SigmaFast (3,3-диаминобензидин c CoCl₂), согласно рекомендациям производителя. Для иммунофлюоресцентной детекции применяли вторичные козьи (меченные флюорохромом CF488) или ослиные (меченные флюорохромом CF555) антитела («Sigma», 1:200). Часть препаратов окрашивали гематоксилином и эозином по Майеру (Biovitrum). Препараты исследовали под микроскопом Nikon Eclipse NiU (Япония), оснащенным камерой Nikon DS-Qi. Морфометрически синуклеин-позитивные агрегаты оценивали с помощью программы ImageJ не менее чем на 10 срезах и в 50 полях зрения (увеличение объектива 40) для каждого случая, используя для их выделения локальную пороговую сегментацию. Синуклеин-позитивные включения классифицировали при помощи иерархического кластерного анализа методом k-средних. Различия соотношений разных типов агрегатов оценивали при помощи критерия χ².

Интерферометрию проводили на микроскопе Бинам Л211 (ЛОМО, Россия) с источником света на основе зеленого светодиода (10 Вт), используя светофильтр (λ 525 нм). Схема Жамена—Лебедева, лежащая в основе устройства микроскопа, и его применение для подобных задач описаны ранее [11]. Срезы заключали в среду FluoroShield («Fisher Scientific», показатель преломления n_d=1,364) под покровные стекла. Для анализа выбирали округлые α-Syn-позитивные включения (отмечая их координаты под флюоресцентным микроскопом) вне скоплений гранул меланина, искажающих измерения. Интерферометрировали участки, свободные от переналожения изображений, при увеличении объектива в 40 раз. Интерференционную картину регистрировали с помощью монохромной цифровой ПЗС-камеры c разрешением 5 Mpx («Moticam», Китай). Анализ проводили методом интерферометрии фазового сдвига – смещение фазы объектом вычисляли по алгоритму Карре из четырех изображений, регистрируемых при вращении анализатора с шагом фазы π/2 [10]. Обработку интерферограмм выполняли в программе IDEA [15]. Статистический анализ выполняли в программе Statistica 6.0.

Во всех исследованных образцах обнаружены многочисленные α-Syn-позитивные включения, которые локализовались как в телах нейронов, так и в нейропиле в виде аксональных агрегатов и вытянутых, деформированных нейритов Леви (см. рис. 1, б,

Морфометрия иммунофлюоресцентных препаратов показала, что площадь α-Syn-позитивных включений, учитывая аксональные агрегаты, в среднем равнялась 56,7±2,8 мкм² , а их эквивалентный диаметр составлял от 4 до 25 мкм. По параметрам формы, используя кластерный анализ, α-Syn-позитивные включения разделили на группы (см. таблицу):

Не все агрегаты были окрашены на α-Syn однородно, часть из них имела слоистую структуру. В 1-й и 2-й группах в 46% случаев выявляли интенсивно окрашенный на α-Syn наружный слой, имевший вид кольца, а центральная их часть на α-Syn окрашивалась слабо (рис. 2, а).

Иммуноокрашивание на белок нейрофиламентов наблюдали в большинстве α-Syn-позитивных агрегатов, однако его отчетливую концентрическую локализацию (см. рис. 2, а) отмечали только в 30,4% из них, определенных нами как «зрелые» Т.Л. При двойном выявлении α-Syn и синаптофизина последний определяли во всех ТЛ, хотя в большинстве случаев окрашивание было слабовыраженным. Сравнение интенсивности иммунофлюоресцентного окрашивания на α-Syn, белок нейрофиламентов и синаптофизин показало, что пик интенсивности окрашивания на нейрофиламенты смещен к центру ТЛ (см. рис. 2, а), а локализация синаптофизина и α-Syn полностью совпадает (см. рис. 2, б). Методом интерферометрии обнаружили, что «зрелые» ТЛ имеют высокое значение оптической разности хода в центре в противоположность снижению интенсивности иммуноокрашивания на α-Syn (см. рис. 2, в). Среднее значение разности фазы для зрелых ТЛ (n=25) составило 2,2±0,11 рад, что статистически значимо выше, чем для участков нейропиля без выявленных агрегатов α-Syn (1,1±0,05 рад).

Проведенная работа показала морфохимическую неоднородность ТЛ и продемонстрировала возможности анализа их структуры. Согласно данным литературы [16—18], в ТЛ иммуногистохимичеcкими методами обнаруживают не менее 70 различных белков, в том числе синаптофизин и белки нейрофиламентов. Выявленные в нашей работе особенности послойной организации ТЛ согласуются с исследованиями Т. Kanazawa и соавт. [7, 19], выполненными методом конфокальной микроскопии. По сравнению с указанной работой, демонстрирующей локализацию тяжелой субъединицы нейрофиламентов в фосфорилированной форме во внешних слоях ТЛ, мы отметили не только совместную локализацию нейрофиламентов и α-Syn, но и наибольшую интенсивность окрашивания ближе к центральной части Т.Л. Эти результаты свидетельствуют о неоднородном распределении субъединиц нейрофиламентов в Т.Л. Распределение окрашивания на нейрофиламенты в «зрелых» ТЛ в форме кольца отмечено и другими авторами, однако часть ТЛ, по-видимому, находящихся на более ранних стадиях уплотнения структуры, имеет дисковидное окрашивание [20]. В целом агрегация белков цитоскелета в ТЛ, очевидно, вызывает нарушение структуры аксонов, что приводит к синаптической дисфункции [18]. В отличие от нейрофиламентов локализация синаптофизина в ТЛ полностью соответствовала распределению α-Syn, что указывает на включение α-Syn в ТЛ в ассоциации с синаптическими везикулами, а также на нарушение везикулярного транспорта при БП.

Выявленное возрастание значений разности фазы в ядрах ТЛ согласуется с наличием в них плотной липидной и белковой составляющей, образованной фрагментами везикулярных мембран, лизосом и митохондрий [16]. При этом снижение иммуноокрашивания в центральной части ТЛ, по-видимому, вызвано уменьшением доступности эпитопов, выявляемых белков для антител, в связи с изменением их пространственной структуры, фосфорилирования или полиубиквитинилирования [16] и в свою очередь может нести информацию о степени зрелости Т.Л. Вероятно, уплотнение диффузных белковых агрегатов и бледных телец со временем приводит к формированию «классических» ТЛ со слоистой структурой [6, 7]. Как показало наше исследование, наиболее информативным для описания структуры ТЛ является двойное окрашивание на нейрофиламенты и α-Syn в сочетании с морфометрическим анализом, а интерференционная микроскопия может быть использована в качестве дополнительного метода, позволяющего оценить плотность центральной части ТЛ.

Таким образом, комплексное морфохимическое исследование структуры синуклеин-позитивных включений при болезни Паркинсона выявило различия телец Леви по форме и структуре, что может быть связано с разными этапами их формирования. Локализация белка нейрофиламентов и синаптофизина в тельцах Леви свидетельствует о нарушениях цитоскелета и транспорта синаптических везикул в нейронах черной субстанции при болезни Паркинсона. Описанные морфохимические особенности телец Леви позволяют проводить комплексную оценку агрегации белков при болезни Паркинсона, что необходимо учитывать при патоморфологических исследованиях.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Р.М.Х., Д.Н.В.

Сбор и обработка материала — Д.Н.В., П.Л.А., В.Н.С.

Статистическая обработка — Д.Н.В., В.Н.С.

Написание текста — Д.Н.В., В.Н.С., П.Л.А., Р.М.Х.

Редактирование — Р.М.Х.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Воронков Дмитрий Николаевич — канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. функциональной морфохимии; https://orcid.org/0000-0001-5222-5322; e-mail: voronkovdm@gmail.com

Сальков Владимир Николаевич — д-р мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. функциональной морфохимии; https://orcid.org/0000-0002-1580-0380; e-mail: vlasalkov@yandex.ru