Воронков Д.Н.

ФГБУ "Научный центр неврологии" РАМН, Москва

Сальков В.Н.

1. Научный центр неврологии РАМН, Москва; 2. Научный центр здоровья детей РАМН, Москва; 3. Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.И. Городкова

Ануфриев П.Л.

ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия

Худоерков Р.М.

ФГБУ "Научный центр неврологии" РАМН, Москва

Тельца Леви при болезни Паркинсона (гистологическое, иммуногистохимическое и интерферометрическое исследование)

Журнал: Архив патологии. 2018;80(4): 9-13

Просмотров : 278

Загрузок : 12

Как цитировать

Воронков Д. Н., Сальков В. Н., Ануфриев П. Л., Худоерков Р. М. Тельца Леви при болезни Паркинсона (гистологическое, иммуногистохимическое и интерферометрическое исследование). Архив патологии. 2018;80(4):9-13. https://doi.org/10.17116/patol20188049

Авторы:

Воронков Д.Н.

ФГБУ "Научный центр неврологии" РАМН, Москва

Все авторы (4)

Основными патоморфологическими признаками болезни Паркинсона (БП) служат дегенерация нейронов черной субстанции среднего мозга и наличие внутриклеточных белковых включений — телец Леви (ТЛ). Ключевым, но не единственным их компонентом является белок α-синуклеин (α-Syn), функцию которого связывают с синаптической передачей [1, 2]. По современным представлениям, токсичные фибриллярные формы и агрегаты α-Syn ответственны за гибель нейронов при БП [1, 2]. Синуклеинпозитивные включения обнаруживают также при нормальном старении и нейродегенеративной патологии — мультисистемной атрофии, деменции с ТЛ, и в каждом из этих случаев их структура и локализация имеют свои особенности [1, 2]. В эксперименте образование агрегатов α-Syn показано при повреждении убиквитин-протеасомной системы, дисфункции митохондрий, избыточной экспрессии α-Syn [1], однако их структура отличается от наблюдаемой при БП [3].

Белковые агрегаты при БП выявляются различными методами, в том числе импрегнацией серебром и окрашиванием тиофлавином, однако более специфична иммуногистохимическая реакция на α-Syn [4]. В соответствии с формой и локализацией ТЛ выделяют округлые белковые агрегаты в перикарионах и отростках нейронов, а также вытянутые веретеноподобные включения и деформированные отростки (нейриты Леви). Кроме того, различают ТЛ и бледные тельца — последние эозином не окрашиваются, а в ТЛ эозином окрашивается только ядро [3, 4].

При электронно-микроскопическом исследовании в ТЛ обнаруживают наружный радиально организованный фибриллярный слой и более плотное гранулярное ядро, причем наружный слой ТЛ интенсивно окрашивается на α-Syn, а ядро — на убиквитин [3, 4]. Методом инфракрасной Фурье-спектроскопии показано, что по сравнению с периферической частью ядро ТЛ содержит больше белков с β-структурой и более плотную липидную составляющую [5]. Несмотря на то что морфогенез ТЛ изучен слабо, предполагают, что бледные тельца и нейриты Леви являются их предшественниками [6, 7].

Совершенствование методов обнаружения агрегатов α-Syn важно для патоморфологической диагностики БП, в том числе прижизненной, основанной на их выявлении в структурах периферической нервной системы в биопсийном материале [8]. В настоящее время растет интерес к методам интерференционной микроскопии, в связи с тем что современные алгоритмы количественной фазовой микроскопии [9, 10] позволяют не только выявлять клеточные структуры без окрашивания, но и определять для каждой точки изображения оптическую разность хода, которая пропорциональна сухой массе вещества и содержанию белка в клетке [11]. Показано, что анализ фазовых изображений информативен при оценке патологических изменений в тканях [9], в том числе для выявления агрегатов β-амилоида при моделировании болезни Альцгеймера [12]. Хотя в ранних работах отмечены особенности ТЛ при использовании фазового контраста [13], данных об их исследовании методом интерферометрии в доступной литературе мы не обнаружили.

Несмотря на расширяющиеся методические возможности, существующая классификация гистопатологических изменений в структурах мозга при БП [14] не учитывает количественные характеристики белковых агрегатов и особенности их структуры. Комплексный анализ строения ТЛ может служить основой для разработки новых подходов к оценке выраженности и определению стадий нейродегенеративного процесса при БП и других синуклеинопатиях.

Цель исследования — количественно оценить морфохимические характеристики ТЛ, выявляемых в черном веществе головного мозга при болезни Паркинсона.

Материал и методы

Использовали образцы среднего мозга умерших от интеркуррентных заболеваний с диагнозом «БП, 3-я стадия по шкале Хен—Яра»: женщины 47 лет (смешанная форма) и 2 мужчин 59 лет (дрожательно-ригидная форма) и 70 лет (смешанная форма), средняя продолжительность заболевания составила 7 лет. Аутопсийный материал получен из архива лаборатории патологической анатомии с прозектурой ФГБНУ НЦН. Фиксированные в 4% формалине образцы мозга проводили через изопропанол и заливали в парафин. Фронтальные срезы в области черной субстанции толщиной 10 мкм готовили на микротоме Leica SR2000 и раскладывали на покрытые желатином стекла.

Для выявления α-Syn использовали кроличьи поликлональные антитела («Sigma», 1:250), демаскировку антигенов проводили в муравьиной кислоте 10 мин. Кроме того, исследовали локализацию белка нейрофиламентов (антитела мыши к легкой цепи L-NF, «Dako», 2F11, 1:100) и белка синаптических везикул синаптофизина (антитела мыши, «Dako», SY38 1:100). Иммуноферментную реакцию проводили с биотинилированными антителами козы к иммуноглобулинам кролика и экстравидинпероксидазой (набор EXTRA3-KIT, «Sigma») с хромогеном SigmaFast (3,3-диаминобензидин c CoCl2), согласно рекомендациям производителя. Для иммунофлюоресцентной детекции применяли вторичные козьи (меченные флюорохромом CF488) или ослиные (меченные флюорохромом CF555) антитела («Sigma», 1:200). Часть препаратов окрашивали гематоксилином и эозином по Майеру (Biovitrum). Препараты исследовали под микроскопом Nikon Eclipse NiU (Япония), оснащенным камерой Nikon DS-Qi. Морфометрически синуклеин-позитивные агрегаты оценивали с помощью программы ImageJ не менее чем на 10 срезах и в 50 полях зрения (увеличение объектива 40) для каждого случая, используя для их выделения локальную пороговую сегментацию. Синуклеин-позитивные включения классифицировали при помощи иерархического кластерного анализа методом k-средних. Различия соотношений разных типов агрегатов оценивали при помощи критерия χ2.

Интерферометрию проводили на микроскопе Бинам Л211 (ЛОМО, Россия) с источником света на основе зеленого светодиода (10 Вт), используя светофильтр (λ 525 нм). Схема Жамена—Лебедева, лежащая в основе устройства микроскопа, и его применение для подобных задач описаны ранее [11]. Срезы заключали в среду FluoroShield («Fisher Scientific», показатель преломления nd=1,364) под покровные стекла. Для анализа выбирали округлые α-Syn-позитивные включения (отмечая их координаты под флюоресцентным микроскопом) вне скоплений гранул меланина, искажающих измерения. Интерферометрировали участки, свободные от переналожения изображений, при увеличении объектива в 40 раз. Интерференционную картину регистрировали с помощью монохромной цифровой ПЗС-камеры c разрешением 5 Mpx («Moticam», Китай). Анализ проводили методом интерферометрии фазового сдвига – смещение фазы объектом вычисляли по алгоритму Карре из четырех изображений, регистрируемых при вращении анализатора с шагом фазы π/2 [10]. Обработку интерферограмм выполняли в программе IDEA [15]. Статистический анализ выполняли в программе Statistica 6.0.

Результаты и обсуждение

Во всех исследованных образцах обнаружены многочисленные α-Syn-позитивные включения, которые локализовались как в телах нейронов, так и в нейропиле в виде аксональных агрегатов и вытянутых, деформированных нейритов Леви (см. рис. 1, б,

Рис. 1. Патологические белковые агрегаты в черном веществе мозга при болезни Паркинсона. а — тельце Леви с эозинофильным центром (стрелка) и бледное тельце (звездочка) в перикарионе меланинсодержащих нейронов. Окраска гематоксилином и эозином, ×100; б — синуклеин-позитивные включения в нейронах; в — в нервных волокнах, указано стрелками. Иммуноферментная реакция на α-синуклеин, докрашивание крезиловым фиолетовым. ×100.
в), что соответствует тяжелым изменениям по шкале Браака [14]. Медианная плотность распределения нейронов с ТЛ в компактной части черной субстанции составила 3 (LQ=2, HQ=5) на 0,01 мм2. У части окрашенных ТЛ выявляли эозинофильное ядро (рис. 1, а).

Морфометрия иммунофлюоресцентных препаратов показала, что площадь α-Syn-позитивных включений, учитывая аксональные агрегаты, в среднем равнялась 56,7±2,8 мкм2 , а их эквивалентный диаметр составлял от 4 до 25 мкм. По параметрам формы, используя кластерный анализ, α-Syn-позитивные включения разделили на группы (см. таблицу):

Морфометрические показатели белковых агрегатов, содержащих α-синуклеин в черном веществе головного мозга при болезни Паркинсона Примечание. Данные представлены в виде средних значений и стандартной ошибки. Фактор формы круглость (circularity) вычисляли как C=4π(S/L2), где S — площадь, L — периметр фигуры.
1-я и 2-я группы — это округлые агрегаты, обнаруживаемые в телах и отростках нейронов, от мелких (1-я группа) и до крупных (2-я группа); 3-я группа представлена нейритами Леви и переходными аксональными формами — веретеновидными включениями и включениями в форме запятой или бусин, надетых на нить.

Не все агрегаты были окрашены на α-Syn однородно, часть из них имела слоистую структуру. В 1-й и 2-й группах в 46% случаев выявляли интенсивно окрашенный на α-Syn наружный слой, имевший вид кольца, а центральная их часть на α-Syn окрашивалась слабо (рис. 2, а).

Рис. 2. Структура телец Леви по данным иммуногистохимического и интерферометрического исследования. а — двойное иммунофлюоресцентное окрашивание на α-синуклеин (зеленым, α-Syn) и белок нейрофиламентов (красным, NF). Линейка — 20 мкм, об. ×100. График: профиль интенсивности флюоресценции по линии сечения (стрелка), ось x — мкм, ось y — относительная интенсивность флюоресценции, %; б — двойное иммунофлюоресцентное окрашивание на α-синуклеин (зеленым, α-Syn) и синаптофизин (красным, SF). Обозначения, как на рис. 2, а; в — фазовая картина тельца Леви. На диаграмме поверхности по осям x, y — мкм, по оси z и на цветовой шкале — разность фаз, рад. График: левая шкала ординат, черная кривая — профиль разности фаз по линии сечения (стрелка на диаграмме поверхности) в сопоставлении с профилем интенсивности флюоресценции при окрашивании на α-Syn — правая шкала ординат, зеленая кривая, ось x — мкм.
В агрегатах, входивших в 3-ю группу, такую структуру имело только 17,5% включений, что статистически значимо ниже, чем в 1-й и 2-й группах (p=0,01, критерий χ2). Включения, имевшие округлую форму, и ядро, слабо окрашиваемое на α-Syn, мы отнесли к «зрелым» ТЛ.

Иммуноокрашивание на белок нейрофиламентов наблюдали в большинстве α-Syn-позитивных агрегатов, однако его отчетливую концентрическую локализацию (см. рис. 2, а) отмечали только в 30,4% из них, определенных нами как «зрелые» Т.Л. При двойном выявлении α-Syn и синаптофизина последний определяли во всех ТЛ, хотя в большинстве случаев окрашивание было слабовыраженным. Сравнение интенсивности иммунофлюоресцентного окрашивания на α-Syn, белок нейрофиламентов и синаптофизин показало, что пик интенсивности окрашивания на нейрофиламенты смещен к центру ТЛ (см. рис. 2, а), а локализация синаптофизина и α-Syn полностью совпадает (см. рис. 2, б). Методом интерферометрии обнаружили, что «зрелые» ТЛ имеют высокое значение оптической разности хода в центре в противоположность снижению интенсивности иммуноокрашивания на α-Syn (см. рис. 2, в). Среднее значение разности фазы для зрелых ТЛ (n=25) составило 2,2±0,11 рад, что статистически значимо выше, чем для участков нейропиля без выявленных агрегатов α-Syn (1,1±0,05 рад).

Проведенная работа показала морфохимическую неоднородность ТЛ и продемонстрировала возможности анализа их структуры. Согласно данным литературы [16—18], в ТЛ иммуногистохимичеcкими методами обнаруживают не менее 70 различных белков, в том числе синаптофизин и белки нейрофиламентов. Выявленные в нашей работе особенности послойной организации ТЛ согласуются с исследованиями Т. Kanazawa и соавт. [7, 19], выполненными методом конфокальной микроскопии. По сравнению с указанной работой, демонстрирующей локализацию тяжелой субъединицы нейрофиламентов в фосфорилированной форме во внешних слоях ТЛ, мы отметили не только совместную локализацию нейрофиламентов и α-Syn, но и наибольшую интенсивность окрашивания ближе к центральной части Т.Л. Эти результаты свидетельствуют о неоднородном распределении субъединиц нейрофиламентов в Т.Л. Распределение окрашивания на нейрофиламенты в «зрелых» ТЛ в форме кольца отмечено и другими авторами, однако часть ТЛ, по-видимому, находящихся на более ранних стадиях уплотнения структуры, имеет дисковидное окрашивание [20]. В целом агрегация белков цитоскелета в ТЛ, очевидно, вызывает нарушение структуры аксонов, что приводит к синаптической дисфункции [18]. В отличие от нейрофиламентов локализация синаптофизина в ТЛ полностью соответствовала распределению α-Syn, что указывает на включение α-Syn в ТЛ в ассоциации с синаптическими везикулами, а также на нарушение везикулярного транспорта при БП.

Выявленное возрастание значений разности фазы в ядрах ТЛ согласуется с наличием в них плотной липидной и белковой составляющей, образованной фрагментами везикулярных мембран, лизосом и митохондрий [16]. При этом снижение иммуноокрашивания в центральной части ТЛ, по-видимому, вызвано уменьшением доступности эпитопов, выявляемых белков для антител, в связи с изменением их пространственной структуры, фосфорилирования или полиубиквитинилирования [16] и в свою очередь может нести информацию о степени зрелости Т.Л. Вероятно, уплотнение диффузных белковых агрегатов и бледных телец со временем приводит к формированию «классических» ТЛ со слоистой структурой [6, 7]. Как показало наше исследование, наиболее информативным для описания структуры ТЛ является двойное окрашивание на нейрофиламенты и α-Syn в сочетании с морфометрическим анализом, а интерференционная микроскопия может быть использована в качестве дополнительного метода, позволяющего оценить плотность центральной части ТЛ.

Заключение

Таким образом, комплексное морфохимическое исследование структуры синуклеин-позитивных включений при болезни Паркинсона выявило различия телец Леви по форме и структуре, что может быть связано с разными этапами их формирования. Локализация белка нейрофиламентов и синаптофизина в тельцах Леви свидетельствует о нарушениях цитоскелета и транспорта синаптических везикул в нейронах черной субстанции при болезни Паркинсона. Описанные морфохимические особенности телец Леви позволяют проводить комплексную оценку агрегации белков при болезни Паркинсона, что необходимо учитывать при патоморфологических исследованиях.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Р.М.Х., Д.Н.В.

Сбор и обработка материала — Д.Н.В., П.Л.А., В.Н.С.

Статистическая обработка — Д.Н.В., В.Н.С.

Написание текста — Д.Н.В., В.Н.С., П.Л.А., Р.М.Х.

Редактирование — Р.М.Х.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Воронков Дмитрий Николаевич — канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. функциональной морфохимии; https://orcid.org/0000-0001-5222-5322; e-mail: voronkovdm@gmail.com

Сальков Владимир Николаевич — д-р мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. функциональной морфохимии; https://orcid.org/0000-0002-1580-0380; e-mail: vlasalkov@yandex.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail