Логинова Н.П.

ГБОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера" Минздрава России

Четвертных В.А.

Хромцова Г.А.

ГБОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера" Минздрава России

Морфологические и иммуногистохимические особенности строения тимуса у новорожденных детей с врожденными пороками сердца

Журнал: Архив патологии. 2013;75(4): 9-14

Просмотров : 8

Загрузок :

Как цитировать

Логинова Н. П., Четвертных В. А., Хромцова Г. А. Морфологические и иммуногистохимические особенности строения тимуса у новорожденных детей с врожденными пороками сердца. Архив патологии. 2013;75(4):9-14.

Авторы:

Логинова Н.П.

ГБОУ ВПО "Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера" Минздрава России

Все авторы (3)

Нарушение структуры тимуса и его функциональных свойств при различных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы может являться причиной развития акцидентальной инволюции органа, определяя дефектное состояние иммунной системы в целом. Нами изучены особенности раннего постнатального состояния тканей тимуса у детей с врожденными пороками сердца.

В патогенезе данного заболевания лежит механизм нарушения системной гемодинамики, ведущего к развитию тканевой гипоксии различных органов, в том числе тимуса.

В норме у новорожденного тимус уже полностью сформирован. На 1-й неделе после рождения из костного мозга в тимус мигрируют Т-клетки-предшественники с фенотипом CD3-CD4-CD8- с последующей дифференцировкой их до зрелых лимфоцитов CD3+CD4+CD8-, CD3+CD4-CD8+ и, как результат, происходит пополнение циркулирующего пула Т-лимфоцитов [1—4]. В созревании тимоцитов на этапе антигеннезависимой дифференцировки ведущую роль играют тимусные эпителиальные клетки (ТЭК) [3—6]. Многие из них выполняют функцию тканевого каркаса и являются источниками сигналов для развивающихся тимоцитов, генерируемых при прямых контактах. ТЭК служат не только источником стимулов для дифференцировки тимоцитов, но и определяют выбор между пролиферацией и апоптозом этих клеток в процессе положительной и отрицательной селекции. Следствием таких взаимодействий является взаимная активация лимфоидных и эпителиальных клеток [1, 2, 4, 5, 7].

Цель работы — изучить морфологические и иммуногистохимические особенности строения тимуса у новорожденных детей с врожденными пороками сердца.

Материал и методы

Тимус получали от детей в возрасте до 1 года, оперированных по поводу врожденного порока сердца, с одновременно проводимой тимэктомией в соответствии с существующей хирургической практикой в Федеральном краевом центре сердечно-сосудистой хирургии Перми.

В зависимости от сложности порока сердца, определяющего степень гипоксии, были выделены две группы детей: в 1-ю вошли 22 ребенка с синим (тяжелым) пороком, сопровождающимся право-левым сбросом крови и смешиванием артериальной и венозной крови (тетрада Фалло; аномалия Эбштейна; транспозиция магистральных сосудов); во 2-ю — 25 детей с белым или бледным пороком, имеющим лево-правый сброс крови без смешивания артериальной и венозной крови (дефект межжелудочковой или межпредсердной перегородки). Образцы материала фиксировали в 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7,2). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Футу (на состояние ретикулярных волокон); тучные клетки выявляли по Шубичу. Для получения полутонких срезов кусочки тимуса размером 1—2 мм3 фиксировали в 10% растворе глутарового альдегида и 1% растворе OsO4, дегидратировали в этиловом спирте возрастающей концентрации и заключали в аралдитовые смолы. Готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, окрашивали толуидиновым синим.

Для оценки иммуногистохимического состояния клеток проводили окраску мечеными моноклональными антителами: Bcl-2 (для определения клеток, устойчивых к апоптозу), Ki-67 (маркер ядер пролиферирующих клеток), виментином (выявляет клетки — производные мезенхимы), CD34 (определяет костномозговые предшественники). Для визуализации результатов использовали системы детекции Ultra Vision ONE Detection System HRP Polymer. Препараты инкубировали с хромогеном DAV Plus Substrate System и докрашивали гематоксилином Майера с заключением в БиоМаунт-среду. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого антигена («Labvision», США).

Компьютерную морфометрию проводили с помощью программы IMAG PRO+ 4.0 на морфометрической установке Олимпус. Данные подвергали статистической обработке. Достоверность различий определяли с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни, используя программу Statistica 7.0. Различия считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

У детей с врожденным пороком сердца в тимусе имелись структурные изменения тканей, наиболее выраженные в 1-й группе. У них отмечались значительные расстройства кровообращения, сопровождающиеся расширением и переполнением сосудов кровью. В корковой части долек определялись мелкоочаговые кровоизлияния, что нередко наблюдается и при гипоксии другого генеза [8].

В большинстве крупных и мелких сосудов имелся застой клеток крови с признаками гемолиза эритроцитов и периваскулярным формированием грубых коллагеновых волокон. Последнее отмечалось как в корковом, так и в мозговом веществе долек. В междольковой соединительной ткани избыточно развивалась жировая ткань, представленная крупными и мелкими скоплениями виментин-позитивных адипоцитов. Соединительная ткань нередко врастала в дольки, частично замещая их функциональную часть. В таких участках формировался неровный край, чаще фестончатый. На полутонких срезах были заметны признаки дистрофических изменений клеток стромы, что приводило к нарушениям их связи с лимфоцитами («зоны отчуждения») и гнездному опустошению коры долек. На этом фоне активизировались клетки фибробластического дифферона с положительной экспрессией моноклональных антител CD34 и виментина, характерных для прогениторных клеток мезенхимального происхождения. В кортикальной зоне эти клетки формировали достаточно крупные скопления в виде групп или цепочек. В участках деструкции тканей тимуса в присутствии CD34 и виментин-позитивных клеток развивался активный ангиогенез (рис. 1).

Рисунок 1. Ангиогенез в коре дольки тимуса. Экспрессия CD34 в эндотелии сосудов. ×100.

У детей обеих групп в тканях тимуса одиночно или группами также выявлялись мастоциты. Тучные клетки имели разный размер, цитоплазма их была заполнена гранулами, часть клеток находились на стадии активной дегрануляции. В таких участках был резче выражен отек стромы и соединительнотканных структур. Находясь между лимфоцитами, тучные клетки в корковом веществе формировали мастолимфоцитарные розетки. Во внутридольковом периваскулярном пространстве кортико-медуллярной зоны также отмечались переполненные сосуды с явлением диапедеза эритроцитов. В подобных участках вдоль сосудов располагались крупные тучные клетки и фибробласты. Последние, по данным литературы [6, 9, 10], способны синтезировать ряд основных посредников воспаления, активизирующих тучные клетки.

В тимусе детей 2-й группы наблюдались аналогичные морфологические изменения, но выраженные в меньшей степени.

Структурные изменения тимуса сопровождались устойчивостью лимфоцитов к апоптозу, что влияло на их пролиферативные свойства. Признаком служила активность генов bcl-2 в клетках коркового вещества долек тимуса. Положительная экспрессия генов bcl-2 имелась в субкапсулярной и основной части коркового вещества дольки. Bcl-2-позитивные лимфоциты чаще выявлялись диффузно, нередко формируя скопления. При выраженных состояниях гипоксии (1-я группа) на фоне осложненного врожденного порока сердца экспрессия bcl-2 в цитоплазме клеток увеличивалась от субкапсулярной к кортико-медуллярной зоне. В субкапсулярной зоне у детей 1-й группы доля Bcl-2-позитивных лимфоцитов составляла 32,2±6,1%, 2-й группы — 41±3,8%. В кортикальной части дольки в участках дубль-позитивных лимфоцитов (CD4+CD8+) экспрессия Bcl-2 достаточно сильно выявлялась в диффузно расположенных лимфоцитах (18,6±2,9% в 1-й группе, 9,8±3% во 2-й группе). От мозгового вещества в сторону коры формировались крупные скопления Bcl-2-позитивных лимфоцитов (рис. 2).

Рисунок 2. Миграция апоптозоустойчивых Bcl-2-лимфоцитов в кору дольки. ×100.

Помимо появления в коре долек тимуса нетипичных апоптозоустойчивых лимфоцитов, находящихся на этапах кортикального созревания, имелось нарушение структуры гематотимического барьера в кортико-медуллярной зоне, что хорошо выявлялось при окрашивании срезов по Футу. Формирующиеся в результате этого обширные очаги повреждения барьера способствовали миграции лимфоцитов из мозговой части дольки в корковое вещество (рис. 3).

Рисунок 3. Фрагменты сети ретикулярных волокон в кортико-медуллярной зоне. Окраска по Футу. ×400.

При изучении пролиферативной способности клеток положительная экспрессия Ki-67 выявлялась в диффузно расположенных лимфоцитах в пределах всей дольки тимуса (рис. 4).

Рисунок 4. Диффузная экспрессия маркера пролиферации Ki-67 в коре дольки. ×400.

При сравнении двух групп детей доля тимоцитов, экспрессирующих Ki-67, в обеих группах статистически не различалась и составила 51,0±2,2% в 1-й группе и 52,2±3,1% — во 2-й. Однако доля клеток, находящихся на стадии S-периода, во 2-й группе была на 63,3±5,8% выше, чем в 1-й. На наш взгляд, это обусловлено задержкой этапов дифференцировки лимфоцитов из-за выраженного процесса деструкции эпителиальных клеток стромы. Действительно, на полутонких срезах выявлялись значительные дистрофические изменения тимусного эпителия с явлениями апоптоза клеток. В этих участках накапливались активные макрофаги с многочисленными вакуолями, светлого или пенистого характера, и фагоцитированным материалом. Макрофаги поглощали погибшие клетки, частично сами разрушались из-за перегруженности фагоцитированным материалом и выхода лизосомальных ферментов (рис. 5).

Рисунок 5. Дистрофические изменения эпителиальных клеток (ТЭК) в коре дольки. Скопление активных макрофагов (М). Полутонкий срез, окраска метиленовым синим. ×1000.

ТЭК являются основным компонентом микроокружения тимоцитов. Взаимоотношения тимоцитов и ТЭК являются реципрокными. Обмениваясь сигналами, эти клетки поддерживают свои жизнеспособность, активность и структурную организацию [1, 3, 5, 7, 9, 11]. Морфологические изменения тимуса свидетельствовали о том, что деструкция и гибель ТЭК существенно влияют на пролиферацию лимфоцитов. Тимоциты без тканевого каркаса недополучают сигналы для своего развития, задерживается их пролиферация или они подвергаются апоптозу [1, 7, 11, 12]. На уровне субкапсулярной части тимоциты теряют контакты, прежде всего с эпителиальными клетками, секретирующими интерлейкин-7. Основная функция этого цитокина — поддержание выживаемости созревающих тимоцитов путем индукции экспрессии антиапоптического фактора Bcl-2 [5, 7, 11, 12]. Несостоятельность данной функции проявлялась у детей 1-й группы в тимусах, в которых доля Bcl-2-позитивных лимфоцитов была небольшая. Недавние костномозговые мигранты, становясь уязвимыми, частично подвергались апоптозу, не пройдя всех этапов своего развития. На уровне кортикальной зоны в норме тимоциты, экспрессирующие рецепторный комплекс CD3+CD4+CD8+, практически лишены Bcl-2, что обрекает их на гибель из-за отсутствия специализированных факторов защиты. Нарушение структуры ТЭК этой части коры дольки способствовало быстрому перемещению тимоцитов на границу кортико-медуллярной зоны, что не позволяло им завершить этапы дифференцировки. Очевидно, недостающий контакт лимфоцитов с ТЭК на этапах кортикального созревания вызывает нарушение селекционного отбора в условиях антигеннезависимой дифференцировки, что приводит к гибели тимоцитов.

Таким образом, у детей 1-й группы (по сравнению со 2-й) в тимусе при врожденной гипоксии формируется комплекс значительных морфологических изменений, влияющих на устойчивость лимфоцитов к апоптозу и нарушению их перераспределения в коре долек тимуса.

В отличие от патогенеза акцидентальной инволюции, проявляющейся снижением объема лимфоидной ткани органа на фоне сохранения структуры эпителиальной стромы и восстановления функции органа, при врожденной гипоксии, обусловленной врожденным пороком сердца, этого не происходит, и возврат к функциональному восстановлению маловероятен. Этот факт можно рассматривать как вариант врожденной патологической инволюции необратимого характера и проявляющийся заместительным цитогенезом клеток фибробластического дифферона, не способных в силу своих гистогенетических свойств создавать условия для развития Т-лимфоцитов на этапе их антигеннезависимой дифференцировки. Последствия в этом случае для всей иммунной системы очевидны.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант №11-04-96023 p_урал_а).

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail