Шляхтунов Е.А.

Учреждение образования «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», Витебск, Республика Беларусь

Клопова В.А.

Учреждение образования «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», Витебск, Республика Беларусь

Экспрессия антиапоптотического протеина сурвивина и его гена в первичной карциноме молочной железы

Журнал: Архив патологии. 2019;81(2): 18-23

Просмотров : 22

Загрузок : 1

Как цитировать

Шляхтунов Е. А., Клопова В. А. Экспрессия антиапоптотического протеина сурвивина и его гена в первичной карциноме молочной железы. Архив патологии. 2019;81(2):18-23. https://doi.org/10.17116/patol20198102118

Авторы:

Шляхтунов Е.А.

Учреждение образования «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», Витебск, Республика Беларусь

Все авторы (2)

Сурвивин — белок, кодируемый у людей геном BIRC5, получил название «бакуловирусный протеин» [1, 2]. Сурвивин — член семейства белков ингибиторов апоптоза (IAP). Основная функция белка сурвивина заключается в том, чтобы запретить каспазную активацию апоптоза. Экспрессия генов BIRC5 высокая в период внутриутробного развития и при развитии большинства опухолей, при этом содержание его ничтожно мало в дифференцированной ткани [3]. Экспрессия гена сурвивина четко отрегулирована клеточным циклом. Установлено, что экспрессия гена BIRC5 и синтез сурвивина связаны с белком p53 [4]. Экспериментальные исследования показали, что сурвивин ингибирует апоптоз, останавливая как внешний, так и внутренний путь связывания и ингибирования эффекторных каспаз 3 и 7 [5].

Экспрессия гена сурвивина особенно выражена во время эмбрионального развития, а также в большинстве типов клеток опухоли и редко присутствует в нормальных, доброкачественных взрослых дифференцированных клетках.

Белок сурвивин может быть расценен как онкоген, поскольку его сверхэкспрессия в большинстве раковых клеток способствует их сопротивлению апоптотическим стимулам и химиотерапевтическим методам лечения, таким образом способствуя продолжающемуся выживанию и прогрессированию.

Цель исследования — изучить экспрессию антиапоптотического протеина сурвивина, а также гена BIRC5, его кодирующего, в первичной карциноме молочной железы как потенциального прогностического и предиктивного маркера.

Материал и методы

Исследовали 67 образцов (биоптатов) первичной карциномы молочной железы, полученные в ходе оперативного вмешательства или трепан-биопсии опухоли у пациенток с верифицированным резектабельным первичным раком молочной железы (РМЖ) стадии pT1−4N3cM0.

Наряду со стандартным иммуногистохимическим (ИГХ) исследованием экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона, а также рецептора эпидермального фактора роста была исследована экспрессия антиапоптотического белка сурвивина. Использовали антитело Susvivin Antibody Biоtin conjugate («Pierce», Франция), а также систему для автоматической визуализации BOND Polymer Detection Systems («Leica Microsystems», Германия). Окрашивание проводили в автоматическом режиме на иммуностейнере фирмы «Leica Microsystems». Дальнейшее изучение микропрепаратов и их оценку осуществляли на микроскопах фирмы «Leica».

Использовали ИГХ-исследование экспрессии антиапоптотического протеина сурвивина в ткани карциномы, с помощью обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени исследовали нормализованную экспрессию гена BIRC5, кодирующего белок сурвивин. Полученный в ходе биопсии или оперативного вмешательства образец опухоли в объеме до 5 мм3 замораживали, затем измельчали, лизировали. Выделение мРНК из лизированных клеток проводили в соответствии с инструкциями производителя наборов для выделения РНК (ООО «СИВитал», Беларусь). Используя технологию обратной транскрипции, синтезировали кДНК, которую применяли в последующем для анализа экспрессии гена BIRC5 в режиме реального времени ОТ-ПЦР. Расчет нормализованной экспрессии проводили относительно уровня экспрессии референсного гена «домашнего хозяйства» с-ABL.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли в соответствии с современными требованиями, предъявляемыми к проведению медико-биологических исследований. Качественные показатели представлены абсолютными и относительными величинами. Количественные признаки, не подчиняющиеся нормальному закону распределения, представлены в виде медианы (Ме), интерквартильного диапазона (LQ/UQ), минимального и максимального значений (min, max). В качестве меры связи для количественных признаков, не подчиняющихся нормальному закону распределения, рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при уровне значимости р<0,05. Все значения р были двусторонними. Статистическую обработку результатов провели с использованием программы SPSS Statistics 10.0.

Результаты и обсуждение

Учитывая тот факт, что в настоящее время отсутствуют ИГХ-критерии оценки уровня экспрессии сурвивина как, например, для рецептора эпидермального фактора роста Her2-neu, оценку экспрессии таргетного антигена проводили по принципу да/нет, т. е. имеется экспрессия данного протеина в клетках или нет.

Экспрессию сурвивина определяли в 47 образцах карциномы молочной железы, что составило 70,15%.

Клинико-анатомическая характеристика опухолевого процесса, а также патоморфологическая характеристика образцов первичных карцином, в которых с помощью ИГХ-исследования определили экспрессию антиапоптотического протеина сурвивина, представлены в табл. 1 и 2

Таблица 1. Клинико-анатомическая характеристика первичных карцином молочной железы, экспрессирующих сурвивин (n=67)
Таблица 2. Патоморфологическая характеристика первичных карцином молочной железы, экспрессирующих сурвивин (n=67)
соответственно.

При анализе клинико-анатомических характеристик опухоли и экспрессии сурвивина в опухолевой ткани каких-либо статистически значимых зависимостей и корреляций выявлено не было.

Наибольший интерес представляет изучение экспрессии сурвивина в сравнении с известными прогностическими маркерами, определяемыми в опухолевой ткани, главным образом такими, как гистологический тип опухоли, молекулярно-биологический подтип опухоли, степень дифференцировки, лимфососудистая инвазия, индекс пролиферативной активности и др. (см. табл. 2).

Из представленных в табл. 2 данных видно, что экспрессия антиапоптотического белка сурвивина определялась наиболее часто в протоковой карциноме средней и высокой степени злокачественности и главным образом сочеталась с лимфовенозной стромальной инвазией.

Следует отметить, что экспрессия белка сурвивина коррелировала с экспрессией рецептора эпидермального фактора роста HER2-neu. Наиболее часто сурвивин экспрессировался в опухолях, не экспрессирующих HER2-neu (r=0,113; p>0,05).

Интересна полученная информация о взаимосвязи экспрессии сувивина и индекса пролиферативной активности Ki-67. Так, например, в 59,6% случаев сурвивин экспрессировался в опухолях с низким показателем Ki-67 — меньше 15%.

Несмотря на то что данные статистически недостоверны как в отношении экспрессии HER2-neu, так и Ki-67 (p>0,05) и корреляционная зависимость слабая, данный факт может свидетельствовать о том, что опухоли, экспрессирующие сурвивин, находятся в особом состоянии, в стадии не активной пролиферации, а в состоянии ингибирования апоптоза. Графическое изображение сочетания экспрессии сурвивина и молекулярно-биологического подтипа опухоли представлено на рис. 1.

Рис. 1. Экспрессия белка сурвивина в различных молекулярно-биологических подтипах карциномы молочной железы.

Качественная оценка экспрессии белка сурвивина имеет также определенное значение с точки зрения понимания функции данного протеина и возможных потенциальных механизмов воздействия на данный сигнальный путь.

Так, при ИГХ-исследовании установлено, что белок сурвивин экспрессировался преимущественно в цитоплазме опухолевых клеток первичной карциномы молочной железы (рис. 2, 3).

Рис. 2. Инвазивная карцинома неспецифического типа. Иммуногистохимическая реакция с антителами к сурвивину, ×200.
Рис. 3. Инвазивная дольковая карцинома. Иммуногистохимическая реакция с антителами к сурвивину, ×200.
Следует обратить внимание, что не вся опухоль экспрессирует данный белок, а экспрессия отмечается в ряде случаев в отдельных участках, что может свидетельствовать о гетерогенности опухолевых клеток в пределах самой опухоли. Гетерогенность опухолевых клеток в пределах самой опухоли является одним из важных моментов в патогенезе и развитии резистентности опухоли к проводимой терапии. Различный фенотип опухолевых клеток в первичной опухоли и главным образом наличие клеток на этапе ЭМП и стволовых клонов определяют прогноз течения опухолевого процесса.

Также при помощи ОТ-ПЦР в режиме реального времени исследована экспрессия гена сурвивина BIRC5 в 67 образцах первичной карциномы молочной железы. Во всех без исключения образцах опухолевой ткани определялась экспрессия гена BIRC5, однако уровни рассчитанной нормализованной экспрессии относительно уровня экспрессии референсного гена c-ABL варьировали в широком диапазоне (рис. 4).

Рис. 4. Показатели нормализованной экспрессии гена BIRC5 в первичной карциноме молочной железы (ОТ-ПЦР, n=67).

Показатели нормализованной экспрессии гена BIRC5 в первичной карциноме молочной железы (ОТ-ПЦР): медиана — 1,49, min — 0,015, max —30, 40, LQ — 0,662, UQ — 13,5.

Результаты корреляционного анализа приведены в табл. 3.

Таблица 3. Корреляция нормализованной экспрессии гена BIRC5 с другими молекулярно-биологическими и патолого-анатомическими характеристиками первичной карциномы молочной железы

При анализе представленных данных установлено, что уровень нормализованной экспрессии гена BIRC5 достоверно умеренно коррелирует с экспрессией собственного продукта белка сурвивина (r=0,704; p<0,01) и слабо отрицательно коррелирует c экспрессией онкопротеина HER2-neu (r=–0,285; p<0,05).

I. Tamm и соавт. [5] показали, что уровень сурвивина повышен во всех 60 различных линиях опухоли человека. В литературе [6] имеются сведения, что инактивация сурвивина в раковых клетках позволяет остановить формирование микроканальцев, что приводит к полиплоидии, а также к крупному апоптозу. Еще одной из важных функций сурвивина является регулирование уровня p53. Известно, что особенность большинства опухолей со сверхэкспрессией сурвивина — полная потеря дикого типа p53 [7]. В то же время исследования A. Mirza и соавт. [7] доказывают, что существует связь между уровнем сурвивина и p53. Дикий тип p53 подавлял экспрессию сурвивина на уровне мРНК как в клетках рака легкого, так и в клетках РМЖ.

При исследовании образцов крови от пациентов, страдающих раком, ученые нашли антитела, которые являются специфическими для сурвивина и отсутствуют у здоровых людей. Измерение уровня сурвивин-определенных антител в крови пациента является мониторингом развития опухоли, а определение экспрессии сурвивина при всех наиболее распространенных злокачественных опухолях (рак легкого, толстой кишки, поджелудочной железы, простаты, молочной железы, сарком мягких тканей, Т-клеточного лейкоза) позволяет прогнозировать риск смерти [8]. Кроме того, исследования показали, что клетки РМЖ, гиперэкспрессирующие ген эпидермального фактора роста HER2-neu, имели более высокие уровни сурвивина, которые коррелировали с увеличенным сопротивлением таксанвызванному апоптозу. В то же время комбинация таксанов с ингибитором сурвивина привела к увеличенному апоптозу в HER2-гиперэкспрессирующих клетках РМЖ по сравнению с монотерапией [9, 10].

Заключение

Полученные данные по исследованию экспрессии гена BIRC5 и его белкового продукта семейства ингибиторов апоптоза протеина сурвивина позволяют рассматривать данный ген и его продукт как один из опухолеспецифических маркеров опухолевой ткани карциномы молочной железы. Его положительная корреляционная связь с известным прогностическим фактором, таким как экспрессия онкопротеина рецептора эпидермального фактора роста HER2-neu (r=–0,285; p<0,05), и активная транскрипция кодирующего гена (r=0,704; p<0,01) позволяют рассматривать белок сурвивин и ген BIRC5, его кодирующий, как неблагоприятный прогностический фактор и использовать его в качестве предиктивного маркера ответа на химотерапию, в том числе и таргетную.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.А.Ш., А.В.К.

Сбор и обработка материала — Е.А.Ш., А.В.К.

Статистическая обработка — Е.А.Ш.

Написание текста — Е.А.Ш.

Редактирование — Е.А.Ш.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Шляхтунов Евгений Александрович — канд. мед. наук, доцент каф. онкологии;e-mail: Evgenij-shlyakhtunov@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-5906-5373

Клопова В.А, https://orcid.org/0000-0002-1401-1021

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail