Франк Г.А.

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий, Москва

Кузнецова О.А.

Кафедра акушерства и гинекологии Волгоградского государственного медицинского университета

Завалишина Л.Э.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздравсоцразвития России

Андреева Ю.Ю.

ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России

Олюшина Е.М.

ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, Москва, Россия

Виноградов И.Ю.

ГУЗ "Рязанский областной клинический онкологический диспансер"

Виноградов М.И.

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет» Минздрава России, Рязань, Россия

Куликов Е.П.

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России, Рязань, Россия; ГБУ РО «Областной клинический онкологический диспансер», Рязань, Россия

Шомова М.В.

ГБУ Рязани «Областной клинический онкологический диспансер», Рязань

PD-L1-статус рака молочной железы

Журнал: Архив патологии. 2019;81(2): 3-9

Просмотров : 491

Загрузок : 18

Как цитировать

Франк Г. А., Кузнецова О. А., Завалишина Л. Э., Андреева Ю. Ю., Олюшина Е. М., Виноградов И. Ю., Виноградов М. И., Куликов Е. П., Шомова М. В. PD-L1-статус рака молочной железы. Архив патологии. 2019;81(2):3-9. https://doi.org/10.17116/patol2019810213

Авторы:

Франк Г.А.

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий, Москва

Все авторы (9)

Рак молочной железы (РМЖ) в настоящее время является самой распространенной злокачественной опухолью у женского населения (20,9%) и, несмотря на имеющийся прогресс в лечении этого заболевания, продолжает занимать лидирующие позиции среди причин женской смертности от злокачественных новообразований. Во всем мире ежегодно РМЖ диагностируется более чем у 1,7 млн женщин. При этом примерно 25% из них женщины в возрасте до 50 лет и 5% моложе 35 лет. Около 6% пациенток на момент постановки диагноза имеют метастазы, средняя продолжительность жизни таких больных составляет 24 мес, а 5-летняя выживаемость — 21% [1, 2].

В то же время на сегодняшний день возможности морфологической диагностики РМЖ значительно возросли и позволяют получить множество данных, характеризующих биологические свойства опухоли, которые врач-онколог может использовать при оценке прогноза заболевания и выборе лекарственной терапии. В клинической практике принципиальное значение имеет молекулярно-генетический подтип РМЖ, именно он определяет, будет ли опухоль положительно отвечать на ту или иную схему терапии.

В сегодняшней клинической практике широко используется определение молекулярно-генетического подтипа РМЖ с помощью суррогатных иммуногистохимических маркеров, позволяющее выделять следующие биологические подтипы [3, 4]:

— люминальный, А (ER +, HER2-neu-негативный, Ki-67 менее 20%, PgR 20% и более);

— люминальный B, подразделяющийся на HER2-негативный (ER +, HER2-neu-негативный, Ki-67 20% и более, PgR менее 20%) и HER2-позитивный (ER +, HER2-neu — гиперэкспрессия или амплификация, Ki-67 — любой, PgR — любой);

— HER2-neu-позитивный (ER – негативный, HER2-neu — гиперэкспрессия или мплификация, Ki-67 — любой, PgR — негативный);

— тройной негативный, подразделяющийся на небазальный (ER 0, HER2-neu-негативный, Ki-67 — любой, PgR0, CK5/6-негативный) и базальный (ER 0, HER2-neu-негативный, Ki-67 — любой, PgR0, CK5/6-позитивный).

Повышенное внимание к тройному негативному фенотипу обусловлено тем, что этот вариант РМЖ, встречающийся в основном у молодых пациенток, наиболее неблагоприятен по прогнозу в силу агрессивного поведения и ограниченных возможностей фармакотерапии, обусловленных отсутствием в данном фенотипе РМЖ возможных точек приложения для воздействия гормональными и таргетными лекарственными препаратами.

Это обстоятельство диктует необходимость дальнейшего изучения биологических свойств РМЖ, в частности тех, что позволяют опухоли избегать иммунный надзор со стороны организма и, как следствие, прогрессировать и метастазировать, и которые в дальнейшем можно будет использовать в качестве потенциальной мишени для борьбы с опухолью посредством иммунотерапии. Активно ведется поиск новых маркеров РМЖ, уровень экспрессии которых можно будет использовать для прогнозирования течения заболевания и оценки перспективности назначения новых иммунотерапевтических препаратов. Одним из таких маркеров может стать PD-L1, повышенная экспрессия которого является одним из механизмов «обмана» опухолевыми клетками иммунной системы.

Лиганд запрограммированной гибели клеток (PD-L1), он же CD274 и B7-H1 — трансмембранный белок массой 40 кД, кодирующийся геном CD274, располагается на 9-й хромосоме и связывается с клеточным рецептором PD1. Уровень экспрессии этого гена контролируется регуляторным фактором 1 интерферона (IRF1) и STAT1 [1]. Экспрессия PD-L1 выявляется как на опухолевых, так и на иммунных клетках. Коэкспрессия PD-L1 и его рецептора PD-1 является причиной ингибирования пролиферации лимфоцитов, регулируемой рецепторами T-клеток секреции цитокинов [2]. Путь ингибирования PD-1/PD-L1 является ключевым фактором регуляции работы T-лимфоцитов при иммунном ответе, одним из так называемых chekpoint-ингибиторов [5]. В норме он играет критическую роль в предотвращении аутоиммунных реакций и поддержании иммунного гомеостаза [6]. Некоторые опухоли могут экспрессировать белки, подавляющие иммунный ответ, в том числе и PD-L1 [7].

Благодаря достижениям современной фармакологии у человечества появилось такое оружие, как иммунотерапия. Лекарственные препараты, направленные на блокировку рецепторов PD-L1, уже зарегистрированы в России для лечения таких нозологических форм, как немелкоклеточный рак легкого, уротелиальный рак мочевого пузыря, меланома [8, 9].

На сегодняшний день существует несколько моноклональных антител анти-PD-L1 для иммуногистохимического определения экспрессии PD-L1, из которых в России зарегистрированы только три: 22C3 («Dako»), SP142, SP263 («Ventana»), для них разработаны протоколы проведения реакции и системы интерпретации результатов для рака легкого, мочевого пузыря и желудка. Выбор моноклонального антитела влияет на результат реакции и интерпретацию результатов PD-L1-статуса опухоли, однако для РМЖ пороговые значения не утверждены.

При интерпретации результатов иммуногистохимического исследования нужно учитывать, что экспрессия PD-L1 отмечается как в эпителии, так и в строме опухоли, может быть мембранной и цитоплазматической и выявляется только в определенных участках опухоли. Предполагается, это связано с тем, что зона экспрессии PD-L1 в атипичных клетках ограничена областью инвазивного фронта опухоли [1,10]. Также необходимо отметить, что PD-L1 может присутствовать не только в раковых, но и в иммунокомпетентных клетках, инфильтрирующих опухоль [1, 8, 9]. Считается, что в данном случае характер экспрессии PD-L1 обусловлен адаптивными процессами и является признаком противоопухолевой иммунной реакции. Учитывая данные обстоятельства, ряд авторов предполагают, что экспрессия PD-L1 в иммунных клетках, инфильтрирующих опухоль, может являться благоприятным прогностическим признаком, и для более полноценной оценки прогноза РМЖ и возможности принятия решения о назначении анти-PD-1/PD-L1-антител при лечении необходимо учитывать уровень экспрессии PD-L1 как в раковых, так и в иммунных клетках микроокружения опухоли [8—11].

Актуальность данного исследования подтверждается тем, что на конгрессе ESMO в 2018 г. доложены первые результаты применения анти-PD-L1-терапии иммуноонкологическим препаратом атезолизумаб при тройном негативном РМЖ [10]. Авторы исследования применили атезолизумаб в комбинации с наб-паклитакселом в первой линии лечения метастатического тройного негативного РМЖ. Их трехфазное исследование проведено на 902 пациентках с метастатическим РМЖ. Средний возраст больных составил 55—56 лет. В исследование включали пациенток с экспрессией PD-L1 более 1%, наличием метастаза в печени без предшествующей химиотерапии. Все пациентки были распределены на две группы в соотношении 1:1. 1-я группа получала 840 мг атезолизумаба в 1-й и 15-й день + 100 мг/м2 наб-паклитаксела в 1, 8, 15-й день каждые 28 дней до начала прогрессирования. 2-я группа получала то же лечение, только вместо атезолизумаба — плацебо. Медиана наблюдения составила 12,9 мес. По результатам исследования назначение атезолизумаба в первой линии терапии снизило риск прогрессирования или смерти на 38% по сравнению с группой плацебо [12].

Материал и методы

Исследование проведено на операционном материале 72 больных РМЖ, проходивших лечение в клинике РМАНПО и Рязанском областном клиническом онкологическом диспансере. Регресс опухоли молочной железы после проведенного неоадъювантного лечения оценивался по системе RCB. Критерием для отбора стал иммуногистохимический статус опухоли: целенаправленно были выбраны люминальные B, HER2-негативные и тройные негативные карциномы по суррогатной молекулярно-биологической классификации. Часть пациенток (n=31) получали неоадъювантную химиотерапию, согласно рекомендациям RUSSCO и NCCN Guidelines. При анализе данных учитывали следующие факторы: возраст, степень дифференцировки (градация), стадию T, выраженность ответа опухоли на неоадъювантную химиотерапию по системе RCB [13] и Г.А. Лавниковой [14].

Весь операционный материал фиксировали в забуференном нейтральном 10% формалине не более 24 ч. Обезвоживание и обезжиривание проводили при помощи автоматизированных процессоров с изопропиловым спиртом. Пропитку парафином проводили при 60 °C, чтобы не допустить перегревания. На изготовленных с полученных блоков срезах проведена иммуногистохимическая реакция с набором PD-L1 ICH 22C3 pharmDx, (SK006, DAKO) в стейнере Avtosteiner Link 48 («Dako») по стандартному протоколу для данного набора не позднее 24 ч после изготовления парафиновых срезов. Для контроля иммуногистохимических реакций параллельно поставлены реакции на контрольных тканях. С этой целью выбраны клеточные линии, прилагаемые к набору, ткани миндалины и плаценты (рис. 1).

Рис. 1. Окрашивание тканевых контролей. а — положительная клеточная линия, ×400; б — отрицательная клеточная линия, ×400; в — плацента, ×100; г — миндалина, ×100.

Учитывая объективную сложность оценки уровня экспрессии PD-L1 в опухолях, ее проводили с привлечением трех экспертов, которые независимо друг от друга оценивали процент окрашенных опухолевых клеток, а также пери- и интратуморальных иммунных клеток. В случае возникновения разногласий у экспертов к консенсусу приходили в процессе коллегиального обсуждения, анализируя не только гистологические препараты, но и отсканированные изображения.

Критерием для позитивного статуса опухоли выбрано полное или частичное мембранное окрашивание не менее 1% опухолевых или иммунных клеток, расположенных интратуморально или не далее 1 мм от границы опухоли. Расчеты проводили отдельно для экспрессии PD-L1 в опухолевых и иммунных клетках (рис. 2, 3).

Рис. 3. Позитивное окрашивание PD-L1 более 1% иммунных клеток, ×100.
Рис. 2. Позитивное окрашивание PD-L1 более 1% опухолевых клеток, ×100.

Методика подсчета позитивных клеток

Ткань РМЖ, окрашенную с помощью набора PD-L1 ICH 22C3 pharmDx, (SK006, DAKO), оценивали поэтапно. На первом этапе исключали из подсчета поля некроза и очаги карциномы in situ (рис. 4).

Рис. 4. Рак молочной железы, окрашивание PD-L1, маркировка зон для подсчета. 1 — граница опухолевой ткани; 2 — зона некроза, исключенная из подсчета; 3 — очаги карциномы in situ, исключенные из подсчета; 4 — зона перитуморальной инфильтрации, расположенная не далее 1 мм от края опухоли.
На втором этапе всю область опухоли и перитуморальной инфильтрации разделили на поля зрения (рис. 5).
Рис. 5. Рак молочной железы, окрашивание PD-L1, разделение площади опухоли на поля зрения.
Далее оценивали собственно клетки РМЖ, определяя долю окрашенных клеток относительно общего количества живых раковых клеток в области опухоли. Позитивно окрашенными считали опухолевые клетки, имеющие полное или частичное окрашивание мембраны любой интенсивности. Допускается окрашивание в виде зерен или гранул, формирующих цепочку по ходу мембраны клетки. Процент окрашенных клеток подсчитывали отдельно для каждого из полей зрения и выводили среднее значение для всего препарата.

Далее провели подсчет иммунных клеток. Позитивно окрашенный лимфоцит, расположенный не далее 1 мм от границы опухоли (рис. 6),

Рис. 6. Рак молочной железы, окрашивание PD-L1, ×50. 1 — опухолевые клетки; 2 — позитивно окрашенные лимфоциты, расположенные на расстоянии более 1 мм, при подсчете не учитываются.
имеет те же критерии окрашивания, что и опухолевая клетка, однако здесь гранулярное окрашивание встречали чаще, чем линейное. Определяли соотношение окрашенных лимфоцитов относительно всех интратуморальных и перитуморальных лимфоцитов.

Стоит отметить особенности выделения оценочных зон в препаратах пациенток, прошедших неоадъювантное лечение. При оценке данного материала зона, занимаемая опухолью, не имеет отношения к первичному ложу опухоли. Подсчет клеток проводили только в той зоне, где остались живые опухолевые клетки (рис. 7).

Рис. 7. Рак молочной железы после проведенного неоадъювантного лечения, окрашивание гематоксилином и эозином. Маркировка площади области опухоли. 1 — оставшиеся после неоадъювантного лечения живые опухолевые клетки; 2 — зона ложа опухоли, инфильтрированная лимфоцитами, ксантомными клетками, не включается в площадь области опухоли.

Результаты и обсуждение

Положительная экспрессия PD-L1 в опухолевых клетках выявлена в 21 (29,17%) из 72 случаев. Обнаружены различия в частоте встречаемости карцином с экспрессией PD-L1 в опухолевых клетках в зависимости от молекулярно-генетического типа: в люминальных B HER2-негативных опухолях положительный PD-L1-статус имели 4 (14,81%) из 27, а в тройных негативных опухолях — 17 (37,78%) из 45. Позитивный статус иммунных клеток наблюдался в 37,04 и 64,44% случаев соответственно (рис. 8, 9).

Рис. 9. Диаграмма распределения позитивного PD-L1 иммунных клеток в зависимости от молекулярно-биологического типа опухоли.
Рис. 8. Диаграмма распределения позитивного PD-L1 опухолевых клеток в зависимости от молекулярно-биологического типа опухоли.

При исследовании взаимосвязи PD-L1-статуса с возрастом и степенью дифференцировки корреляции не обнаружено. Ожидаемая зависимость статуса от стадии T оказалась статистически незначимой (p=0,635), однако была обнаружена слабая зависимость (критерий Спирмена 0,37) между стадией Т и количеством окрашенных лимфоцитов. Возможно, это стало результатом недостаточно широкой выборки (рис. 10).

Рис. 10. Диаграмма, отражающая корреляцию между стадией Т и процентом окрашенных иммунных клеток относительно всей перитуморальной инфильтрации.

При оценке значения PD-L1-статуса опухоли для прогноза течения заболевания пациентов, прошедших неоадъювантное лечение, корреляции при использовании системы Г.А. Лавниковой не получено, и пациенты были разделены на две группы по классу остаточной опухолевой нагрузки RCB: RCB-II и RCB-III (больных со значительной резорбцией опухоли и средней клеточностью менее 10% в исследование не включали). Позитивный статус опухолевых клеток выявлен у 1 из 18 пациенток 1-й группы и 6 из 13 пациенток 2-й группы (5,56 и 46,15% соответственно). Окрашивание не менее 1% иммунных клеток наблюдали в 38,89% случаев RCB-II и в 76,92% RCB-III. Таким образом выявлена значимая корреляция между высокой остаточной опухолевой нагрузкой и позитивным PD-L1-статусом опухоли (p=0,02) (см. таблицу).

Опухоли с позитивным PD-L1-статусом в различных категориях больных

Заключение

Положительный PD-L1-статус опухоли определяли в тройном негативном раке почти в 2,5 раза чаще, чем в люминальном B HER2-негативном. Учитывая более агрессивное течение гормонорезистентного РМЖ, можно предположить, что позитивный PD-L1-статус является признаком худшего прогноза течения заболевания. Об этом же свидетельствует факт, что опухоли, плохо отреагировавшие на классические химиотерапевтические схемы, чаще экспрессируют этот маркер. Стоит отметить и связь между стадией Т с позитивно окрашенными иммунными клетками: опухоли с лучшим прогнозом показывают более высокий уровень экспрессии PD-L1, что не противоречит мнению других исследователей [8—11]. Вместе с тем наличие позитивного PD-L1-статуса опухоли открывает возможности для иммунотерапевтических подходов к лечению этих опухолей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Г. А.Ф., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Сбор и обработка информации — О.А.К., И.Ю.В., М.В.Ш., Е.М.О.

ИГХ-исследование — О.А.К.,.Ю.Ю.А.

Написание текста — О.А.К., М.И.В., Ю.Ю.А.

Редактирование — Г. А.Ф., Л.Э.З., Е.П.К.,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Кузнецова Ольга Александровна — аспирант кафедры патологической анатомии; e-mail: aolga@list.ru; https://orcid.org/0000-0002-9721-6355

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail