Рак молочной железы (РМЖ) в настоящее время является самой распространенной злокачественной опухолью у женского населения (20,9%) и, несмотря на имеющийся прогресс в лечении этого заболевания, продолжает занимать лидирующие позиции среди причин женской смертности от злокачественных новообразований. Во всем мире ежегодно РМЖ диагностируется более чем у 1,7 млн женщин. При этом примерно 25% из них женщины в возрасте до 50 лет и 5% моложе 35 лет. Около 6% пациенток на момент постановки диагноза имеют метастазы, средняя продолжительность жизни таких больных составляет 24 мес, а 5-летняя выживаемость — 21% [1, 2].

В то же время на сегодняшний день возможности морфологической диагностики РМЖ значительно возросли и позволяют получить множество данных, характеризующих биологические свойства опухоли, которые врач-онколог может использовать при оценке прогноза заболевания и выборе лекарственной терапии. В клинической практике принципиальное значение имеет молекулярно-генетический подтип РМЖ, именно он определяет, будет ли опухоль положительно отвечать на ту или иную схему терапии.

В сегодняшней клинической практике широко используется определение молекулярно-генетического подтипа РМЖ с помощью суррогатных иммуногистохимических маркеров, позволяющее выделять следующие биологические подтипы [3, 4]:

— люминальный, А (ER +, HER2-neu-негативный, Ki-67 менее 20%, PgR 20% и более);

— люминальный B, подразделяющийся на HER2-негативный (ER +, HER2-neu-негативный, Ki-67 20% и более, PgR менее 20%) и HER2-позитивный (ER +, HER2-neu — гиперэкспрессия или амплификация, Ki-67 — любой, PgR — любой);

— HER2-neu-позитивный (ER – негативный, HER2-neu — гиперэкспрессия или мплификация, Ki-67 — любой, PgR — негативный);

— тройной негативный, подразделяющийся на небазальный (ER 0, HER2-neu-негативный, Ki-67 — любой, PgR0, CK5/6-негативный) и базальный (ER 0, HER2-neu-негативный, Ki-67 — любой, PgR0, CK5/6-позитивный).

Повышенное внимание к тройному негативному фенотипу обусловлено тем, что этот вариант РМЖ, встречающийся в основном у молодых пациенток, наиболее неблагоприятен по прогнозу в силу агрессивного поведения и ограниченных возможностей фармакотерапии, обусловленных отсутствием в данном фенотипе РМЖ возможных точек приложения для воздействия гормональными и таргетными лекарственными препаратами.

Это обстоятельство диктует необходимость дальнейшего изучения биологических свойств РМЖ, в частности тех, что позволяют опухоли избегать иммунный надзор со стороны организма и, как следствие, прогрессировать и метастазировать, и которые в дальнейшем можно будет использовать в качестве потенциальной мишени для борьбы с опухолью посредством иммунотерапии. Активно ведется поиск новых маркеров РМЖ, уровень экспрессии которых можно будет использовать для прогнозирования течения заболевания и оценки перспективности назначения новых иммунотерапевтических препаратов. Одним из таких маркеров может стать PD-L1, повышенная экспрессия которого является одним из механизмов «обмана» опухолевыми клетками иммунной системы.

Лиганд запрограммированной гибели клеток (PD-L1), он же CD274 и B7-H1 — трансмембранный белок массой 40 кД, кодирующийся геном CD274, располагается на 9-й хромосоме и связывается с клеточным рецептором PD1. Уровень экспрессии этого гена контролируется регуляторным фактором 1 интерферона (IRF1) и STAT1 [1]. Экспрессия PD-L1 выявляется как на опухолевых, так и на иммунных клетках. Коэкспрессия PD-L1 и его рецептора PD-1 является причиной ингибирования пролиферации лимфоцитов, регулируемой рецепторами T-клеток секреции цитокинов [2]. Путь ингибирования PD-1/PD-L1 является ключевым фактором регуляции работы T-лимфоцитов при иммунном ответе, одним из так называемых chekpoint-ингибиторов [5]. В норме он играет критическую роль в предотвращении аутоиммунных реакций и поддержании иммунного гомеостаза [6]. Некоторые опухоли могут экспрессировать белки, подавляющие иммунный ответ, в том числе и PD-L1 [7].

Благодаря достижениям современной фармакологии у человечества появилось такое оружие, как иммунотерапия. Лекарственные препараты, направленные на блокировку рецепторов PD-L1, уже зарегистрированы в России для лечения таких нозологических форм, как немелкоклеточный рак легкого, уротелиальный рак мочевого пузыря, меланома [8, 9].

На сегодняшний день существует несколько моноклональных антител анти-PD-L1 для иммуногистохимического определения экспрессии PD-L1, из которых в России зарегистрированы только три: 22C3 («Dako»), SP142, SP263 («Ventana»), для них разработаны протоколы проведения реакции и системы интерпретации результатов для рака легкого, мочевого пузыря и желудка. Выбор моноклонального антитела влияет на результат реакции и интерпретацию результатов PD-L1-статуса опухоли, однако для РМЖ пороговые значения не утверждены.

При интерпретации результатов иммуногистохимического исследования нужно учитывать, что экспрессия PD-L1 отмечается как в эпителии, так и в строме опухоли, может быть мембранной и цитоплазматической и выявляется только в определенных участках опухоли. Предполагается, это связано с тем, что зона экспрессии PD-L1 в атипичных клетках ограничена областью инвазивного фронта опухоли [1,10]. Также необходимо отметить, что PD-L1 может присутствовать не только в раковых, но и в иммунокомпетентных клетках, инфильтрирующих опухоль [1, 8, 9]. Считается, что в данном случае характер экспрессии PD-L1 обусловлен адаптивными процессами и является признаком противоопухолевой иммунной реакции. Учитывая данные обстоятельства, ряд авторов предполагают, что экспрессия PD-L1 в иммунных клетках, инфильтрирующих опухоль, может являться благоприятным прогностическим признаком, и для более полноценной оценки прогноза РМЖ и возможности принятия решения о назначении анти-PD-1/PD-L1-антител при лечении необходимо учитывать уровень экспрессии PD-L1 как в раковых, так и в иммунных клетках микроокружения опухоли [8—11].

Актуальность данного исследования подтверждается тем, что на конгрессе ESMO в 2018 г. доложены первые результаты применения анти-PD-L1-терапии иммуноонкологическим препаратом атезолизумаб при тройном негативном РМЖ [10]. Авторы исследования применили атезолизумаб в комбинации с наб-паклитакселом в первой линии лечения метастатического тройного негативного РМЖ. Их трехфазное исследование проведено на 902 пациентках с метастатическим РМЖ. Средний возраст больных составил 55—56 лет. В исследование включали пациенток с экспрессией PD-L1 более 1%, наличием метастаза в печени без предшествующей химиотерапии. Все пациентки были распределены на две группы в соотношении 1:1. 1-я группа получала 840 мг атезолизумаба в 1-й и 15-й день + 100 мг/м² наб-паклитаксела в 1, 8, 15-й день каждые 28 дней до начала прогрессирования. 2-я группа получала то же лечение, только вместо атезолизумаба — плацебо. Медиана наблюдения составила 12,9 мес. По результатам исследования назначение атезолизумаба в первой линии терапии снизило риск прогрессирования или смерти на 38% по сравнению с группой плацебо [12].

Материал и методы

Исследование проведено на операционном материале 72 больных РМЖ, проходивших лечение в клинике РМАНПО и Рязанском областном клиническом онкологическом диспансере. Регресс опухоли молочной железы после проведенного неоадъювантного лечения оценивался по системе RCB. Критерием для отбора стал иммуногистохимический статус опухоли: целенаправленно были выбраны люминальные B, HER2-негативные и тройные негативные карциномы по суррогатной молекулярно-биологической классификации. Часть пациенток (n=31) получали неоадъювантную химиотерапию, согласно рекомендациям RUSSCO и NCCN Guidelines. При анализе данных учитывали следующие факторы: возраст, степень дифференцировки (градация), стадию T, выраженность ответа опухоли на неоадъювантную химиотерапию по системе RCB [13] и Г.А. Лавниковой [14].

Весь операционный материал фиксировали в забуференном нейтральном 10% формалине не более 24 ч. Обезвоживание и обезжиривание проводили при помощи автоматизированных процессоров с изопропиловым спиртом. Пропитку парафином проводили при 60 °C, чтобы не допустить перегревания. На изготовленных с полученных блоков срезах проведена иммуногистохимическая реакция с набором PD-L1 ICH 22C3 pharmDx, (SK006, DAKO) в стейнере Avtosteiner Link 48 («Dako») по стандартному протоколу для данного набора не позднее 24 ч после изготовления парафиновых срезов. Для контроля иммуногистохимических реакций параллельно поставлены реакции на контрольных тканях. С этой целью выбраны клеточные линии, прилагаемые к набору, ткани миндалины и плаценты (рис. 1).

Учитывая объективную сложность оценки уровня экспрессии PD-L1 в опухолях, ее проводили с привлечением трех экспертов, которые независимо друг от друга оценивали процент окрашенных опухолевых клеток, а также пери- и интратуморальных иммунных клеток. В случае возникновения разногласий у экспертов к консенсусу приходили в процессе коллегиального обсуждения, анализируя не только гистологические препараты, но и отсканированные изображения.

Критерием для позитивного статуса опухоли выбрано полное или частичное мембранное окрашивание не менее 1% опухолевых или иммунных клеток, расположенных интратуморально или не далее 1 мм от границы опухоли. Расчеты проводили отдельно для экспрессии PD-L1 в опухолевых и иммунных клетках (рис. 2, 3).

Методика подсчета позитивных клеток

Ткань РМЖ, окрашенную с помощью набора PD-L1 ICH 22C3 pharmDx, (SK006, DAKO), оценивали поэтапно. На первом этапе исключали из подсчета поля некроза и очаги карциномы in situ (рис. 4).

На втором этапе всю область опухоли и перитуморальной инфильтрации разделили на поля зрения (рис. 5).

Далее оценивали собственно клетки РМЖ, определяя долю окрашенных клеток относительно общего количества живых раковых клеток в области опухоли. Позитивно окрашенными считали опухолевые клетки, имеющие полное или частичное окрашивание мембраны любой интенсивности. Допускается окрашивание в виде зерен или гранул, формирующих цепочку по ходу мембраны клетки. Процент окрашенных клеток подсчитывали отдельно для каждого из полей зрения и выводили среднее значение для всего препарата.

Далее провели подсчет иммунных клеток. Позитивно окрашенный лимфоцит, расположенный не далее 1 мм от границы опухоли (рис. 6),

имеет те же критерии окрашивания, что и опухолевая клетка, однако здесь гранулярное окрашивание встречали чаще, чем линейное. Определяли соотношение окрашенных лимфоцитов относительно всех интратуморальных и перитуморальных лимфоцитов.

Стоит отметить особенности выделения оценочных зон в препаратах пациенток, прошедших неоадъювантное лечение. При оценке данного материала зона, занимаемая опухолью, не имеет отношения к первичному ложу опухоли. Подсчет клеток проводили только в той зоне, где остались живые опухолевые клетки (рис. 7).

Результаты и обсуждение

Положительная экспрессия PD-L1 в опухолевых клетках выявлена в 21 (29,17%) из 72 случаев. Обнаружены различия в частоте встречаемости карцином с экспрессией PD-L1 в опухолевых клетках в зависимости от молекулярно-генетического типа: в люминальных B HER2-негативных опухолях положительный PD-L1-статус имели 4 (14,81%) из 27, а в тройных негативных опухолях — 17 (37,78%) из 45. Позитивный статус иммунных клеток наблюдался в 37,04 и 64,44% случаев соответственно (рис. 8, 9).

При исследовании взаимосвязи PD-L1-статуса с возрастом и степенью дифференцировки корреляции не обнаружено. Ожидаемая зависимость статуса от стадии T оказалась статистически незначимой (p=0,635), однако была обнаружена слабая зависимость (критерий Спирмена 0,37) между стадией Т и количеством окрашенных лимфоцитов. Возможно, это стало результатом недостаточно широкой выборки (рис. 10).

При оценке значения PD-L1-статуса опухоли для прогноза течения заболевания пациентов, прошедших неоадъювантное лечение, корреляции при использовании системы Г.А. Лавниковой не получено, и пациенты были разделены на две группы по классу остаточной опухолевой нагрузки RCB: RCB-II и RCB-III (больных со значительной резорбцией опухоли и средней клеточностью менее 10% в исследование не включали). Позитивный статус опухолевых клеток выявлен у 1 из 18 пациенток 1-й группы и 6 из 13 пациенток 2-й группы (5,56 и 46,15% соответственно). Окрашивание не менее 1% иммунных клеток наблюдали в 38,89% случаев RCB-II и в 76,92% RCB-III. Таким образом выявлена значимая корреляция между высокой остаточной опухолевой нагрузкой и позитивным PD-L1-статусом опухоли (p=0,02) (см. таблицу).

Заключение

Положительный PD-L1-статус опухоли определяли в тройном негативном раке почти в 2,5 раза чаще, чем в люминальном B HER2-негативном. Учитывая более агрессивное течение гормонорезистентного РМЖ, можно предположить, что позитивный PD-L1-статус является признаком худшего прогноза течения заболевания. Об этом же свидетельствует факт, что опухоли, плохо отреагировавшие на классические химиотерапевтические схемы, чаще экспрессируют этот маркер. Стоит отметить и связь между стадией Т с позитивно окрашенными иммунными клетками: опухоли с лучшим прогнозом показывают более высокий уровень экспрессии PD-L1, что не противоречит мнению других исследователей [8—11]. Вместе с тем наличие позитивного PD-L1-статуса опухоли открывает возможности для иммунотерапевтических подходов к лечению этих опухолей.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Г. А.Ф., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Сбор и обработка информации — О.А.К., И.Ю.В., М.В.Ш., Е.М.О.

ИГХ-исследование — О.А.К.,.Ю.Ю.А.

Написание текста — О.А.К., М.И.В., Ю.Ю.А.

Редактирование — Г. А.Ф., Л.Э.З., Е.П.К.,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Кузнецова Ольга Александровна — аспирант кафедры патологической анатомии; e-mail: aolga@list.ru; https://orcid.org/0000-0002-9721-6355