Аксененко М.Б.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, 660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1, Российская Федерация

Шестакова Л.А.

Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова

Рукша Т.Г.

ГОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого

Экспрессия каспазы-3 в тканях экспериментальной меланомы и ее метастазов при ингибировании матриксной металлопротеиназы-9

Журнал: Архив патологии. 2013;75(1): 19-23

Просмотров : 15

Загрузок :

Как цитировать

Аксененко М. Б., Шестакова Л. А., Рукша Т. Г. Экспрессия каспазы-3 в тканях экспериментальной меланомы и ее метастазов при ингибировании матриксной металлопротеиназы-9. Архив патологии. 2013;75(1):19-23.

Авторы:

Аксененко М.Б.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, 660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1, Российская Федерация

Все авторы (3)

Матриксная металлопротеиназа-9 (ММП-9) — фермент, относящийся к представителям семейства цинкзависимых эндопептидаз, способных к деградации структурных компонентов базальной мембраны и внеклеточного матрикса [1]. Кроме способности индуцировать деградацию компонентов межклеточного матрикса, отмечено участие ММП-9 в аутокринном типе регуляции апоптоза, а также клеточной пролиферации и дифференцировке [2]. Имеются данные о том, что ингибирование экспрессии ММП-9 приводит к изменению активности других ферментов, в частности каспаз и антиоксидантных ферментов [3]. Описана активация каспазного каскада в клетках органов при изменениях экспрессии ММП-9 [4]. Каспаза-3 является одним из ферментов, принимающих участие в развитии апоптоза, нарушения которого регистрируются при онкологических заболеваниях. Результаты исследований показывают, что реализация программы апоптоза происходит при помощи активации семейства протеаз—каспаз и активация каспаз приводит к апоптозу [5]. Каспаза-3 наиболее часто активируется при апоптозе, что позволяет считать этот фермент одним из важнейших участников запрограммированной клеточной гибели. В исследованиях последних лет большую роль отводят неапоптотической роли каспазы-3, которая может выполнять в определенных ситуациях антиапоптотическую функцию и даже регулировать клеточный цикл [6]. Каспаза-3 играет важную роль в состоянии цитокинов. Синтезируемый клеткой в виде неактивной проформы интерлейкин-16 расщепляется и приобретает активную конформацию в результате ограниченного протеолиза, осуществляемого каспазой-3 [7]. В ряде публикаций подчеркнуто сходство механизмов дифференцировки и апоптоза в клетках различного происхождения, что подтверждает несомненную роль каспазы-3 для дифференцировки клеток разных линий.

Целью настоящего исследования стало изучение особенностей экспрессии каспазы-3 нормальными тканями организма, а также клетками меланомы кожи в условиях снижения активности ММП-9 in vivo.

Материал и методы

В эксперименте использовали 8-недельных мышей-самок линии C57Bl6. Животные получены из Научного центра биомедицинских технологий РАМН (филиал «Столбовая»). Культура клеток меланомы В16 получена в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва). При работе с экспериментальными животными соблюдали основные принципы, изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (2007 г.), а также в приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Животных содержали при естественном освещении со свободным доступом к воде и пище. Случайным образом они были разделены на 2 группы (контрольную и опытную), по 10 животных в каждой. Перевивка опухоли производилась путем подкожного введения 0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса (1:10) по стандартным методикам. На 10-е сутки после трансплантации опухоли животным опытной группы было начато введение 5 нМ ингибитора MMП-9 I («Calbiochem»; 0,3 мл внутримышечно ежедневно однократно, в течение 7 сут). Все животные находились в эксперименте до естественной гибели. Внутренние органы животных забирали в течение 30 мин после их гибели. Исследовали препараты опухолевой ткани, легких, печени, селезенки, почек, сердца.

Материал фиксировали в 10% забуференном формалине. Срезы толщиной до 5 мкм подвергали иммуногистохимическому окрашиванию по стандартной методике с моноклональными антителами к каспазе-3 («Novocastra», разведение 1:100). Для визуализации использовали систему детекции ready-to-use («Novocastra») и диаминобензидин («Novocastra») в качестве хромогена. В дальнейшем срезы докрашивали гематоксилином. Положительно окрашенные клетки подсчитывали при увеличении 400 с помощью микроскопа Olympus BX-41. Оценивали количество положительно окрашенных клеток отдельно в опухолевых клетках, в том числе в клетках метастазов меланомы кожи и непораженной метастазами ткани органа. Интенсивность окрашивания оценивали в баллах: 0 — отсутствие окрашивания, 1 — слабое окрашивание, 2 — умеренное окрашивание, 3 — выраженное окрашивание. Интенсивность иммуногистохимической реакции оценивали по методу гистологического счета H-score по формуле: S=1a+2b+3c, где а — процент слабоокрашенных ядер клеток, b — процент умеренноокрашенных ядер клеток, с — процент сильноокрашенных ядер клеток [8]. Определяли степень выраженности экспрессии ММП-9: 0—10 баллов — отсутствие экспрессии, 11—100 — слабая экспрессия, 101—200 — умеренная, 201—300 — выраженная.

Для всех данных определяли медиану и интерквартильный разброс в виде подсчета 25- и 75-процентилей. Для оценки достоверности различий между группами использовали критерий Манна—Уитни.

Результаты и обсуждение

Во всех изученных нами образцах в цитоплазме клеток при микроскопическом исследовании наблюдалось характерное иммуногистохимическое окрашивание. При оценке экспрессии каспазы-3 в опухолевых клетках нами не выявлено значимых различий между исследуемыми группами (см.таблицу).

Данный факт свидетельствует об отсутствии влияния ингибирования ММП-9 на изменения выраженности экспрессии каспазы-3 при меланоме кожи. При исследовании легочной ткани у животных контрольной и опытной групп были выявлены множественные очаги роста опухолевой ткани, представленные участками темно-коричневого цвета (рис. 1).
Рисунок 1. Легочная ткань животного контрольной группы. Множественные пигментные метастазы меланомы. Окраска гематоксилином и эозином. ×100.
Межальвеолярные дольки были несколько утолщены, экспрессия каспазы-3 наблюдалась как в нормальной легочной ткани, так и в клетках метастазов (рис. 2).
Рисунок 2. Экспрессия каспазы-3 в легочной ткани животного контрольной группы. Иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к каспазе-3. ×100.
В просвете бронхов и альвеол выявлялись небольшое количество фибринозного экссудата и единичные сегментоядерные лейкоциты (рис. 3).
Рисунок 3. Легочная ткань животного опытной группы. Окраска гематоксилином и эозином. ×400.
Выявлено значимое увеличение экспрессии каспазы-3 в опытной группе по сравнению с контролем как в опухолевых клетках, так и в непораженной ткани легких (см. таблицу, рис. 4).
Рисунок 4. Экспрессия каспазы-3 в легочной ткани животного опытной группы. Иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к каспазе-3. ×400.
Кроме того, выявлены значимые увеличения экспрессии в клетках метастазов по сравнению с легочной тканью. Увеличение экспрессии каспазы-3 у животных с меланомой кожи может быть связано с развитием у них дыхательной недостаточности вследствие большой площади поражения легочной ткани метастазами меланомы и развитием гипоксии. Этот факт подтверждает аналогичное увеличение каспазы-3 при других формах легочной патологии, сопровождающееся развитием дыхательной недостаточности, таких как острый респираторный дистресс-синдром новорожденных [9] и тяжелая длительная гипероксия, сопровождаемая воспалительной реакцией с явлениями клеточной пролиферации и гипертрофии, увеличением цитокинов, стимуляцией апоптоза и последующими морфологическими признаками повреждения клеток, а также увеличением экспрессии каспазы-3 [10]. При этом имеются данные о взаимосвязи ингибирования ММП-9 и увеличения экспрессии каспазы-3: ингибирование ММП-9 с помощью малых интерферирующих РНК вызывает апоптоз клеток человеческой глиобластомы и увеличение экспрессии каспазы-3 [11]. При гистологическом исследовании ткани печени у животных контрольной и опытной групп в синусоидах и портальных трактах было выявлено скопление опухолевых клеток (рис. 5).
Рисунок 5. Ткань печени животного опытной группы. В центре препарата представлены опухолевые клетки. Окраска гематоксилином и эозином. ×400.
В обеих группах наблюдалась слабая экспрессия каспазы-3 как в опухолевых клетках, так и в клетках гепатоцитов (рис. 6),
Рисунок 6. Экспрессия каспазы-3 в ткани печени животного опытной группы. Единичные положительно окрашенные клетки. Иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к каспазе-3. ×400.
но у животных опытной группы она была значимо ниже. Различий между экспрессией каспазы-3 в опухолевых клетках и клетках печени не выявлено (см. таблицу). По данным литературы, у животных при ингибировании каспазы-3 увеличивается продолжительность жизни по сравнению с группой контроля из-за увеличения времени гибели гепатоцитов [12]. При ингибировании активности ММП-9 значимых различий в данном органе не наблюдалось. При гистологическом исследовании селезенки выявлено увеличение экспрессии каспазы-3 в опухолевых клетках по сравнению с экспрессией каспазы-3 лимфоцитами селезенки (рис. 7, 8),
Рисунок 7. Ткань селезенки животного опытной группы. Метастатическое поражение. Окраска гематоксилином и эозином. ×400.
Рисунок 8. Экспрессия каспазы-3 в лимфоцитах селезенки у животного опытной группы. Множественные положительно окрашенные клетки. Иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к каспазе-3. ×400.
значимых различий между изучаемыми группами не выявлено (см. таблицу). В тканях сердца при исследовании обнаружены единичные положительно окрашенные клетки без метастазов в этом органе. Достоверных различий по данным экспрессии каспаза-3 в тканях сердца между исследуемыми группами также не выявлено (см. таблицу). В целом реакция на всех микропрепаратах расценивалась как отрицательная. При исследовании экспрессии каспазы-3 в тканях почек наблюдалось увеличение содержания изучаемого фермента в опытной группе по сравнению с контрольной (см. таблицу). Экспрессия данного фермента в опытной группе расценивалась как умеренная и была неравномерно распределена во всех почечных структурах. Таким образом, в капсуле и сосудистом клубочке, проксимальных извитых и прямых канальцах, в дистальных извитых канальцах, а также петле нефрона экспрессия каспазы-3 была отрицательной (рис. 9—11).
Рисунок 9. Почечное тельце (капсула клубочка и сосудистый клубочек). Экспрессия каспазы-3 отсутствует. Иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к каспазе-3. ×400.
Рисунок 10. Собирательные трубочки почки у животного опытной группы. Экспрессия каспазы-3 отсутствует. Иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к каспазе-3. ×400.
Рисунок 11. Проксимальные и дистальные извитые канальцы почки у животного опытной группы. Иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к каспазе-3. ×400.
Выраженная же экспрессия каспазы-3 наблюдалась в дистальных прямых канальцах у животных опытной группы (рис. 12).
Рисунок 12. Дистальные прямые канальцы почки у животного опытной группы. Множественные положительно окрашенные клетки. Иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к каспазе-3. ×400.
В контрольной группе повышенной экспрессии каспазы-3 в данных почечных структурах не выявлено. Известно, что функцией дистальных прямых канальцев является реабсорбция электролитов: активная, стимулируемая альдостероном, и пассивная, стимулируемая антидиуретическим гормоном. Увеличение выраженности апоптоза в данных морфоструктурах может определяться при развитии острой почечной недостаточности, нефросклерозе [13]. В данном случае селективное увеличение экспрессии в дистальных прямых канальцах может быть связано с определенным нефротоксичным эффектом ингибитора ММП-9, вводимого экспериментальным животным. В свою очередь, отсутствовали другие признаки токсической нефропатии — скопление белковой жидкости в просвете клубочка, отек цитоплазмы и эпителия проксимальных канальцев, что позволяет говорить о невыраженной нефротоксичности ингибитора.

Заключение

Таким образом, изучив особенности экспрессии каспазы-3 в различных органах экспериментальных животных при ингибировании ММП-9, можно отметить, что наибольшие изменения затрагивали органы, в которых обнаруживались метастазы меланомы — легкие, печень и селезенку, в которых и были выявлены значимые различия между контрольной и опытной группами (p<0,05), в отличие от сердечной и почечной тканей, где подобных различий не отмечалось. Полученные данные свидетельствуют о неселективном эффекте ММП-9 в отношении каспазы-3, что может приводить к развитию побочных эффектов при использовании ингибиторов ММП-9 в качестве противоопухолевых средств.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail