Морфометрическая характеристика неоваскуляризации атеросклеротических бляшек каротидного синуса

В развитии и прогрессировании атеросклероза ведущую роль отводят липопротеидам и макрофагам, накопление которых в интиме артерии приводит к ее утолщению с повышением потребности в кислороде и активации индуцируемого гипоксией фактора (HIF_1α) в клетках. HIF в свою очередь активирует систему сосудистых эндотелиальных факторов роста и их рецепторов (VEGF/VEGFR), запускающих процессы ангиогенеза [1]. Путь HIF/VEGF является классическим механизмом адаптивного ангиогенеза в физиологических условиях. В норме при восстановлении содержания кислорода в ткани HIF_1α разрушается, что приводит к снижению продукции ангиогенных молекул с одновременным повышением экспрессии ангиостатических молекул, подавляющих ангиогенез и стабилизирующих новообразованные сосуды.

Ангиогенез при атеросклерозе исходно индуцируется как защитный механизм, направленный на восстановление оксигенации и регенерацию интимы. Однако различные стимулы, например воспаление и окислительный стресс, могут поддерживать длительный ангиогенный ответ, который приобретает патологический характер в связи с отсутствием фазы разрешения и стабилизации новообразованных сосудов и приводит к разрастанию «незрелой» сосудистой сети [2]. До 80% новообразованных сосудов в атеросклеротических бляшках, по данным некоторых авторов [3], характеризуется нарушением целости эндотелиальной выстилки и межэндотелиальных контактов, отсутствием перицитов, что обусловливает их сниженную механическую прочность и склонность к разрыву, повышенную проницаемость для клеток крови и кровоизлияния в бляшку, стимулирующие воспаление, окислительный стресс и дальнейшее прогрессирование атеросклероза [3]. Тем не менее в значительном числе случаев наблюдается спонтанная стабилизация атеросклеротического процесса с резорбцией очагов атероматоза, ослаблением воспалительной реакции и фиброзом, при этом стабильные фиброзно-кальцинозные бляшки, по данным P. Moreno [4], содержат наименьшее количество сосудов, что указывает на инволюцию ангиогенеза после утилизации атероматозных масс. Кроме того, в ряде исследований на животных и у человека продемонстрировано, что ангиогенез в бляшке может играть важную роль в удалении макрофагами холестерина и продуктов распада гемоглобина из бляшки [5, 6]. С учетом изложенного, а также противоречивых данных о связи неоваскуляризации и общепризнанных маркеров нестабильной структуры бляшки каротидного синуса (атероматоз, макрофагальная реакция, кровоизлияние) вопрос о роли неоваскуляризации бляшки в прогрессировании церебрального атеросклероза остается дискутабельным и требует дальнейшего всестороннего изучения.

Цель — определение связи между степенью выраженности неоваскуляризации атеросклеротической бляшки и таких процессов в ней, как атероматоз, макрофагальная реакция, кровоизлияния и обызвествление.

В исследование включены 45 пациентов (32 мужчины и 13 женщин; средний возраст 64±10 лет) с атеростенозом каротидного синуса, степень выраженности которого по данным ультразвукового дуплексного сканирования составила 50% и более (79±11%). Выполнено 48 операций каротидной эндартерэктомии (у 3 пациентов — с двух сторон) с последующим патоморфологическим исследованием атеросклеротических бляшек каротидного синуса на всем их протяжении. Бляшки в зависимости от длины разрезали на 4—9 блоков толщиной 0,3 см в плоскости, перпендикулярной оси сосуда; блоки заливали в парафин. Срезы с каждого блока окрашивали гематоксилином и эозином и по ван Гизону, после чего сканировали с помощью аппарата Aperio AT2 («Leica Biosystems», Германия) при 400-кратном увеличении изображения.

Структуру бляшек анализировали в программе Aperio ImageScope («Leica Biosystems», Германия) версии 11.2.0.780. Сосуды определяли как выстланные эндотелием структуры, имеющие просвет. Оценивали общую плотность расположения сосудов на 1 см² бляшки (результат деления общего количества сосудов во всех срезах на сумму площадей этих срезов), локализацию в срезе (поверхностная, центральная или глубокая треть), плотность расположения сосудов определенного диаметра (<20, ≥20, ≥30, ≥40, ≥50, ≥60, ≥70, ≥80 мкм). При косом или продольном сечении сосуда его диаметр определяли как поперечный размер в наиболее широком участке. Наряду с сосудами оценивали объемную долю атероматоза (ОДА) в бляшке — сумма площадей очагов атероматоза во всех срезах, деленная на сумму площадей бляшки также во всех срезах и умноженная на 100%. Для межгруппового анализа степень выраженности атероматоза оценивали по шкале от 0 до 3 баллов, где 0 — отсутствие, 1 — ОДА менее 20%, 2 — ОДА от 20 до 40%, 3 — ОДА более 40%. Проводили полуколичественную оценку (в баллах) обызвествления, кровоизлияния и липофагов: — обызвествление — отсутствие — 0, мелкие кальцификаты или пылевидное обызвествление отдельных волокон —1, единичные крупные кальцификаты или значительное количество мелких кальцификатов/обызвествленных волокон, площадь которых в срезе составляла менее25% — 2, многочисленные кальцификаты разной величины или обширные поля пылевидного обызвествления волокон, занимающие 25—50% среза, — 3, массивные кальцификаты, занимающие более 50% среза, — 4; — кровоизлияния с разной степенью организации (при выраженной организации учитывали количество сидерофагов и гемосидерина) — отсутствие — 0, отдельные небольшие кровоизлияния — 1, значительное количество небольших кровоизлияний, занимающих менее 25% площади среза, — 2, многочисленные небольшие кровоизлияния, занимающие 25—50% среза, — 3, массивные кровоизлияния, площадь которых в срезе составляла более 50% — 4; — липофаги — отсутствие — 0, единичные клетки — 1, небольшие группы — 2, умеренное количество небольших скоплений, занимающих менее 25% площади среза, — 3, многочисленные крупные скопления, площадь которых в срезе составляла 25—50%, — 4, массивные скопления, занимающие более 50% среза, — 5.

Степень выраженности указанных компонентов в бляшке определяли как отношение суммированного показателя в баллах к количеству срезов. Статистическую обработку результатов проводили в пакете Statistica 10.0 («StatSoft», США). Для выявления статистических различий и корреляционных связей применяли соответственно непараметрический U-критерий Манна — Уитни и коэффициент корреляции Спирмена. Во всех случаях порог статистической значимости (р) составлял 0,05.

Проведен анализ структуры 48 атеросклеротических бляшек каротидного синуса. Сосуды обнаружены во всех бляшках, при этом их диаметр и плотность расположения в 1 см² бляшки варьировали в широких пределах, достигая 323 мкм и 1224 сосудов. Преобладали сосуды диаметром менее 20 мкм; с увеличением диаметра сосудов их количество в бляшке прогрессивно снижалось (табл. 1).

В большинстве бляшек сосуды были определены в поверхностной, центральной и глубокой частях; только в 3 случаях они выявлены исключительно в глубине бляшек. Сосуды, как правило, располагались в очагах скопления липофагов по периферии атероматоза, в области кровоизлияний вне зависимости от степени их организации, а также по периферии кальцификатов (см. рисунок).

В результате исследования выявлена значительная вариабельность степени выраженности атероматоза, кровоизлияний, обызвествления и количества липофагов (табл. 2).

Установлено, что степень выраженности кровоизлияний и количество липофагов не имели статистической связи с плотностью расположения сосудов, но коррелировали с их локализацией в бляшке, т. е. размер и количество кровоизлияний, а также скоплений липофагов возрастали по мере увеличения плотности сосудов в центральных и поверхностных участках бляшки (r=0,496; p=0,000342).

Не выявлено статистически значимых различий в степени выраженности васкуляризации между бляшками с очагами атероматоза и без таковых. Вместе с тем при наличии в бляшках атероматоза установлен отрицательный линейный характер зависимости между ОДА и общей плотностью расположения сосудов (r=-0,32; р=0,028). При этом с повышением выраженности атероматоза статистически значимо снижалось количество сосудов диаметром более 20 мкм в 1 см² бляшки (r=-0,49; р=0,00042), тогда как изменение плотности более мелких сосудов было статистически незначимым (r=-0,25; р=08). Статистический анализ показал, что в бляшках с ОДА более 40% выявлялось меньше сосудов диаметром более20мкм, чем в бляшках без очагов атероматоза (р=0,01). Бляшки с ОДА до 20% не отличались по общей плотности сосудов от бляшек без атероматоза, но содержали больше сосудов диаметром более20мкм по сравнению с бляшками, в которых ОДА составляла 20—40% и более (р<0,0034). Следует отметить, что бляшки с ОДА до 20% в большинстве случаев были слабо инфильтрированы липофагами (1 балл) и имели умеренную или выраженную степень обызвествления (2—3 балла), тогда как макрофагальная реакция при ОДА 20—40% и более была, как правило, довольно выражена (2—3 балла). Обращает на себя внимание тот факт, что, несмотря на снижение плотности сосудов в бляшке по мере усиления атероматоза, пропорционально повышению ОДА увеличивалась и степень выраженности кровоизлияний в бляшку (r=0,5; р<0,003).

Бляшки с выраженным обызвествлением, включая массивные кальцификаты (3—4 балла), содержали больше сосудов диаметром более 40 мкм (р<0,038), особенно сосудов диаметром более 60 мкм (р=0,006) по сравнению с умеренно обызвествленными бляшками (2 балла) и вместе с тем они статистически значимо не отличались по степени васкуляризации от бляшек с легкой степенью обызвествления (1 балл). При этом в бляшках с выраженным обызвествлением ОДА и количество липофагов было ниже, чем в случаях с меньшей степенью обызвествления (р<0,05). В свою очередь бляшки с легкой степенью обызвествления были крайне вариабельны в отношении макрофагальной реакции, ОДА и выраженности кровоизлияний.

Сопоставление степени выраженности неоваскуляризации и других основных структурных компонентов атеросклеротических бляшек каротидного синуса, удаленных при операции каротидной эндартерэктомии, показало, что плотность расположения сосудов не коррелирует со степенью выраженности кровоизлияний в бляшку и количеством липофагов, а также не различается в фиброзных/фиброзно-кальцинозных и атероматозных бляшках. Это свидетельствует об отсутствии прямой связи между неоваскуляризацией бляшки и общепризнанными маркерами ее нестабильной структуры, а именно атероматозом, макрофагальной реакцией и кровоизлиянием, степень выраженности которых отличалась сильной корреляцией. В связи с этим подвергается сомнению целесообразность использования оценки выраженности неоваскуляризации бляшки как маркера риска развития инсульта наравне с названными процессами, что активно обсуждалось в литературе до недавнего времени. Это предположение было основано на результатах экспериментальных, клинических и клинико-морфологических исследований, свидетельствующих об активации деструктивных процессов, воспаления и ангиогенеза вблизи участков атеросклеротической бляшки с признаками гипоксии [7, 8], увеличении плотности микрососудов в изъязвленных бляшках [4], неполноценной структуре новообразованных сосудов, сопряженной с повышенным риском кровоизлияний в бляшку и, следовательно, прогрессирования атеросклероза [3] и др. Вместе с тем морфологические исследования были весьма немногочисленны и основаны на анализе небольшого числа случаев с преимущественно избирательным анализом наиболее измененного, по мнению исследователя, участка бляшки, что накладывало ограничения при экстраполяции полученного результата на всю бляшку. Проведенный нами анализ продемонстрировал значительную вариабельность сочетания и степени выраженности основных структурных компонентов бляшки, в том числе неравномерное распределение липофагов и новообразованных сосудов с тенденцией к формированию скоплений различного размера, что подчеркивает необходимость анализа большой серии наблюдений с оценкой бляшки на всем ее протяжении для получения достоверных результатов.

В последние несколько лет однозначная трактовка роли неоваскуляризации как фактора риска осложненных атеросклеротических поражений (изъязвление покрышки, кровоизлияние в бляшку и атеротромбоз) подвергается сомнению, что в значительной степени связано с проведением более масштабных морфологических исследований и клинико-морфологических сопоставлений. Особое внимание в этих исследованиях уделено связи между признаками воспаления и сосудами бляшки, и эта связь оказалась весьма неоднозначной. В ряде клинических исследований показана отчетливая связь повышенного риска развития инсульта с воспалительными изменениями и отсутствие его связи со степенью неоваскуляризации бляшки [9, 10]. Некоторые авторы [11] установили слабую зависимость между воспалением и неоваскуляризацией бляшки, что противоречит данным других авторов [12]. Мы не обнаружили связи между выраженностью неоваскуляризации и количеством липофагов в бляшках, что соответствует результатам наиболее крупного в настоящее время клинико-морфологического сопоставления, в котором оценена степень выраженности различных структурных компонентов в 30 бляшках каротидного синуса, включая новообразованные сосуды [9]. Отсутствие прямой связи между неоваскуляризацией и воспалением может быть обусловлено неоднородностью популяции макрофагов в бляшке, в которой сосуществуют клетки как с проатерогенными (фенотипы М1 и Мох), так и с атеропротективными (фенотипы М2 и Mhem) свойствами [13—17]. При этом относительный избыток атеропротективных макрофагов, по данным некоторых авторов [13], является более надежным, чем общее число макрофагов, индикатором стабильной структуры бляшки. Следует подчеркнуть, что эти популяции макрофагов не статичны, и при изменении микроокружения могут поменять свой фенотип с провоспалительного (М1) на противовоспалительный (М2) [18]. В связи с этим в исследованиях, направленных на изучение характера связи между воспалением и неоваскуляризацией бляшки, представляется целесообразным учитывать фенотипические особенности макрофагов.

Установлено, что макрофаги фенотипа Mhem обладают противовоспалительными свойствами, не формируют пенистых клеток и считаются атеропротективными. Кроме того, J. Boyle и соавт. [16, 17] отметили, что кровоизлияние в бляшку индуцирует образование макрофагов фенотипа Mhem, которые вовлечены в клиренс гемоглобина; позднее это подтвердили А. Finn и соавт. [19]. Эти данные свидетельствуют, что кровоизлияние в бляшку не обязательно связано с дестабилизацией ее структуры. В то же время ранее была показана связь геморрагии с быстрым прогрессированием атеросклероза, в том числе в результате увеличения объема «липидного ядра» [20], что с учетом выявленной прямой зависимости между степенью выраженности кровоизлияний и атероматоза также нашло косвенное подтверждение в настоящем исследовании. Мы не выявили зависимости между степенью выраженности кровоизлияний и количеством новообразованных сосудов в бляшке, это согласуется с результатами исследований других авторов [9] и может указывать на то, что в патогенезе кровоизлияний первоочередную роль играет, вероятно, не количество сосудов, а повышение их проницаемости, связанное с повышением экспрессии VEGF макрофагами при воспалительной реакции в бляшках [21]. В свою очередь ослабление воспалительного ответа с изменением цитокинового профиля может привести к восстановлению равновесия между ангиогенными и ангиостатическими факторами с формированием развитой зрелой сосудистой сети, которая может принимать активное участие в репаративных процессах.

По данным некоторых авторов [22, 23], появление М2-подобных макрофагов (Mhem) связано не только с кровоизлиянием в бляшку, но и с ее обызвествлением. F. Demeure и соавт. [9] выявили обратную зависимость между выраженностью обызвествления и воспаления в бляшке, а также отсутствие корреляции между степенью обызвествления и количеством сосудов в бляшке, что полностью подтверждено в настоящем исследовании и согласуется с обсуждаемой в литературе гипотезой о связи выраженного обызвествления преимущественно со стабилизацией атеросклеротического процесса, а не с активным воспалением. С учетом этой гипотезы, выявленное статистически значимое увеличение количества сосудов диаметром более 40 мкм и особенно более 60 мкм, возникающее при повышении степени обызвествления, а также преимущественная локализация таких сосудов вне очагов активной макрофагальной реакции позволяют утверждать, что сосуды крупного калибра могут выступать в качестве индикаторов стабилизации атеросклеротического процесса или запуска репаративных процессов в бляшке. Косвенным подтверждением такого предположения может служить снижение количества сосудов диаметром более 20 мкм при повышении количества атероматозных масс, т. е. с усилением одного из наиболее значимых деструктивных процессов в бляшках. Количество мелких сосудов (диаметром до 20 мкм), расположенных преимущественно в очагах скопления макрофагов по периферии атероматоза или организующихся кровоизлияний, уменьшается с усилением обызвествления, в связи с чем такие сосуды, вероятно, могут рассматриваться в качестве индикаторов повышения активности процесса.

При оценке активности атеросклероза определенное значение может иметь не только калибр новообразованных сосудов, но и особенности их локализации в бляшке, поскольку, как показало исследование, увеличение плотности сосудов в более поверхностных отделах бляшки может быть маркером повышенного риска кровоизлияний и активации макрофагальной реакции. Полученные нами результаты могут иметь важное значение в уточнении протокола исследования и критериев оценки неоваскуляризации ультразвуковым методом с контрастным усилением, возможности которого активно обсуждаются в последние годы.

В исследовании установлено отсутствие четкой прямолинейной зависимости между степенью выраженности неоваскуляризации атеросклеротической бляшки и таких процессов в ней, как атероматоз, макрофагальная реакция, кровоизлияния и обызвествление. Полученные результаты позволяют предположить, что совокупность характеристик неоваскуляризации атеросклеротической бляшки каротидного синуса (количество, диаметр и расположение сосудов) является динамическим отражением происходящих в ней деструктивных и репаративных процессов, и повышение количества сосудов более крупного калибра (более 40 мкм и особенно более 60 мкм) может иметь прогностическое значение как индикатор активации репаративных процессов и соответственно более благоприятного течения атеросклероза. Локализация сосудов преимущественно в поверхностных участках бляшки в свою очередь может служить предиктором активации атеросклероза в виде усиления макрофагальной реакции и развития кровоизлияний.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Н.Е.

Сбор и обработка материала — А.Н.Е.

Статистическая обработка — А.Н.Е.

Написание текста — А.Н.Е., П.Л.А., К.Н.К.

Редактирование — Т.С.Г., М.М.Т.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Евдокименко Анна Николаевна — к.м.н., ученый секретарь, научный сотрудник лаборатории патологической анатомии; e-mail: annevdokimenko@gmail.com; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2880-0547