Болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), с проявлениями микобактериальной инфекции, является серьезной проблемой глобального здравоохранения [1]. Заболеваемость туберкулезом (ТБ) среди больных ВИЧ-инфекцией существенно увеличилась в последние несколько лет, что позволяет предположить общие социальные и патогенетические закономерности развития коинфекции ВИЧ/ТБ и взаимном влиянии рассматриваемых возбудителей [2]. По оценкам ВОЗ, в 2010—2011 гг. зарегистрировано 8,8—8,7 млн случаев заболевания и 1,45—1,4 млн смертей от туберкулеза ежегодно, 0,35 млн в год из этих умерших пациентов были ВИЧ-позитивны [3, 4]. Особенностью клинико-морфологической картины сочетанной коинфекции ВИЧ/ТБ является частая генерализация туберкулезного процесса с множественной гематогенной диссеминацией микобактерий туберкулеза (МБТ) с образованием гранулем туберкулоидного типа, а также инфильтратов в различных органах, что обусловлено как иммунодефицитным состоянием, так и взаимным влиянием двух инфекций [5, 6]. Важнейшим фактором защиты развивающегося специфического воспаления при ТБ являются макрофаги, осуществляющие различные функции (фагоцитарная, антигенпрезентирующая, секреторная, бактерицидная, репаративная и др.) и поддерживающие с другими иммунными клетками необходимый баланс между контролем инфекции, разрушением собственных тканей, а также МБТ [7]. Фагоцитарной активности фагоцитов при ВИЧ и ТБ в последнее время посвящен ряд исследований, особое значение в которых имеет изучение роли миелопероксидазы (МПО), являющейся основой бактерицидной системы гистиоцитов, гранулоцитов и осуществляющей начальное разрушение микобактерий, без чего невозможно их дальнейшее переваривание [8, 9]. Выявлено, что при снижении активности МПО наблюдалась более длительная персистенция МБТ в макрофагах зараженных животных [8, 9] и, напротив, отмечена нормализация высокого уровня МПО при проведении противотуберкулезного лечения [9].

Таким образом, при морфологическом исследовании, которое может дать ценную динамическую характеристику состояния сочетающихся патологических процессов при ВИЧ-ассоциированном ТБ, для характеристики бактерицидной системы макрофагов необходимо исследование выраженности экспрессии МПО [3, 7].

Цель исследования — охарактеризовать морфологические особенности воспаления и степень экспрессии МПО в легких больных, умерших от ВИЧ-ассоциированного ТБ.

Исследовано 229 аутопсийных случаев с ВИЧ-инфекцией и с развившимся ТБ легких в качестве вторичного заболевания. У пациентов, проходивших обследование и лечение на базе ГУЗ «Волгоградский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями», не было выявлено других инфекционных заболеваний.

Умершие от ВИЧ-ассоциированного верифицированного ТБ были разделены на 3 группы в зависимости от стадии болезни, вызванной ВИЧ (согласно данным медицинской документации): 1-я группа (50 случаев) — стадия 4А—4Б, количество CD4⁺-лимфоцитов более 200 клеток/мкл; 2-я группа (54 случая) — стадия 4Б—4 В, количество CD4⁺-лимфоцитов в диапазоне от 100 до 200 клеток/мкл; 3-я группа (125 случаев) — стадия 4В—5, количество CD4⁺-лимфоцитов менее 100 клеток/мкл.

Образцы легких извлекали из трупов по общепринятым в патологической анатомии методикам в ранние сроки после смерти больного, фиксировали в 10% растворе забуференного формалина в течение 24—48 ч при комнатной температуре, обрабатывали по стандартной методике. Из парафиновых блоков изготавливали гистологические срезы толщиной 3—5 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином.

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) выполняли в соответствии с протоколом на аутопсийном материале лиц из 3-й группы (30 случаев) и группы сравнения (30 случаев) с моноинфекцией ТБ и прогрессирующими формами. Использовали кроличьи моноклональные антитела к МПО, клон PA5−16672, Thermo Fisher с последующим морфометрическим анализом и применением программы Image Analysis. Статистическую обработку материалов осуществляли с помощью прикладной программы Statistica 6.0, разработанной для медико-биологических исследований, за величину уровня статистической значимости принимали р<0,05.

При комплексном исследовании аутопсийного материала, полученного от больных, умерших от коинфекции ВИЧ/ТБ, в 1-й группе (50 случаев; стадия 4А—4Б, количество CD4⁺-лимфоцитов более 200 клеток/мкл, медиана 356,2 клеток/мкл) обнаружено, что патологический процесс чаще всего локализовался в верхних сегментах (SI—II) правого легкого и был представлен следующими клинико-морфологическими формами: инфильтративным с распадом (n=24), фиброзно-кавернозным (n=22) и диссеминированным (n=4) ТБ. В легких обнаруживали очаги и инфильтраты от 0,5 до 2 см с участками серовато-желтоватого цвета. При хронических формах ТБ отмечали деструктивные изменения в легких с наличием многослойных полостей распада. Микроскопически выявляли зрелые эпителиоидно-клеточные гранулемы туберкулоидного типа с казеозным некрозом в центре части гранулем, окруженным валом эпителиоидных клеток, макрофагов, гигантских многоядерных клеток Пирогова—Лангханса и малых лимфоцитов. В просвете альвеол выявляли небольшое количество серозного экссудата, в котором обнаруживали лейкоциты, альвеолярные макрофаги и нити фибрина. В межальвеолярных перегородках и периваскулярных отделах наблюдали лимфоцитарную инфильтрацию. В части прилежащих к гранулемам бронхах и бронхиолах обнаруживали продуктивный неспецифический эндобронхит и панбронхит.

Таким образом, в 1-й группе в легких преобладали гранулемы, которые сохраняли черты классического строения, что свидетельствует о типичной гранулематозной реакции (табл. 1).

В материале легких умерших, включенных во 2-ю группу (54 случая; стадия 4Б—4 В, количество CD4⁺-лимфоцитов в диапазоне от 100 до 200 клеток/мкл, медиана 148,4 клеток/мкл), обнаружены клинико-морфологические формы ТБ: инфильтративный с распадом (n=22), диссеминированный (n=16), фиброзно-кавернозный (n=6) и казеозная пневмония (n=10). Патологически измененные участки чаще выявляли в верхней доле правого легкого и в SVI-сегменте с распространением на соседние отделы легких. Плевра чаще была изменена, обнаруживали ее отек и белесоватый налет с наслоениями фибрина, нередко выявляли сращения париетального и висцерального листков. В паренхиме отмечали обширные инфильтраты, нередко сливающиеся между собой, затрагивающие сегмент, долю или доли легкого, с образованием фокусов казеозного некроза, нередко с формированием субплевральных полостей распада размером от 0,5 до 1 см. Микроскопическая картина характеризовалась полиморфизмом изменений: чаще встречали участки казеозного некроза с образованием гранулем туберкулоидного типа, а также тяжи эпителиоидных клеток и лимфоцитов без альтеративных реакций и без тенденции к формированию гранулематозного воспаления. Клеточный состав гранулем отличался различной выраженностью лимфоидного компонента, уменьшением количества эпителиоидных клеток и клеток Пирогова—Лангханса, а также появлением нейтрофильных лейкоцитов в инфильтрате. Кроме того, на границе с участками деструкции обнаруживали выраженный экссудативный компонент. В бронхах и бронхиолах выявляли параспецифические изменения в виде эндо- и панбронхита. Периваскулярно отмечали явления васкулита с микротромбозами.

Подобные изменения в легких во 2-й группе свидетельствуют о сочетании различных типов клеточно-тканевых реакций (см. табл. 1) при формировании воспалительного ответа и волнообразном течении туберкулезной инфекции с преобладанием реакций экссудативно-продуктивного типа в результате нарушенного иммунного ответа.

В материале легких умерших, включенных в 3-ю группу (125 случаев; стадия 4В—5, количество CD4⁺-лимфоцитов менее 100 клеток/мкл, медиана 49,4 клеток/мкл), клинико-морфологические формы представлены диссеминированным ТБ легких (n=27) и генерализованными формами ТБ с множественными локализациями (n=98). Макроскопическая картина легких характеризовалась как субмилиарной диссеминацией, так и очагами до 1 см с формированием пневмониогенных субплевральных каверн, которые располагались как в апикальных, так в средних и нижних отделах легких. Такая локализация туберкулезного процесса в верхних и средних долях легких сопровождалась поражением паратрахеальных, субаортальных, бифуркационных лимфатических узлов, а при нижнедолевом процессе, который выявлялся наиболее часто в этой группе исследования, характеризовалась поражением параэзофагеальных и лимфатических узлов из легочной связки, что, по-видимому, связано с лимфогематогенным распространением микобактерий [10]. Важно отметить, что во всех случаях поражения легких были двусторонними. Легкие на разрезе имели пестрый вид с явлениями выраженного отека. Микроскопически отмечали многочисленные фокусы казеозного некроза, располагающиеся по ходу кровеносных и лимфатических сосудов. Окружающие казеозный некроз клеточные элементы представлены единичными незрелыми мононуклеарными макрофагами со светлой цитоплазмой, немногочисленными лимфоцитами, а также единичными нейтрофильными лейкоцитами. Альвеолы часто заполнены серозной жидкостью с резко выраженным отеком межальвеолярных перегородок, обнаруживали участки ателектазов, сменяющиеся очаговой эмфиземой. В бронхах среднего и мелкого калибра наблюдали явления неспецифического бронхита и бронхиолита. В микроциркуляторном русле сохранялись явления васкулита с микротромбами.

Таким образом, в 3-й группе преобладал альтеративно-некротический тип воспалительной реакции (см. табл. 1), который рассматривается как смена реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на реакцию гиперчувствительности немедленного типа с потерей биологического смысла ГЗТ [6, 11, 12], что, возможно, связано с резко выраженной иммуносупрессией и лимфогематогенной диссеминацией МБТ по типу туберкулезного сепсиса Ландузи и морфологией первичного прогрессирующего ТБ [13].

Наиболее выраженные структурные признаки снижения иммунных реакций при ТБ обнаружены в группе больных ВИЧ-инфекцией (3-я группа; стадия 4В—5, количество CD4⁺-лимфоцитов менее 100 клеток/мкл, медиана 49,4 клеток/мкл). Продуктивное воспаление характеризовалось резким снижением количества эпителиоидных клеток, макрофагов, лимфоцитов и гигантских многоядерных клеток Пирогова—Лангханса в составе гранулем и лимфогистиоцитарных инфильтратов легочной ткани. Поскольку гранулематозный воспалительный процесс рассматривается рядом исследователей не только как повреждение, но и как защитная реакция, направленная на элиминацию возбудителя [12, 14], а в условиях снижения Т-клеточных реакций у больных ВИЧ-инфекцией [12] возрастает роль фагоцитарной активности макрофагов и гранулоцитов [11, 15], мы провели исследование экспрессии МПО в легких при коинфекции ВИЧ/ТБ в 3-й подгруппе.

Учитывая полученные результаты о снижении выраженности гранулематозного воспаления, а также данные о неполноценной дифференцировке и снижении функциональной активности макрофагов при коинфекции ВИЧ/ТБ [11, 15], проведено ИГХ-исследование МПО как фермента, определяемого в незрелых макрофагах [11].

При изучении материала легких с использованием антител к МПО в группе больных с ВИЧ-инфекцией, умерших от ТБ (3-я группа), в большинстве случаев обнаружена выраженная степень экспрессии иммунореактивного материала (ИРМ) в макрофагах и гранулоцитах в фокусах продуктивного воспаления (рис. 1). В группе умерших от моноинфекции ТБ в гранулемах в меньшем количестве встречаются макрофаги небольших размеров с умеренной и выраженной степенью цитоплазматической экспрессии ИРМ (рис. 2). В стенках и просветах альвеол также обнаружено увеличение содержания альвеолярных макрофагов и гранулоцитов с экспрессией ИРМ в группе больных с коинфекцией ВИЧ/ТБ по сравнению с больными с моноинфекцией ТБ (рис. 3, 4).

Экспрессию ИРМ наблюдали не только в сохранных, но и в разрушенных клетках в фокусах некроза, что, на наш взгляд, подтверждает гипотезу о массовой гибели незрелых макрофагов с недостатком факторов дифференцировки, а также гранулоцитов на поздних стадиях болезни, вызванной ВИЧ, с проявлениями микобактериальной инфекции. Поскольку при выраженном иммунодефиците в исследуемой нами группе количество CD4⁺-лимфоцитов резко снижено (медиана 49,4 клеток/мкл), то реализация механизмов клеточной гибели, по-видимому, отличалась от CD4⁺-индуцированного апоптоза, доминирующего при моноинфекции ТБ [9, 10].

Для объективизации оценки морфологических изменений в различных областях легких проведен программный морфометрический анализ.

Вне зон продуктивного воспаления относительная площадь иммунопозитивных объектов (макрофагов и гранулоцитов) достоверно увеличивалась в 4,16 раза (р<0,001) в группе ВИЧ/ТБ по сравнению с Т.Б. Отмечалось также увеличение значений средней интенсивности окрашивания иммунопозитивных объектов (макрофагов и гранулоцитов) в межальвеолярных перегородках (р<0,001) в группе ВИЧ/ТБ по сравнению с ТБ (табл. 2).

В очагах продуктивного воспаления относительная площадь иммунопозитивных объектов (макрофагов и гранулоцитов) значимо увеличивалась на 89,6% (р<0,001) в группе ВИЧ/ТБ по сравнению с Т.Б. Кроме того, в очагах продуктивного воспаления у больных ВИЧ/ТБ коинфекцией обнаружено увеличение средней площади и среднего периметра иммунопозитивных объектов на 80,4% (р<0,001) и на 22,8% (р<0,01) соответственно. При этом значимо (р<0,001) возрастала и средняя интенсивность окрашивания иммунопозитивных объектов (макрофагов и гранулоцитов) (см. табл. 2).

Таким образом, результаты качественного и программного морфометрического анализа иммунофенотипа демонстрируют достоверное увеличение уровня экспрессии антител к МПО в макрофагах и гранулоцитах, более выраженное в фокусах воспаления в легких, что свидетельствует, с одной стороны, о возрастании доли функционально незрелых клеток моноцитарного ряда у лиц с генерализованными формами ТБ при ВИЧ-инфекции, учитывая биологическое значение исследуемого фермента [11], а с другой — о большем вовлечении гранулоцитов в реализацию воспалительных и иммунологических реакций в условиях коинфекции. Кроме того, отмеченное увеличение размеров МПО⁺-макрофаги и наличие фрагментов иммунопозитивных клеток в зонах казеозного некроза свидетельствует, на наш взгляд, о массовой гибели незрелых в функциональном отношении клеток, в которых в условиях сосуществования с ВИЧ-инфекцией увеличивается репликация M. tuberculosis в цитоплазме [15—17].

Таким образом, при комплексном анализе воспалительных изменений при ВИЧ-ассоциированном туберкулезе легких на патолого-анатомическом материале продемонстрирована взаимосвязь иммунологических показателей (количество CD4⁺-лимфоцитов) с характерными клеточно-тканевыми реакциями. Установлено, что у лиц с содержанием CD4⁺-лимфоцитов более 200 клеток/мкл периферической крови преобладала типичная гранулематозная реакция в 82% случаев. У лиц с уровнем CD4⁺-клеток в диапазоне 200—100 клеток/мкл обнаружен экссудативно-продуктивный тип клеточно-тканевых реакций в 57,4% случаев, а при снижении CD4⁺-лимфоцитов менее 100 клеток/мкл доминировал альтеративно-некротический тип в 92,8%, что, по-видимому, связано с глубоким нарушением взаимодействий клеток лимфоидного ряда и моноцитарного происхождения. Рассматриваемый механизм ВИЧ-индуцированного патоморфоза туберкулеза подтверждается данными литературы о нарушении созревания различных субпопуляций Т-лимфоцитов при коинфекции ВИЧ/ТБ [18, 19], уменьшении числа макрофагов, экспрессирующих Fc-, TLR-, CLR-, NLR-, SR-рецепторы, необходимые для захвата микобактерий туберкулеза и вирусов [17, 20], а также собственными результатами, демонстрирующими снижение количества лимфоцитов в зонах воспаления и значимое увеличение доли функционально незрелых макрофагов, экспрессирующих миелопероксидазу.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Л.С.Б., А.В.С.

Сбор и обработка материала: Л.С.Б.

Статистическая обработка: Л.С.Б., А.В.С.

Написание текста: Л.С.Б., А.В.С.

Редактирование: Л.С.Б., А.В.С.

Конфликт интересов отсутствует.