Введение
Хронический риносинусит (ХРС) — это воспалительное заболевание слизистой оболочки полости носа и околоносовых пазух, имеющее многофакторную этиологию. На сегодняшний день проблема ХРС, бесспорно, является одной из самых актуальных в оториноларингологии [1]. За последнее десятилетие заболеваемость ХРС увеличилась в 3 раза, а количество госпитализаций по этому поводу ежегодно возрастает на 1,5—2% [2].
Установлено, что 5—15% населения земного шара страдает той или иной формой хронического синусита, а затраты на лечение этих пациентов составляют более $3,5 млрд в год. В настоящее время в России риносинусит ежегодно диагностируется у 10 млн человек [1]. Особое значение имеет IgE-опосредованный ХРС, ведущим механизмом развития которого является аллергическая реакция немедленного типа [3, 4]. ХРС ухудшает качество жизни пациентов, при этом у всех больных выявляется болевой синдром в области околоносовых пазух [5]. Учитывая распространенность ХРС, его высокую социальную значимость, необходимость персонифицированного подхода к терапии таких больных, изучение патогенетических особенностей ХРС у пациентов с хроническим болевым синдромом является актуальной проблемой. При ХРС не исключается развитие инфекционной аллергии, обусловленной инфицированием Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, с усилением аллергического фона дрожжеподобными грибами рода Candida [6, 7]. При аллергических реакциях изменяется не только иммунная функция лимфоцитов, но и их метаболические характеристики [8]. При болевых синдромах играют значительную роль провоспалительные и противовоспалительные цитокины, а также слабым антиноцицептивным действием обладают бактериальные агенты, вызывающие ХРС [9]. Лимфоциты играют важную роль в развитии иммунных реакций, в активном состоянии секретируют широкий спектр провоспалительных и противовоспалительных интерлейкинов, при этом клеточные иммунные реакции играют важную роль в антибактериальном иммунитете. Представляет интерес сравнительный анализ клеточного звена иммунитета и активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов при IgE-ХРС и ХРС с хроническим болевым синдромом.
В связи с этим целью данной работы явилось изучение субпопуляционного состава T- и B-лимфоцитов с активностью НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов при IgE-опосредованном ХРС и ХРС с хроническим болевым синдромом.
Материал и методы
Настоящее исследование было проведено в лаборатории клинической патофизиологии Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера ФИЦ КНЦ СО РАН (Красноярск). В работе с обследованными пациентами соблюдались этические принципы, предъявляемые ст. 24 Конституции Российской Федерации и Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации.
Материалом исследования была венозная кровь, бравшаяся у пациентов и условно здоровых доноров утром, с 8 до 9 ч, натощак из локтевой вены в пробирки Vacutainer с раствором гепарина натрия (5 Ед/мл).
Всего обследованы 165 больных, госпитализированных в лор-отделение клиники института или обратившихся за консультативной помощью с хроническими заболеваниями околоносовых пазух, в возрасте от 18 до 60 лет. Из них выявлены 90 человек с диагнозом хронического верхнечелюстного синусита, которые и вошли в наше исследование.
Из 90 пациентов, госпитализированных в лор-отделение по поводу хронического верхнечелюстного синусита, при обследовании выявлены 23 пациента (13 мужчин и 10 женщин) с IgE-опосредованным хроническим верхнечелюстным синуситом и 67 пациентов (39 мужчин и 28 женщин) с нормальным содержанием IgE в крови. Контрольную группу составили 70 человек.
У всех больных с ХРС обнаруживались постоянная тупая распирающая боль, чаще в проекции пораженной пазухи, ощущение тяжести, напряжения. Иногда боль принимала пульсирующий характер с иррадиацией в зубы, уши, возникала головная боль. Интенсивность боли менялась в течение суток, что связано с изменением условий оттока из пазух в зависимости от положения головы. Болевой синдром при синуситах имеет сложную природу и является следствием раздражения окончаний тройничного нерва в слизистой оболочке пазух продуктами метаболизма микроорганизмов и медиаторами воспаления, повышения давления экссудата в просвете пазухи при затруднении оттока, болезненной пульсации вследствие избыточного пульсового растяжения артерий. Лицевая боль может быть вызвана нарушением вентиляционной функции соустий околоносовых пазух — это так называемая вакуумная, или утренняя, боль, возникающая вследствие понижения давления из-за резорбции воздуха. В целом при ХРС выделяют ноцицептивный характер боли, обусловленный воспалением и мышечным спазмом, после прекращения действия фактора происходит уменьшение боли. Нейропатическая боль при ХРС связана с поражением отделов нервной системы (окончаний тройничного нерва). В ряде случаев боль в области верхнечелюстной пазухи может носить идиопатический характер. Оценка интенсивности болевого синдрома проведена по визуально-аналоговой шкале (ВАШ) от 1 до 10 балов. Кроме этого, у больных ХРС выявлялись гипосмия, общее недомогание.
В группах больных с хроническим верхнечелюстным синуситом число мужчин и женщин было практически одинаковым (p=0,3). В обеих группах наибольший удельный вес составили лица в возрасте от 30 до 49 лет. Статистически значимых внутригрупповых различий в величине долей больных, принадлежащих к возрастным категориями 18—29 лет и старше 50 лет, получено не было (p=0,8). Также не наблюдалось межгрупповых различий в распределении больных по возрастным категориям, в том числе связанных с половой принадлежностью. Следовательно, сравниваемые группы больных с IgE-опосредованным хроническим верхнечелюстным синуситом, ХРС с хроническим болевым синдромом и без верхнечелюстного синусита (контрольная группа) оказались однородными по полу и возрасту.
Исследование клеточного звена иммунитета проводили методом проточной цитометрии с использованием прямой иммунофлуоресценции цельной периферической крови с моноклональными антителами CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+ (Beckman Coulter, США). Распределение антител по каналам флуоресценции проводили в соответствии с принципами формирования панелей для многоцветных цитофлуориметрических исследований. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США).
Биолюминесцентное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ проводили по ранее разработанным методикам (А.А. Савченко, Л.Н. Сунцова, 1989; А.А. Савченко, 1991). Для этого суспензию выделенных лимфоцитов, содержащую клетки в концентрации 1,0 млн/мл, после однократного замораживания-размораживания дополнительно разрушали путем осмотического лизиса с добавлением дистиллированной воды (1:5 по объему) и 1,0—2,0 мМ дитиотреитола. Затем производили непосредственное определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносили 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Рассчитывались конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также pH среды для определяемых ферментов. Необходимо отметить, что в инкубационную смесь для определения активности НАДФИЦДГ и НАДИЦДГ дополнительно добавляли АДФ в концентрациях 2,15 мМ и 1,3 мМ соответственно. В среду инкубации для определения уровней НАДНГДГ и НАДФНГДГ дополнительно вносили NH4Cl в концентрации 5,0 мМ, а для определения ГР — ЭДТА в концентрации 0,5 мМ.
Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft, USA). Анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения проводился с использованием критерия Шапиро—Уилка. При описании выборки вычислялись медианы (Me) и интерквартильный размах процентилей (C25—C75). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивали по критерию Манна—Уитни (p<0,05). Применение непараметрической статистики связано с небольшим размером выборок, разным характером распределения в вариационных рядах [10, 11].
Результаты
У больных ХРС по ВАШ боль оценивалась как умеренная (4—7 баллов).
На первом этапе работы были изучены особенности субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов с IgE-опосредованным ХРС относительно лиц контрольной группы и пациентов с другими ХРС с хроническим болевым синдромом (табл. 1).
Таблица 1. Особенности клеточного звена иммунитета у больных ХРС с хроническим болевым синдромом относительно лиц контрольной группы
| Показатели | Контроль, n=70 | ХРС, n=67 | IgE-ХРС, n=23 | |||
| Me | C25—C75 | Me | C25—C75 | Me | C25—C75 | |
| Лейкоциты, 109/л | 5,73 | 4,85—7,75 | 6,4 | 5,2—7,7 | 6,78 | 5,8—8,3 |
| Лимфоциты, % | 31,0 | 29,8—45,0 | 38,0 | 31,0—45,5 | 43,0 | 34,0—46,1 |
| Лимфоциты, 109/л | 1,78 | 1,61—2,83 | 2,43 | 1,61—2,83 | 2,9 | 1,9—3,82 |
| CD3+, (%) | 67,0 | 60,0—72,0 | 56,2 | 50,7—60,3 | 58,1 | 56,4—73,2 |
| CD3+, 109/л | 1,19 | 1,01—1,88 | 1,36 | 0,8—1,7 | 1,68 | 1,07—2,79 |
| p1—2=0,04 | p1—3=0,023; p2—3=0,03 | |||||
| CD4+,% | 44,0 | 34,0—49,0 | 32,6 | 28,4—40,7 | 32,5 | 30,1—37,7 |
| CD4+, 109/л | 0,78 | 0,55—1,27 | 0,79 | 0,45—1,15 | 0,9 | 0,57—2,79 |
| p1—3=0,034; p2—3=0,03 | ||||||
| CD8+, % | 27,0 | 20,0—34,0 | 23,9 | 21,1—24,5 | 28,3 | 25,7—36,4 |
| CD8+, 109/л | 0,48 | 0,38—0,89 | 0,58 | 0,33—0,69 | 0,82 | 0,48—1,4 |
| p1—3=0,01; p2—3=0,01 | ||||||
| CD16+, % | 20,0 | 17,0—23,0 | 26,1 | 24,7—28,4 | 17,4 | 16,2—25,4 |
| p1—2=0,04 | ||||||
| CD16+, 109/л | 0,36 | 0,31—0,60 | 0,63 | 0,39—0,8 | 0,5 | 0,3—0,97 |
| p1—2=0,04 | p1—3=0,04 | |||||
| CD19+, % | 13,5 | 9,0—16,0 | 20,3 | 17,4—22,7 | 18,6 | 14,3—24,9 |
| p1—2=0,03 | ||||||
| CD19+, 109/л | 0,24 | 0,18—0,39 | 0,49 | 0,28—0,64 | 0,53 | 0,27—0,95 |
| p1—2=0,03 | p1—3=0,01 | |||||
| CD4+/CD8+ | 1,62 | 1,4—1,76 | 1,36 | 1,38—1,66 | 1,18 | 1,08—1,99 |
| p1—3=0,04 | ||||||
Примечание. ХРС — хронический риносинусит; данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха процентилей (С25—С75); p1—2 — достоверные различия между группой ХРС и контрольной группой; p1—3 — достоверные различия между группой IgE-опосредованного ХРС и контрольной группой; p2—3 — достоверные различия между группами ХРС и IgE-опосредованного ХРС.
У больных ХРС с хроническим болевым синдромом выявлялось увеличение относительного количества NK-клеток (p1—2=0,04) и B- лимфоцитов (p1—2=0,03) и абсолютного количества зрелых T-лимфоцитов (p1—2=0,04), NK-клеток (p1—2=0,04) и B-клеток (p1—2=0,03).
Особенностью IgE-опосредованного ХРС с хроническим болевым синдромом являлось дополнительное увеличение количества CD4+ (p1—3=0,034; p2—3=0,03) и цитотоксических лимфоцитов (p1—3=0,01; p2—3=0,01). Уменьшение иммунорегуляторного индекса относительно контрольной группы свидетельствует о нарушении баланса между T-хелперами и цитотоксическими лимфоцитами в сторону увеличения количества последних (p1—3=0,04).
На втором этапе исследования были изучены особенности метаболизма лимфоцитов у пациентов с IgE-ассоциированным ХРС относительно лиц контрольной группы и пациентов с другими ХРС с хроническим болевым синдромом (табл. 2).
Таблица 2. Особенности метаболизма лимфоцитов у больных ХРС с хроническим болевым синдромом относительно лиц контрольной группы
| Показатели | Контроль, n=70 | ХРС, n=90 | IgE-ХРС, n=23 | |||
| Me | C25—C75 | Me | C25—C75 | Me | C25—C75 | |
| Г6ФДГ | 4,32 | 0,90—13,87 | 15,69 | 1,33—30,06 | 10,68 | 2,67—16,33 |
| p1—2=0,04 | p1—3=0,04 | |||||
| Г3ФДГ | 0,63 | 0,00—1,96 | 0,00 | 0,00—0,00 | 0,367 | 0,00—1,3 |
| ЛДГ | 38,43 | 14,85—98,98 | 10,23 | 0,00—20,46 | 4,3 | 3,4—8,1 |
| p1—2=0,004 | p1—3=0,004 | |||||
| НАДФМДГ | 2,84 | 0,64—12,75 | 55,38 | 36,03—74,73 | 40,91 | 20,7—46,54 |
| p1—2<0,001 | p1—3<0,001 | |||||
| НАДФГДГ | 0,59 | 0,00—2,56 | 0,00 | 0,00—0,00 | 0,00 | 0,00—0,00 |
| НАДФИЦДГ | 33,33 | 14,70—63,63 | 7,63 | 0,00—15,26 | 1,05 | 0,00—7,64 |
| p1—2<0,001 | p1—3<0,001 | |||||
| МДГ | 70,43 | 17,99—144,34 | 19,1 | 18,64—19,53 | 28,15 | 12,85—38,95 |
| p1—2=0,03 | p1—3=0,003 | |||||
| НАДГДГ | 5,64 | 0,47—16,76 | 13,63 | 0,00—27,26 | 23,9 | 0,00—58,62 |
| НАДИЦДГ | 4,05 | 1,00—12,93 | 6,9 | 0,00—13,82 | 0,00 | 0,00—0,096 |
| p1—3<0,001; p2—3<0,001 | ||||||
| НАДН-ЛДГ | 72,87 | 8,56—196,34 | 71,26 | 0,00—142,53 | 3,8 | 0,00—13,075 |
| p1—3<0,001; p2—3<0,001 | ||||||
| НАДН-МДГ | 128,37 | 35,45—357,11 | 126,72 | 42,05—211,4 | 199,97 | 92,28—231,63 |
| ГР | 19,64 | 1,67—113,62 | 4,48 | 0,00—8,9 | 0,74 | 0,00—1,58 |
| p1—2=0,001 | p1—3<0,001; p2—3=0,02 | |||||
| НАДН-ГДГ | 49,94 | 13,93—83,36 | 7,53 | 0,00—15,07 | 73,14 | 37,38—99,07 |
| p1—2<0,001 | p2—3<0,001 | |||||
| НАДФН-ГДГ | 52,87 | 29,59—84,88 | 27,53 | 1,13—53,9 | 9,6 | 1,05—61,9 |
| p1—2=0,004 | p1—3<0,001; p2—3<0,001 | |||||
Примечание. ХРС — хронический риносинусит; данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха процентилей (C25—C75); p1—2 — достоверные различия между группой ХРС и контрольной группой; p1—3 — достоверные различия между группой IgE-ассоциированного ХРС и контрольной группой; p2—3 — достоверные различия между группами ХРС и IgE-ассоциированного ХРС.
При исследовании ферментативного звена у больных ХРС с хроническим болевым синдромом выявлено нарушение метаболизма лимфоцитов, проявляющееся в виде повышения активности Г6ФДГ (p1—2=0,04) (цитозольного фермента, входящего в пентозофосфатный путь, метаболический путь, обеспечивающий образование клеточного НАДФ-H из НАДФ+; НАДФ-H необходим для поддержания уровня восстановленного глутатиона в клетке, синтеза жирных кислот и изопреноидов, НАДФМДГ (p1—2<0,001), катализирующего химическую реакцию в присутствии двухвалентных ионов металлов: малат + НАДФ+ ↔ пируват + CO2 + НАДФН; в качестве субстрата фермент использует (S)-малат и НАДФ, при реакции образуются пируват, углекислый газ и НАДФН, в ходе реакции малат окисляется до пирувата и CO2, а НАДФ восстанавливается до НАД) и снижения активности ЛДГ (p1—2=0,004), характеризующего сниженный уровень гликолиза в лимфоцитах крови, НАДФИЦДГ (р1—2<0,001), вспомогательной дегидрогеназной реакции, МДГ (p1—2=0,03), отвечающей за снижение интенсивности субстратного потока по лимонному циклу, относительно контрольной группы, ГР (p1—2=0,001), одного из ключевых ферментов глутатион-зависимой антиоксидантной системы, НАДФН-ГДГ (p1—2=0,004) и НАДН-ГДГ (р1—2<0,001), фермента, ответственного за нарушение взаимосвязей между реакциями цикла Кребса и процессами аминокислотного обмена, относительно контрольной группы.
У больных IgE-опосредованным ХРС с хроническим болевым синдромом выявлено более значительное нарушение метаболизма лимфоцитов, проявляющееся в виде повышения активности Г6ФДГ (p1—3=0,04), фермента НАДФМДГ (p1—3<0,001). Дополнительно повышена активность НАДН-ГДГ (p2—3<0,001), фермента, входящего в первый мультибелковый комплекс дыхательной цепи переноса электронов. Выявлено снижение активности ферментов ЛДГ (p1—3=0,004), НАДФИЦДГ (p1—3<0,001) и МДГ (p1—3=0,003). Обнаружено выраженное снижение активности ферментов НАДИЦДГ (p2—3<0,001), НАДН-ЛДГ (p2—3<0,001), что свидетельствует об ингибировании ферментативных реакций гликолиза в лимфоцитах крови больных только на терминальных реакциях, уменьшение активности ферментов ГР (p1—3<0,001) и НАДФН-ГДГ (p1—3<0,001) относительно не только лиц контрольной группы, но и больных с другими ХРС.
Обсуждение
Хронический болевой синдром и активный бактериальный процесс при ХРС сопровождаются изменением соотношения продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов с последующим развитием иммунных реакций [12]. Именно данными механизмами объясняется, по-видимому, увеличение количества T-, NK- и B-лимфоцитов при ХРС с хроническим болевым синдромом. Большое количество активированных клеток иммунной системы продуцирует большое количество цитокинов и поддерживает болевой синдром. Особенностью IgE-опосредованного ХРС является увеличение количества дополнительных субпопуляций зрелых T-лимфоцитов, а именно T-хелперов и цитотоксических лимфоцитов, что еще раз указывает на активный воспалительный процесс с развитием цитотоксических и антителопродуцирующих иммунных реакций. Активные B-лимфоциты бласттрансформируются в плазматические клетки, которые синтезируют специфические антитела. Увеличение количества популяций и субпопуляций T-лимфоцитов, NK-клеток и B-клеток при IgE-опосредованном ХРС с хроническим болевым синдромом связано, по нашему мнению, с наличием аллергических реакций, усиливающих антибактериальные иммунные реакции.
Кроме того, изменяется метаболическая активность самих лимфоцитов при ХРС с хроническим болевым синдромом. В целом мы можем говорить о снижении активности ферментов при ХРС (снижена активность шести ферментов), а при IgE-опосредованном ХРС снижена активность семи ферментов, при этом дополнительно уменьшается активность ферментов НАДИЦДГ и НАДН-ЛДГ при IgE-опосредованном ХРС с хроническим болевым синдромом. Увеличена активность двух ферментов при всех ХРС, и противоположное значение имеет активность фермента НАДН-ГДГ: она увеличивается при IgE-опосредованном ХРС и снижается при остальных ХРС.
Таким образом, с одной стороны, происходит активация пентозофосфатного пути, при этом страдает гликолиз, нарушаются взаимосвязи цикла Кребса с другими видами обмена веществ, снижается антиоксидантная защита клеток. По-видимому, увеличение абсолютного количества T-, NK- и B-лимфоцитов связано с активацией лимфопоэза и образованием большого числа молодых клеток со сниженной метаболической активностью [13]. Увеличение количества лимфоцитов свидетельствует об их активности при остром воспалительном процессе. Изменения метаболической активности лимфоцитов обусловлены, по нашему мнению, их мобилизацией в очаг воспаления и усилением образования лимфоцитов в костном мозге с формированием пула недостаточно функционально активных клеток, при этом большую роль в их активации играют бактерии, вызывающие ХРС.
С другой стороны, увеличение количества лимфоцитов с измененной метаболической активностью при ХРС с хроническим болевым синдромом, возможно, связано с развитием хронического стресса от болевого синдрома и с недостаточностью стресс-лимитирующих компенсаторных реакций при ХРС-опосредованном воспалении [14].
Заключение
В работе установлено увеличение абсолютного количества зрелых T-лимфоцитов, CD4+, цитотоксических лимфоцитов, NK-клеток и В-лимфоцитов (особенно при IgE-опосредованном ХРС) со снижением их метаболической активности на ранних этапах развития хронического болевого синдрома, что, вероятно, связано с ингибирующим действием стресс-реализующих гормонов. Увеличение популяционного и субпопуляционного состава клеток лимфоцитов при снижении их метаболической активности, вероятно, связано с усилением лимфопоэза с образованием пула молодых лимфоцитов со сниженной метаболической активностью.
У больных IgE-опосредованным ХРС с хроническим болевым синдромом выявлено более значительное нарушение метаболизма лимфоцитов в отличие от других ХРС, проявляющееся в виде повышения активности ферментов Г6ФДГ, НАДФМДГ и НАДН-ГДГ, выявлено снижение активности ферментов ЛДГ, НАДФИЦДГ, МДГ, выраженное снижение активности ферментов НАДИЦДГ, НАДН-ЛДГ, ГР и НАДФН-ГДГ относительно лиц контрольной группы и больных с другими ХРС. Выраженные метаболические нарушения связаны с угнетением гликолиза, нарушениями субстратного потока по лимонному циклу, изменениями в пентозофосфатном пути, в работе антиоксидантной системы, во вспомогательных реакциях и нарушениями взаимосвязей между реакциями цикла Кребса и процессами аминокислотного обмена в лимфоцитах данных больных.
Источник финансирования: работа написана в рамках госзадания №0287-2021-0005 «Исследование молекулярно-генетических и регуляторно-метаболических механизмов функциональной активности клеток иммунной системы в норме и при иммунопатологических состояниях».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.