Введение
Хронической нейропатической болью называют регулярно возникающие болевые ощущения в течение нескольких месяцев, связанные с поражением соматосенсорной нервной системы. Разнообразие этиологических факторов, клинических проявлений, снижение качества жизни вплоть до инвалидизации делают нейропатическую боль весомой проблемой в практике врача [1—4]. Недостаток полного понимания фундаментальных механизмов этиологии и патогенеза нейропатической боли у людей приводит к сложностям в диагностике и лечении больных с этой патологией. Определение точных звеньев патогенеза нейропатической боли необходимо для установления клинического прогноза, терапевтических подходов, поиска новых болевых мишеней и потенциального анальгетического эффекта новых химических соединений.
С этой целью разработан ряд экспериментальных моделей (повреждения периферических нервов у животных), способных имитировать признаки нейропатической боли, проявляющиеся у человека. Большинство этих моделей основаны на индукции функциональных нарушений в периферических нервах, данные нарушения приводят к изменению чувствительности в ответ на механические, термические и химические раздражители [1, 5—8]. Однако в клинической практике жалобы пациента включают в себя совокупность реакций на большое количество ноцицептивных сигналов, что не может быть отнесено к нарушению какого-либо одного вида чувствительности [9—15].
Каждая модель формирования нейропатической боли имеет свои преимущества и ограничения. В связи с этим остается открытым вопрос о модификации уже имеющихся моделей и создании качественных оптимальных моделей, дающих наиболее полные результаты для изучения этиопатогенеза нейропатической боли [9, 16]. Выбор методики оценки боли и условия содержания экспериментальных животных имеют немаловажное значение при анализе результатов в ходе моделирования нейропатической боли, что дало нам основания включить эти данные в статью.
Методики формирования нейропатической боли
Существует большое количество различных способов формирования нейропатической боли. Ввиду того, что такая боль имеет гетерогенную этиологию, было предложено множество моделей в зависимости от повреждающего фактора: механические (хирургические), химические, эндокринологические, микробиологические, онкологические и другие [1, 6—9, 11, 17—28]. Перечисление и краткая характеристика моделей [1, 9, 17—18] представлены в табл. 1.
Таблица 1. Виды моделей нейропатической боли
| Название модели | Принцип травмы | Вид животных | Источник |
| Хирургические модели (повреждение нерва путем оперативного вмешательства) | |||
| Аксотомия седалищного нерва | Полное пересечение седалищного нерва | Крысы | [18—22] |
| Хроническое сжатие седалищного нерва | 4 свободные лигатуры вокруг седалищного нерва | Крысы, мыши | [8, 17, 20—25] |
| Частичная перевязка седалищного нерва (модель Зельцера) | Тугая перевязка от 1/3 до 1/2 седалищного нерва | Крысы, мыши | [8, 17, 19, 20—22, 24, 26] |
| Перевязка спинномозгового нерва | Тугая перевязка спинномозговых нервов L5, L6 или L7 | Крысы, макаки | [8, 17, 20—22, 24] |
| Сохраненное повреждение нерва | Аксотомия большеберцового и общего малоберцового нервов | Крысы, мыши | [17] |
| Пересечение большеберцового и икроножного нервов | Аксотомия большеберцового и икроножного нервов | Крысы | [20, 27] |
| Перевязка общего малоберцового нерва | Лигирование общего малоберцового нерва | Мыши | [28] |
| Крионевролиз седалищного нерва | Замораживание седалищного нерва | Крысы | [21] |
| Каудальная резекция ствола | Резекция каудального ствола | Крысы, мыши | [21, 22, 29] |
| Повреждение седалищного нерва манжетой | Наложение полиэтиленовой манжеты вокруг седалищного нерва | Крысы, мыши | [8, 30, 31] |
| Повреждение седалищного нерва лазером | Снижение кровотока в седалищном нерве, опосредованное облучением | Крысы | [32] |
| Ушиб спинного мозга | Сбрасывание груза на открытый спинной мозг | Крысы, мыши | [8, 21, 33] |
| Спинальная гемисекция | Ляминэктомия T11—T12 сегментов | Крысы | [8, 22, 33, 34] |
| Тригеминальная невралгия | Компрессия тройничного ганглия хроническим сужением/сжатием подглазничного нерва | Крысы | [8, 22, 33] |
| Отрыв плечевого сплетения | Отрыв плечевого сплетения от спинного мозга | Крысы | [8, 17] |
| Химические модели нейропатии (токсическое повреждение нервов) | |||
| Эксайтотоксическое повреждение спинного мозга | Интраспинальные инъекции возбуждающих аминокислот | Крысы, мыши | [1, 8, 33, 35—37] |
| Орофациальная боль | Инъекция формалина, каррагенана в височно-нижнечелюстной сустав и верхнюю челюсть | Крысы, мыши | [38, 39] |
| Пиридоксин-индуцированная | Введение пиридоксина (400 мг/кг в течении 14 дней для крыс или 150 мг/кг в течение 7 дней для собак) | Крысы, собаки | [40] |
| Акриламид-индуцированная | Длительное (8 нед) введение акриламида 20—40 мг/кг 3 дня в неделю | Крысы | [41] |
| Этанол-ассоциированная | Длительное введение этанола (около 70 дней) | Крысы | [42, 43] |
| Воспалительный неврит седалищного нерва | Инъекция зимозана, High-mobility group protein B1 (амфотерин) или TNF-альфа вокруг седалищного нерва | Крысы | [8] |
| В качестве химических агентов также использовали 10% забуференный формалин, 37% перекись водорода и 70% уксусную кислоту. Однако методы не получили широкого распространения | Крысы, мыши | [1, 8] | |
| Диабет-ассоциированная нейропатия (повреждение нервов, вызванное гипергликемией) | |||
| Генетические модели | Генетически опосредованная гипергликемия | Крысы, мыши | [8] |
| Стрептозотоцин-индуцированная | Цитотоксическое повреждение β-клеток поджелудочной железы | [8, 9, 21, 22, 26, 44] | |
| ВИЧ-ассоциированная нейропатия и индуцированная анти-ВИЧ-агентами | |||
| ВИЧ-индуцированная | Доставка HIV protein gp120 в седалищный нерв | Крысы | [8, 9, 26] |
| Индуцированная анти-ВИЧ средствами | 2,3-дидеоксицитидин, диданозин | Крысы | [22] |
| Постгерпетическая невралгия | |||
| Вирус ветряной оспы | Инъекция инфицированных вирусом клеток в стопу | Крысы, мыши | [8, 21, 45] |
| Вирус простой оспы | Истощение капсаицин-чувствительных клеток | ||
| Невирусная модель | Афференты с резиниферотоксином | Крысы | [46] |
| Онкологически ассоциированные и индуцированные противоопухолевыми средствами | |||
| Рак костей (бедренной, пяточной, большеберцовой, плечевой) | Инокуляция опухолевых клеток в соответствующие кости | Крысы, мыши | [6, 22, 47—51] |
| Нейропатическая боль при раке | Выращивание опухоли вблизи седалищного нерва | Мыши | [9, 51, 52] |
| Боль при раке кожи | Инъекция клеток меланомы в подошвенную область лапы | Мыши | [6, 53] |
| Противоопухолевые препараты | Винкристин, цисплатин, оксалиплатин, паклитаксел | Крысы, мыши, морские свинки | [7, 8, 21, 26] |
| Фотохимически индуцированное повреждение | |||
| Фотохимически индуцированное повреждение седалищного нерва | Тромбоз в мелких сосудах седалищного нерва, вызванный фотосенсибилизирующим красителем и лазером | Крысы | [21] |
| Фотохимически-индуцированное повреждение спинного мозга | Тромбоз в мелких сосудах спинного мозга, вызванный фотосенсибилизирующим красителем и лазером | Крысы | [22, 32, 33] |
| Модели центральной нейропатической боли | |||
| Кортикальная или таламическая боль | Микроинъекция эксайтотоксических агентов — пикротоксина или каината в соматосенсорную кору или ядра таламуса | Крысы | [1, 21, 35—37] |
| Ассоциированная с геморрагическим инсультом | Микроинъекция коллагеназы IV типа в таламус | Крысы | [9, 26, 54] |
Различные этиологические факторы вызывают специфичное для них поражение нерва и соответствующую болевую реакцию. Важно понимать, что способ возникновения боли должен обладать прогностической способностью и отражать как клиническую картину, так и механизм, лежащий в основе заболевания [1].
Обоснование выбора хирургической методики нейропатической боли
Хирургические методы формирования нейропатической боли занимают ведущее место среди всех моделей. В первую очередь это связано с их эффективностью, относительной простотой выполнения, хорошей воспроизводимостью в различных экспериментах и предсказуемостью результатов [22, 59]. Кроме того, хирургические модели этиопатогенетически близки к основным заболеваниям периферической нервной системы с нейропатическим болевым компонентом, таким как межпозвонковая грыжа, синдром запястного канала, травматическое повреждение нерва, посттравматическая невралгия и другие.
Хирургические методики станут оптимальным вариантом в том случае, если экспериментатору необходимо исследовать общие механизмы формирования нейропатической боли или же когда этиологически важной составляющей патологии должно быть именно механическое повреждение нерва. Для выбора подходящей модели необходимо определить цель эксперимента, характер и локализацию воспроизводимой патологии: травма спинного мозга, тригеминальная невралгия, повреждение плечевого сплетения или отдельного периферического нерва, например спинномозгового L5. Способы, задействующие седалищный нерв, хорошо зарекомендовали себя в научной практике. Они рекомендуются в тех случаях, если локализация патологического процесса не несет важной составляющей.
Обзор хирургических методов
Проведя анализ работ, описывающих различные хирургические модели формирования нейропатической боли, мы выделили часть, на наш взгляд, наиболее часто используемых оперативных методик. С целью упрощения выбора подходящего метода в табл. 2 приведены достоинства и недостатки каждой модели [17, 60—61]. Характеристика каждого метода на основании целей и задач позволит лучше спланировать методологию научного исследования и, следовательно, получить ожидаемый результат [21, 22, 25, 57, 59—64].
Таблица 2. Сравнение хирургических моделей нейропатической боли
| 1. Хроническая компрессия седалищного нерва (классическая методика) Chronic constriction injury (CCI) | |
| Описание метода | На 0,5 см ниже таза производится 1,5-сантиметровый разрез. Двуглавая мышца бедра и поверхностная ягодичная мышца разделяются, седалищный нерв обнажается и изолируется. На него накладывают 4 свободные лигатуры (хромовый кетгут 5-0) с интервалом 1 мм. Хроническая компрессия также приводит к развитию аллодиниеподобного поведения, гипералгезии и спонтанного болеподобного поведения, которые обычно достигают максимума через 10—14 дней после операции. Хромовый кетгут способствует дополнительному воспалительному компоненту |
| Плюсы метода | 1. Надежная и легко воспроизводимая модель. 2. Часто используемая модель, особенно для поведенческих исследований. 3. Приводит к интраневральному отеку, который сдавливает нерв, эффективно подвергая аксотомии многие, но не все нервные аксоны. 4. Имитирует посттравматическую невропатию у людей. 5. Частичная денервация сохраняет некоторые поведенческие реакции на периферические стимулы. 6. Показывает поведенческие признаки спонтанной боли. 7. Повреждаются практически все Aβ-волокна, и очень большое количество Aδ-волокон подвергаются аксиотомизации, в то время как большая часть C-волокон остаются неповрежденными. 8. Включает в себя как воспалительный компонент, так и невропатический. Подходящая модель для оценки холодовой аллодинии по сравнению с частичной перевязкой седалищного нерва (PNL) и перевязкой спинномозгового нерва (SNL) |
| Минусы метода | 1. Аутотомия приводит к повреждению пальцев задних лап и животное становится непригодным для исследования. 2. Натяжение лигатур вокруг седалищного нерва может варьироваться, что влияет на количество и тип поврежденных афферентных волокон. 3. Вариабельность степени повреждения от животного к животному из-за различий в плотности перевязок даже одним и тем же экспериментатором у разных животных. 4. Степень аллодинии, возникающая в этой модели, меньше по сравнению с другими моделями, такими как частичная перевязка седалищного нерва (pSNL) и перевязка спинномозгового нерва (SNL), вероятно, из-за большего повреждения Aβ-волокон (которые в основном ответственны за аллодинию), что приводит к исчезновению аллодинии. Неповрежденные С-волокна могут быть причиной механической и термической гипералгезии (которая не является симптомом клинической невропатической боли) |
| 2. Перевязка спинномозгового нерва Spinal nerve ligation (SNL) | |
| Описание метода | Делается разрез вдоль позвоночного столба и левые параспинальные мышцы отделяются от остистых отростков на уровнях L4—S2. Под микроскопом выделяют спинномозговой нерв L5 и перевязывают 1—3 мм нерва дистальнее ганглиев дорсального корешка. Важно не повредить спинномозговой нерв L4 |
| Плюсы метода | 1. Частичная денервация сохраняет некоторые поведенческие реакции на периферические стимулы. 2. Подходит для выборочного исследования поврежденных и неповрежденных нервных волокон седалищного нерва. L5 и L6 являются поврежденными аксонами седалищного нерва, в то время как L4 относится к неповрежденным аксонам. 3. Экспериментальная изменчивость меньше, поскольку у каждого животного будет повреждено одинаковое количество нервных волокон всех размеров, за счет плотной перевязки одних и тех же спинномозговых нервов у каждого животного (при отсутствии индивидуальных особенностей в строении нерва). 4. Отличная модель для оценки механической аллодинии. К тому же в меньшей степени проявляет симптомы гипералгезии. 5. Аутотомия в этой модели отсутствует. Поврежденные и неповрежденные волокна периферического нерва происходят из различных ганглиев дорсального корешка |
| Минусы метода | 1. Хирургическая процедура этой модели является сложной, трудоемкой и требует особых навыков, чтобы избежать повреждения нерва L4 при перевязке L5 и L6. Даже незначительное повреждение нерва L4 устраняет реакции аллодинии. Кроме того, он вызывает серьезный двигательный дефицит и мешает поведенческим тестам, поскольку в нем много двигательных волокон. В этой модели довольно обширная операция с повреждением мышц может усложнить патомеханизм формирования боли |
| 3. Частичная перевязка седалищного нерва Partial sciatic nerve ligation (pSNL) | |
| Описание метода | Перевязка ипсилатерального седалищного нерва на высоком уровне, так что 1/3—1/2 толщины седалищного нерва захватывается лигатурой. Крысы проявляют признаки аллодинии, термической и механической гипералгезии в течение нескольких часов после перевязки; симптомы длятся более 7 мес. Животные проявляют признаки спонтанной боли в виде защиты лапы и облизывания раны. Эта модель имитирует ушиб нерва, а не его сдавление |
| Плюсы метода | 1. Частичная денервация сохраняет некоторые поведенческие реакции на периферические стимулы. 2. Повреждение равно аксонам всех размеров. 3. Умеренные симптомы механической аллодинии, термической гипералгезии. 4. Достаточно простая в выполнении хирургическая методика. Высокая воспроизводимость |
| Минусы метода | 5. Аутотомия приводит к повреждению пальцев задних лап и делает животное непригодным для исследования. 6. Большая вариабельность в перевязке количества нервных волокон на каждое животное, и даже один и тот же экспериментатор не может поддерживать постоянство перевязки равного количества нервных волокон. Трудно изучить изменения в ганглии дорсального корешка, поскольку поврежденные и неповрежденные первичные афференты смешаны в нерве |
| 4. Сохраненное повреждение нерва Spared Nerve Injury (SNI) | |
| Описание метода | Разрез на боковой поверхности левого бедра, проксимальная и дистальная части двуглавой мышцы бедра разделяются, обнажается седалищный нерв и его три терминальные ветви. Большеберцовый и общий малоберцовый нервы плотно перевязывают и удаляют 2—3 мм нерва дистальнее перевязки. Следует избегать любого растяжения или контакта с сохраненным подкожным икроножным нервом. После операции через 2—3 дня развивается долговременная гиперчувствительность (15 мес и более у крыс и не менее 30 дней у мышей) к механическим раздражителям. Данная модель отличается от модели SNL тем, что смешение неповрежденных и поврежденных нейронов в периферических тканях-мишенях ограниченно между поврежденным большеберцовым нервом и неповрежденным икроножным нервом |
| Плюсы метода | 1. Достаточно простая в выполнении хирургическая методика. 2. Высокая воспроизводимость. 3. Позволяет проводить поведенческое тестирование неповрежденной области икроножного нерва (прилегающей к денервированным участкам). 4. Позволяет исследовать нейрофизиологические изменения, которые происходят в периферических афферентных окончаниях интактных поверхностных афферентных нейронов после повреждения соседних нервов |
| Минусы метода | 5. Вызывает повреждения малоберцового и большеберцового нервов, оставляя интактным икроножный нерв, и, так как процедура вызывает дегенерацию аксонов, это также ограничивает количество дистальных интактных аксонов. Следовательно, это приведет к трудностям при выполнении поведенческих тестов, поскольку ипсилатеральная лапа включает в себя неповрежденные участки, близкие к денервированным. 6. Дополнительным осложнением для оценки болевого поведения у животных является то, что сверхчувствительная область конечности — это боковая часть лапы, которую технически сложно протестировать |
| 5. Модель отрыва плечевого сплетения Brachial plexus avulsion (BPA) model | |
| Описание метода | Доступ к плечевому сплетению осуществляется через горизонтальный разрез, параллельный ключице, идущий от грудины к подмышечной области. Большая грудная мышца смещается, оставляя латеральную подкожную вену неповрежденной. Идентифицируют подключичные сосуды и отделяются нижний ствол плечевого сплетения от окружающих тканей. Нижний ствол захватывают зажимом и отделяют от спинного мозга путем тракции. Основными характеристиками данной модели являются быстрое начало боли (эффект, который возникает сразу после травмы) и длительное развитие нейропатии, которая может проявляться вдали от места поражения, либо на ипсилатеральной, либо на контралатеральной стороне |
| Плюсы метода | 1. Это новая и надежная модель для изучения невропатической боли. 2. В этой модели нейропатия может быть обнаружена даже в отдаленных от травмы местах, как в ипсилатеральных, так и в контралатеральных задних лапах. 3. Отрыв плечевого сплетения у мышей не был связан с аутотомией. 4. Это подходящая модель для изучения длительной механической аллодинии и холодной аллодинии, характерных для людей с аналогичной травмой |
| Минусы метода | 1. Модель не подходит для исследования термической гипералгезии |
| 6. Модель перерезания седалищного нерва Sciatic Nerve Transection model | |
| Описание метода | Обнажают общий седалищный нерв. Отделяется соединительная ткань, прикрепленная к седалищному нерву, и седалищный нерв прочно перевязывается проксимальнее его бифуркации в большеберцовый и малоберцовый отделы, в двух местах на расстоянии около 1 см друг от друга. Затем нерв полностью пересекают между парой лигатур и удаляют 5 мм нерва между лигатурами. Соседний икроножный нерв также поражается, вызывая полную денервацию дистального отдела задней конечности. После полной перерезки нерва в его проксимальной культе развивается неврома, состоящая из регенеративных нервов |
| Плюсы метода | 1. Это подходящая модель для имитации фантомной боли в конечностях. 2. Модель производит анестезию dolorosa, то есть боль с психогенным компонентом в пораженной области при отсутствии какого-либо действия раздражителя в ней |
| Минусы метода | 1. Выраженная чрезмерная аутотомия |
| 7. Модель перерезания спинномозгового нерва Spinal Nerve Transection (SNT) model | |
| Описание метода | Делается разрез вдоль позвоночного столба и левые параспинальные мышцы отделяются от спинномозговых отростков на уровнях L4—S2. Под микроскопом выделяют спинномозговой нерв L5 и иссекают 1—3 мм нерва дистальнее ганглиев дорсального корешка |
| Плюсы метода | 1. Имитирует фантомную боль в конечностях у людей |
| Минусы метода | 1. Отсутствует местный воспалительный компонент, который присутствует в моделях CCI (особенно при использовании хромированного кетгута), частичной и полной перевязки седалищного нерва (pSNL и SNL). 2. Оценка болевого поведения в этой модели затруднена |
Выбор методики и ее модификация
В своих научных исследованиях мы использовали собственную модификацию метода по хроническому сжатию (компрессии) седалищного нерва [65]. Ключевые особенности представлены ниже.
1. Выполняется ксила-золетиловый наркоз: в целях премедикации производится внутримышечная инъекция ксилазина в расчетной дозе 0,05 мл/кг в правое бедро, затем, через 10 мин, вводится золетил 50 внутримышечно в дозе 8 мг на 100 г массы тела животного в левое (противоположное) бедро. Раствор золетила подготавливают путем добавления воды для инъекций до растворения комков. Инъекции осуществляются инсулиновыми шприцами с предварительной фиксацией животного. Используются порционные или торсионные весы с точностью 0,01 г для строгого дозирования наркоза, чтобы избежать анестезиологических осложнений или раннего выхода из наркоза.
2. После погружения крысы в сон удаляют шерсть с ее бедра в месте проекции седалищного нерва с помощью изогнутых ножниц. Для предотвращения повреждения кожных покровов рекомендуется растягивать кожу указательным и большим пальцем левой руки при выстригании операционной области правой рукой. По нашему опыту, изогнутые ножницы позволяют лучше и менее травматично удалять шерсть по сравнению с бритвой.
3. Затем животное помещается на терморегулируемый нагревательный столик с постоянной температурой 36—38 °C для предотвращения гипотермии и фиксируется в положении лежа на боку. Если отсутствует терморегулируемый столик, можно использовать подогрев на водяной бане: в прямоугольную емкость наливают воду 37—40 °C, сверху накрывают стерильной металлической пластиной, которую покрывают стерильной пеленкой. Главные минусы подогрева на водяной бане — необходимость постоянного контроля нужной температуры и подливание горячей воды в емкость с соблюдением правил асептики.
4. Далее необходимо нанести смазывающую мазь или закапать животному глаза для предотвращения кератита. Мы рекомендуем использовать увлажняющие глазные капли по типу искусственной слезы с содержанием натрия гиалуроната. Закапывать по необходимости, на время оперативного вмешательства хватает 3—4 раз.
5. Область бедра крысы трижды обрабатывают раствором антисептика или 70% спирта.
6. Оператор находит проекцию седалищного нерва: крыса лежит на боку, заднюю лапу приводят таким образом, чтобы бедренная кость находилась под углом 90º по отношению к позвоночнику, конечность фиксируют левой рукой или с помощью стерильного пластыря.
7. Пальцами левой руки растягивают кожу бедра и выполняют разрез скальпелем с лезвием №12. Разрез производится параллельно бедренной кости, но на 3—4 мм ниже ее (каудальнее), продолжительность доступа 1,5—2 см. Необходимо отсепарировать кожу от окружающих тканей на расстоянии 1—1,5 см от края разреза для создания пространства при наложении швов. Для остановки возможного кровотечения рекомендуем использовать метод тампонирования ватными или марлевыми шариками в течение 3—5 мин.
8. Затем выполняют прокол соединительной ткани между ягодичной мышцей и двуглавой мышцей бедра скальпелем и далее тупым методом с помощью изогнутого зажима типа «Москит» выполняют диссекцию мышечной ткани на длину кожного разреза. Для разведения краев раны используется анатомический пинцет, ретрактор или расширитель по Adson.
9. После визуализации ствола седалищного нерва необходимо аккуратно прецизионно отсепаровать 1—1,5 см нерва от подлежащих тканей микропинцетом или микроножницами с тупыми краями. Далее под него заводят изогнутый зажим и выводят из глубины раны наружу. После этого необходимо зафиксировать зажим или подвести под нерв офтальмологический микропинцет таким образом, чтобы нерв оставался выше краев раны. Поднятие нерва из глубины раны позволяет гораздо быстрее и эффективнее накладывать лигатуры. При небольшой массе животного или недостаточности опыта у хирурга могут возникнуть сложности с манипуляцией на нерве в связи с его небольшим размером, с этой целью рекомендуем использовать микроскоп или лупу с увеличением ×5 на штативе с хорошим источником света.
10. Проксимальнее трифуркации на нерв накладывается четыре лигатуры на расстоянии 1 мм друг от друга [88]. Лигатуры выполняют из нерассасывающегося шовного материала 4/0—6/0 путем последовательного наложения трех узлов (мы заменили хромированный кетгут синтетическими монофиламентными нитями типа Prolene, чтобы исключить дополнительный воспалительный компонент и получить «чистую» механическую модель). Каждая лигатура должна максимально приблизиться к нерву, но не пережимать его, чтобы предотвратить аксотомию и аутосомию. Расстояние лигатуры от нерва должно быть таким, чтобы между ними могла пройти игла инсулинового шприца, то есть должен быть неплотный контакт. Излишки шовного материала необходимо срезать максимально близко к корню узла для предотвращения травматизации окружающих тканей оставшимися «усиками», их длина должна быть не более 2 мм. Если лигатура была чрезмерно затянута и/или наблюдается подергивание лапы, необходимо срезать лигатуру и наложить новую, немного отступая от предыдущего места для профилактики остановки эпиневрального кровотока.
11. После наложения лигатур нерв погружают обратно. Рану необходимо послойно ушить. Мышечный слой ушивается непрерывным обвивным швом при помощи рассасывающейся нити 4/0—5/0. Кожа ушивается так же, но используют нить Vicril 4/0—6/0, так как она не перекручивает кожу по ходу натяжения нити ввиду ее сниженной эластичности и растяжения.
12. После наложения швов рана обрабатывается раствором антисептика. Животное помещается на 3—4 ч в отдельную клетку, на стерильную впитывающую пеленку, рядом кладут грелку или бутылку с водой температурой 36—38 °C.
Основные модификации:
1. Расположение животного на операционном столе на боку.
2. Удаление шерсти с поверхности бедра изогнутыми ножницами для подготовки операционного поля.
3. Увлажнение слизистой глаз животного с помощью капель для предотвращения кератита.
4. Отсепарирование кожи от мышечной ткани на расстоянии 1—1,5 см от краев раны и выполнение прокола мышечной ткани с последующей диссекцией тупым методом на всю длину операционного доступа.
5. Выведение седалищного нерва из глубины раны наружу и фиксация его на офтальмологическом пинцете.
6. Использование увеличительной техники для более точного манипулирования на нерве.
7. Наложение четырех лигатур из асептического синтетического материала.
8. Ушивание мышечной ткани рассасывающимся материалом, а кожи — викрилом.
Способы оценки формирования нейропатической боли
Существует несколько способов оценивания выраженности нейропатической боли. Ввиду того, что каждая модель задействует разные механизмы формирования нейропатической боли, необходимо заранее определить, какие методы оценивания интенсивности болевого синдрома подойдут к выбранной модели. Определение выраженности нейропатической боли позволяет убедиться в том, что выбранная модель была корректно сформирована, оценить динамику нейропатической боли или эффективность анальгетической терапии [60, 66].
В проблемной научной лаборатории изучения механизмов формирования боли РостГМУ профессором В.Г. Овсянниковым была модифицирована универсальная шкала критериев боли, предложенных А.В. Вальдманом и Ю.Н. Васильевым [67]. Данная шкала позволяет проводить оценку выраженности любого болевого синдрома без наличия специального оборудования (табл. 3).
Таблица 3. Модифицированный метод оценки боли по характеристикам поведенческих и вегетативных реакций
| Уровень реакции | Характеристика реакции |
| 1 | Порог ответной реакции — вздрагивание век, сгибание конечности |
| 2 | Сгибание стимулируемой конечности, вздрагивание головы, зажмуривание, прижимание ушей, интенсивное моргание |
| 3 | Вздрагивание всем телом, облизывание, изменение позы, повышение тонуса мышц, прыжки, вокализация (писк). Мочеиспускание |
| 4 | Вокализация (крик), постоянное передвижение, беспокойство. Дефекация |
| 5 | Генерализованные тетанус, побег с криком, агрессивность |
Учитывая, что предложенная выше шкала больше всего подходит для оценки острой боли, мы рекомендуем также обратить внимание на другую шкалу оценки интенсивности нейропатической боли — в зависимости от характерных признаков болевого поведения крыс [22, 63, 64] (табл. 4).
Таблица 4. Оценка интенсивности нейропатического болевого синдрома в зависимости от характерных признаков болевого поведения крыс
| Признаки болевого поведения | Характеристика при выраженности боли | |||
| слабой | умеренной | сильной | очень сильной | |
| Изменение поведения | Снижение двигательной активности, при движении животное старается опираться на поврежденную конечность | Снижение двигательной активности, животное «щадит» поврежденную конечность, попискивает при попытке взять его в руки, проявляет агрессивность по отношению к сородичам и экспериментатору, аппетит снижен | Выраженное снижение двигательной активности, животное, облизывает поврежденную конечность, попискивает вне попыток взять его в руки, а при попытке взять его в руки и вытащить из клетки громко пищит, агрессивность по отношению к сородичам, аппетит снижен, животное мало пьет | Выраженное снижение двигательной активности, практически полная адинамия, животное облизывает поврежденную конечность, регистрируются случаи аутотомии; крыса громко пищит или стонет даже вне попыток взять ее в руки, повышенная агрессивность к исследователю и сородичам или полное безразличие, животное практически ничего не ест и мало пьет |
| Дополнительные признаки | Животное сгорблено | Животное сгорблено, большую часть времени лежит | Неряшливый вид, животное почти все время лежит, нос сухой, веки частично прикрыты | Неряшливый вид, животное почти все время лежит, нос сухой, веки частично прикрыты, появляются красноватые выделения из глаз, напоминающие слезы |
Оценка нейропатического болевого синдрома может также проводиться по специфическим стимулонезависимым критериям, то есть по появлению признаков аутотомии на оперированной конечности. Однако, по-нашему мнению, наличие аутотомии является неблагоприятным фактором прогноза для животного и свидетельствует о нарушении методики оперативного вмешательства или избыточности влияющего фактора, если только это не является целью эксперимента [55] (табл. 5).
Таблица 5. Шкала оценки интенсивности аутотомии на оперированной конечности
| Баллы | Характеристика |
| 1 балл | Повреждение 1 когтя |
| 2, 3, 4 и 5 баллов | Повреждение соответственно 2, 3, 4 и 5 когтей |
| 6 баллов | Повреждение фаланги 1 пальца |
| 7, 8, 9 и 10 баллов | Повреждение фаланг соответственно на 2, 3, 4 и 5 пальцах |
| 11 баллов | Повреждение плюсневых костей |
Кроме того, оценка нейропатической боли может проводиться по стимулозависимым критериям, то есть с помощью тестов, основанных на рефлексах (термическая аллодиния, механическая и термическая гипералгезия), и с помощью инструментальных методов исследования, таких как плантарный тест, тест «холодная пластина», тест с калиброванными волосками Фрея, метод с использованием анальгезиметра и другие [1, 25, 55, 60, 62].
Подобные тесты позволяют получить более объективные результаты оценивания выраженности сформированной патологии, чем субъективная оценка поведенческих реакций животного. При этом также существуют нерефлексивные и функциональные тесты, которые позволяют оценить кортикальные механизмы модуляции боли. Однако такие исследования часто требуют наличия специального оборудования и навыков их проведения.
Особенности ведения эксперимента с нейропатической болью
Помимо грамотно выбранной и правильно выполненной модели нейропатической боли важно знать и учитывать другие факторы, которые могут оказывать влияние на поведенческие реакции крысы в эксперименте [63, 67—69].
Многие авторы отмечают, что помимо генетически детерминированных признаков, таких как штамм, пол, возраст животного, немаловажную роль в развитии, интенсивности и проявлении нейропатической боли играют и факторы внешней среды. Сроки изменения боли после индукции нейропатии, условия содержания после операции, циркадные ритмы, сезонные влияния, диета, социальные переменные, внешние стрессовые факторы (холод, тепло), а также действия самого экспериментатора могут оказывать влияние на гены, отвечающие за те или иные признаки [70—72].
Были проведены исследования по формированию нейропатической боли у крыс разной породы: показано, что у крыс некоторых линий боль развивается в меньшей степени, чем у других. Замечено, что беспородные животные более чувствительны к боли, чем инбридные [72—75].
Поведенческие реакции в ответ на хроническое болевое воздействие претерпевают сезонные и суточные изменения. У грызунов поведение, подобное поведению при нейропатической боли, в темной фазе более активное, причем самки демонстрируют как повышенную механическую аллодинию, так и повышенную чувствительность к холоду по сравнению с самцами [76, 77]. При этом болевая чувствительность выше в условиях высокой влажности в естественных условиях, когда температурный климат соответствует поздней весне, лету и ранней осени [72, 76, 78].
У крыс психосоциально-поведенческая переменная, идентичность партнеров по клетке, может в значительной степени превзойти генетическую предрасположенность к болевому поведению. Подобная связь хорошо описывается в исследовании с участием крыс двух линий: с высокой степенью аутотомии и с низкой степенью аутотомии. В условиях, когда крысы с низкой степенью аутотомии содержались с крысами с высокой степенью аутотомии, животные с изначально низкой степенью аутотомии стали демонстрировать высокий уровень аутотомии. Отмечено, что даже подстилочного материала, загрязненного крысами с высокой степенью аутотомии, достаточно, чтобы у крыс низкой степенью аутотомии индуцировать умеренный (то есть более высокий) уровень аутотомии [72, 73]. Среди крыс одной линии отмечено, что самки крыс испытывают стресс при изоляции, в то время как самцы испытывают стресс при нахождении в группе. Совместное содержание самки и самца снижают случаи механической аллодинии и аутотомии [72, 79].
В работах, связанных с исследованием влияния диеты на поведение животного в моделях нейропатической боли, указывается на возможное влияние сои. Добавление сои в корм для животных приводило к значительно более слабой механической аллодинии и тепловой гипералгезии у подопытных животных. Когда соя была исключена и в рацион был добавлен казеин, чувствительность к боли повышалась [80—82]. Значительно более низкие показатели аутотомии наблюдаются у животных, получавших в своем рационе большое количество триптофана, глюкозы [80, 83].
В ряде исследований утверждается, что текстура и размеры частиц подстилочного материала оказывают существенное влияние на болевую чувствительность [84—86]. Интересным является тот факт, что животные, содержавшиеся на подстилке с более мелкими частицами, проявляли повышенную химическую гиперреактивность и механическую гипералгезию, то есть наблюдается обратная зависимость тактильной чувствительности и размеров, твердости подстилочного материала [84, 85, 87].
Таким образом, хроническая боль, связанная с повреждением нерва, является примером взаимодействия генов с окружающей средой посредством участия эпигенетических процессов. Отсутствие должного внимания к вышеописанным факторам потенциально может приводить к снижению достоверности результатов эксперимента и к повышению межлабораторной изменчивости. В связи с этим стоит уделить внимание необходимости строгой стандартизации и детального документирования всех условий эксперимента.
Заключение
Выбор подходящей экспериментальной модели нейропатической боли должен основываться на цели эксперимента, его направленности и способах оценки его результатов. Если в исследовании не важна этиологическая структура нейропатической боли, то рекомендуется выбрать хирургическую модель, опираясь на преимущества и недостатки каждого конкретного способа. Мы предлагаем использовать нашу модификацию модели с хронической компрессией седалищного нерва ввиду ее эффективности и хорошей воспроизводимости.
При составлении дизайна исследования важно также учитывать множество особенностей ведения эксперимента с нейропатической болью и заранее выбрать способ оценки выраженности нейропатической боли. Кроме того, важно подробно описывать методику экспериментов с нейропатической болью и условия содержания животных, так как это позволит снизить ошибки при воспроизводимости и трансляции исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.