Разработка экспериментальной модели медикаментозного ринита на кроликах

Медикаментозный ринит возникает вследствие длительного применения топических деконгестантов и представляет собой серьезную проблему в современной оториноларингологии. По данным исследований, данная патология выявлена у 7% взрослого населения [1], при этом число пациентов ежегодно увеличивается в связи с безрецептурной доступностью назальных сосудосуживающих препаратов и их бесконтрольным применением.

Назальные деконгестанты широко применяются для временного устранения назальной обструкции любой этиологии благодаря их способности вызывать сужение кровеносных сосудов (вазоконстрикции). Деконгестанты применяются преимущественно при различных видах ринита, острых и обострениях хронических синуситов, острых отитах, а также для подготовки к диагностическим манипуляциям и в послеоперационном периоде после ринологических вмешательств [2].

При отмене данных препаратов наблюдается феномен реактивной гиперемии, связанный с накоплением метаболитов в сосудах и их компенсаторным расширением (вазодилатацией), что сопровождается повторным отеком тканей. Длительное использование вазоконстрикторов может вызывать гипоксию слизистой оболочки носа, усугубляя ситуацию за счет активации механизмов обратной нейрональной регуляции [3—6]. Эти изменения способствуют возникновению синдрома «рикошетного отека» и гипертрофии носовых раковин, что ведет к прогрессирующему ухудшению носового дыхания — основному симптому медикаментозного ринита. Для предупреждения развития медикаментозного ринита важно ограничить частоту применения топических деконгестантов [7].

Несмотря на значительное количество клинических наблюдений, патогенетические механизмы развития медикаментозного ринита остаются недостаточно изученными. Особый интерес представляют морфологические изменения слизистой оболочки полости носа и ее сосудистого компонента под влиянием длительного воздействия назальных деконгестантов. Понимание этих процессов имеет ключевое значение для разработки эффективных методов профилактики и лечения данной патологии.

Известно, что при различных видах ринита происходит гипертрофия нижних носовых раковин в результате воспаления, отека, а также изменения состояния микроциркуляторного русла [8]. Характеристики капиллярной сети могут служить дополнительными диагностическими параметрами при исследовании кожи, слизистых оболочек, что позволит обнаружить заболевания и патологические состояния на ранней стадии их развития [9]. При фотоплетизмографии (ФПГ) регистрируют динамические изменения кровенаполнения путем анализа временных флюктуаций отраженного/рассеянного света, что может применяться для оценки состояния слизистой оболочки носа [10]. Считается перспективным применение оптических методов для объективной и неинвазивной оценки состояния капиллярной сети [11—13]. В настоящей работе с этой целью предлагается использовать метод фотоплетизмографии, основанный на неинвазивном анализе динамических изменений кровенаполнения тканей.

Актуальность нашего исследования определена потребностью в разработке экспериментальной модели медикаментозного ринита, которая позволила бы в дальнейшем проводить оценку методов лечения данной патологии.

Цель исследования — разработать экспериментальную модель медикаментозного ринита на кроликах, оценить морфологические изменения слизистой оболочки носа и апробировать метод ФПГ для неинвазивной диагностики микроциркуляторных нарушений.

В качестве животной модели мы использовали самцов кроликов породы советская шиншилла одинаковой массы тела. По данным литературы, кролики относятся к одному из видов лабораторных животных, часто используемых в экспериментальных исследованиях для оценки и изучения патологических состояний полости носа и околоносовых пазух [14—17]. Выбор кролика в нашем исследовании в качестве экспериментальной модели также обусловлен большим размером полости носа, пригодной для проведения стандартизованных манипуляций, и сходством анатомии носа и околоносовых пазух данных животных и человека [18].

Эксперимент проводили в условиях виварного комплекса ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России.

Получено одобрение локального этического комитета ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (№17-24 от 04.07.24.). Исследование выполнено с соблюдением всех этических норм и требований к работе с лабораторными животными согласно отечественным (Р1.2.3156-13) и международным (директива 2010/63/EU) стандартам. При планировании эксперимента особое внимание уделялось принципу использования минимально необходимого количества животных, достаточного для получения статистически значимых результатов. Все манипуляции с животными выполнялись квалифицированным персоналом, прошедшим специальную подготовку по работе с лабораторными животными. Содержание животных осуществлялось в стандартизированных условиях вивария, обеспечивающих их благополучие на протяжении всего исследования.

Медикаментозный ринит индуцировали интраназальным введением 0,1% раствора ксилометазолина 2 раза в день с помощью дозатора в каждый носовой ход в объеме 200 мкл/ноздря в течение 2 нед (рис. 1). У животных группы Контроль использовали физиологический раствор (натрия хлорид 0,9%) в той же дозе и с той же кратностью введения.

Рис. 1. Схематическое изображение процедуры введения препарата.

Для сравнения результатов кролики выведены из эксперимента для дальнейшего гистологического исследования на 8-е и 15-е сутки от начала работы. Животных усыпляли превышенной дозой наркоза препаратами «Золетил» и «Ксила». Выделяли полость носа с прилегающими тканями. Все отобранные на анализ образцы фиксировали в 10%-м забуференном растворе формалина. Проводили декальцинацию в 10%-м растворе муравьиной кислоты. Сагиттальные срезы полости носа окрашивали гематоксилином и эозином.

Фотоплетизмография (ФПГ) представляет собой неинвазивный оптический метод анализа тканей, заключающийся в оценке временных изменений в интенсивности рассеянного внутренними структурами тканей излучения, модулированных сердечной деятельностью [19]. Метод предполагает регистрацию изображений исследуемого участка кожи и последующую их цифровую обработку. Типичным результатом измерений является фотоплетизмограмма — периодический сигнал, характеризующий изменение кровенаполнения тканей во времени [20].

В исследовании предложено проводить оценку состояния тканей на основе анализа реакции микроциркуляции на провокационное воздействие — холодовую пробу. Процедура заключалась в смачивании поверхности слизистой оболочки физиологическим раствором (натрия хлорид 0,9%), охлажденным до температуры 4±1°C. Физиологический раствор в объеме 2 мл доставляли с помощью шприца. Регистрацию фотоплетизмограмм проводили до и через 5 мин после воздействия в одной и той же области. Отношение амплитуд фотоплетизмограмм до и после воздействия выбрано в качестве количественной характеристики патологического состояния тканей, вызванного ринитом. Перед проведением ФПГ животному выполняли наркоз — внутримышечное введение раствора тилетамина и золазепама («Золетил 100») из расчета 15 мг на 1 кг массы тела и раствора ксилазина («Ксила») 1—2 мг на 1 кг массы тела. Регистрацию данных начинали через 10 мин после введения препарата.

Для получения фотоплетизмограммы использована система на основе жесткого эндоскопа с диаметром трубки 2 мм и волоконной подсветкой (ООО «НПП СиМТ», Россия, ЭЖ.2,1.175.0), подключенной к стандартному источнику излучения. Эндоскоп вводили в носовую полость размещенного лежа на боку животного до контакта с исследуемой областью (носовыми раковинами) с минимальным воздействием. Изображение исследуемой области формировалось оптической системой эндоскопа и заокулярным объективом с фокусным расстоянием 50 мм (ООО «НПП СиМТ», Россия, АВ-ОМ-50) в плоскости чувствительной площадки цифровой цветной камеры (DFK 33UX273, Imaging Source, Германия), АЦП 12 бит, размер пикселя 3,45×3,45 мкм, максимальное разрешение 1440×1080 пикселей). Регистрация изображений осуществлялась с частотой 60 кадров в секунду. До и после воздействия регистрировалось по 3 серии изображений из 1000 кадров. Данные с камеры передавались с помощью высокоскоростного интерфейса USB 3.0 на персональный компьютер. Обработка изображений проводилась в программе Matlab с помощью оригинального алгоритма. В ходе цифровой обработки из цветного изображения для повышения отношения сигнал/шум и, соответственно, качества сигнала выделялся зеленый канал. Далее для каждого кадра проводилось усреднение значений интенсивности пикселей изображений в пределах исследуемой области и формирование сигнала изменения средней интенсивности по кадру во времени. Полученный сигнал содержит в себе полезную периодическую компоненту, связанную с деятельностью сердечно-сосудистой системы, а также низкочастотные и высокочастотные шумовые компоненты, относящиеся к дыханию и аддитивным шумам, фильтрация которых осуществлялась с помощью преобразования Фурье аналогично [21, 22]. Прошедший фильтрацию сигнал нормировался по отношению к своему среднему значению до фильтрации для устранения неравномерности освещенности от серии к серии. Далее определялась амплитуда полученного сигнала фотоплетизмограммы. Отношение амплитуд фотоплетизмограммы до и после холодовой пробы (R) служило количественной мерой реакции микроциркуляции. Для каждого животного получено по 3 значения указанного отношения до и после воздействия. На основе полученных данных построены диаграммы размаха с помощью MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox.

Раздел работы по фотоплетизмографическому исследованию выполнен в рамках государственного задания НТЦ УП РАН (FFNS-2025-0008) с использованием оборудования Центра коллективного пользования НТЦ УП РАН.

Группа Контроль (физиологический раствор). Носовая полость выстлана однослойным многорядным реснитчатым эпителием, состоящим из 4 типов клеток: реснитчатых и нереснитчатых столбчатых клеток, бокаловидных клеток и базальных клеток. Собственная пластинка обильно васкуляризирована, содержит серозные железы и бокаловидные клетки. Обонятельный эпителий также представляет собой мерцательный псевдомногослойный эпителий, который покрывает верхнюю носовую раковину и самую верхнюю часть перегородки в каждой полости. Обонятельный эпителий отличается наличием желез Боумена, участвующих в выработке слизи. Базальная мембрана под эпителием также содержит кровеносные и лимфатические сосуды (рис. 2 на цв. вклейке).

Рис. 2. Микропрепарат слизистой оболочки носовой полости кролика (группа Контроль).

Сагиттальный срез, окраска гематоксилином и эозином, ×200.

Группа медикаментозного ринита (далее группа Ринит 7d), 7-е сутки. При микроскопическом исследовании слизистой оболочки носовой полости обнаружены начальные реактивные изменения. Эпителиальный слой, представленный однослойным многорядным реснитчатым эпителием, характеризуется ранними признаками дистрофии. Наблюдается незначительное слущивание эпителиальных клеток. В популяции бокаловидных клеток отмечается умеренное преобладание нейтральных муцинов при некотором снижении содержания кислых муцинов. Отмечается легкое повышение количества и размера кровеносных сосудов в исследуемой ткани (рис. 3 на цв. вклейке).

Рис. 3. Микропрепарат слизистой оболочки носовой полости кролика на 7-й день моделирования медикаментозного ринита (группа Ринит 7d).

Сагиттальный срез, окраска гематоксилином и эозином, ×400.

Группа медикаментозного ринита (далее группа Ринит 14d), 14-е сутки. К двухнедельному сроку в слизистой оболочке носовой полости развиваются выраженные патологические изменения. В однослойном многорядном реснитчатом эпителии наблюдаются значительные дистрофические изменения с признаками начинающейся дегенерации клеток. Характерно существенное отторжение эпителиальных клеток с поверхности слизистой оболочки. Определяются очаговые участки со сниженным количеством бокаловидных клеток, в которых отмечается значительное повышение содержания нейтральных муцинов при одновременном снижении содержания кислых муцинов. Сосудистый компонент характеризуется умеренным увеличением количества и размера кровеносных сосудов (рис. 4 на цв. вклейке).

Рис. 4. Микропрепарат слизистой оболочки носовой полости кролика на 14-й день моделирования медикаментозного ринита (группа Ринит 14d).

Сагиттальный срез, окраска гематоксилином и эозином, ×200. Стрелкой указан эпителий.

В ходе эксперимента на 9-й и 11-й дни введения препарата у двух кроликов наблюдались носовые кровотечения из одной половины носа при прикосновении пипеткой к слизистой оболочке носа. Кровотечение самостоятельно останавливалось через 5—10 мин.

Диаграмма размаха получена по данным для трех животных каждой группы (Контроль и Ринит 14d). Результаты представлены на рис. 5.

Рис. 5. Диаграмма размаха (box-plot). Амплитуды фотоплетизмограммы до и после воздействия раствора ксилометазолина 0,1% на слизистую оболочку носа у экспериментальных животных.

По оси ординат — отношение амплитуд (R), точки отображают серии повторных измерений. * — статистически значимая разница между группами (p<0,01).

Сосудистая система слизистой оболочки носа включает сосуды сопротивления (артериолы) и емкостные сосуды (венозные сплетения), регулируемые альфа-адренорецепторами, стимуляция которых обеспечивает противоотечный эффект. При развитии медикаментозного ринита нарушается нормальная регуляция сосудистого тонуса, что может осуществляться следующими механизмами: развитием ишемии слизистой оболочки из-за хронической вазоконстрикции, истощением констрикторных механизмов с развитием тахифилаксии к деконгестантам, повышением сосудистой проницаемости, а также преобладанием вазодилатирующих эффектов бета-адренорецепторов над сосудосуживающим действием альфа-адренорецепторов. Эти патофизиологические механизмы усугубляются высвобождением местных медиаторов воспаления (гистамина, триптазы, кининов, простагландинов и лейкотриенов) и стимуляцией парасимпатической нервной системы, что приводит к развитию отека, экссудации плазмы и повышенной продукции слизи [23].

Однако имеются трудности с возможностью оценки этих изменений на животной модели, так как невозможно оценить назальную обструкцию. В связи с этим мы решили рассмотреть метод ФПГ, который ранее использован для количественной оценки раневого процесса мягких тканей тонзиллярных ниш после тонзиллэктомии на основе анализа пространственного распределения амплитуды фотоплетизмограммы [24]. Данный неинвазивный и оперативный оптический метод исследования для параметров тканей широко используется в различных областях медицины, в том числе в оториноларингологии [25, 26]. В настоящем исследовании рассмотрена возможность применения ФПГ для количественной оценки состояния тканей в ходе моделирования медикаментозного ринита. Для двух контрольных групп проведен анализ значений отношения амплитуд фотоплетизмограммы до и после холодовой пробы (R), характеризующего изменение кровенаполнения при провокационном воздействии. Полученные данные показали статистически значимые различия в реакции микроциркуляции для двух групп (p-value<0,01). При этом максимальное значение в группе Ринит 14d не превышает минимального значения в группе Контроль, что обеспечивает однозначную дифференциацию животных по введенной метрике R. Полученные результаты демонстрируют возможность использования метода фотоплетизмографии для объективного и оперативного исследования in vivo слизистой оболочки носа для решения исследовательских и практических задач оториноларингологии.

По данным литературы, медикаментозный ринит может развиться спустя 3 дня после применения деконгестантов [27]. В проведенных исследованиях на кроликах выявлены четкие временные закономерности развития этих изменений. S.H. Suh и соавт. (1995) замечено, что уже через одну неделю применения как фенилэфрина, так и оксиметазолина наблюдались начальные патологические изменения. У большинства животных отмечалась легкая степень потери ресничек и минимальная воспалительная реакция [28]. Эти ранние изменения свидетельствуют о быстром развитии ответной реакции слизистой оболочки на воздействие деконгестантов. К двухнедельному сроку патологические изменения становились более выраженными. В группе фенилэфрина у животных наблюдалась умеренная потеря ресничек, а у одного животного — тяжелая степень. Кроме того, появлялись признаки эпителиальной десквамации и более интенсивная воспалительная инфильтрация. Это согласуется с данными других исследователей о том, что 2 нед являются критическим сроком для развития медикаментозного ринита [29].

Исследования более длительного применения назальных деконгестантов продемонстрировали, что через 4 нед у 7 из 10 животных, получавших фенилэфрин, отмечалась умеренная или тяжелая потеря ресничек, появлялась выраженная воспалительная инфильтрация, а у 6 из 10 кроликов развился гнойный синусит [28]. Это подтвердили B. Petruson и H.A. Hansson (1982), которые доказали, что длительное применение деконгестантов приводит к необратимым изменениям слизистой оболочки [30]. В наших наблюдениях получены результаты гистологического исследования, сопоставимые с данными литературы.

Нами разработана экспериментальная модель медикаментозного ринита на кроликах. Данные гистологического исследования и использованного впервые метода фотоплетизмографии подтверждают, что местное интраназальное применение 0,1% раствора ксилометазолина по 2 раза в день в каждый носовой ход в объеме 200 мкл/ноздря в течение 14 дней позволяет сформировать модель медикаментозного ринита. В дальнейшем это обеспечит возможность проведения исследований новых способов лечения с перспективой внедрения в клиническую практику. При моделировании медикаментозного ринита в работе апробирован новый метод количественной оценки состояния слизистой оболочки полости носа — фотоплетизмография. Данное исследование неинвазивно, не представляет технических сложностей при проведении и позволяет получить объективные результаты в сочетании, сопоставимые с данными гистологического исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.