Экспрессия парвальбумина в ГАД67-иммунореактивных нейронах промежуточной зоны грудного спинного мозга у мышей C57BL/6 в условиях сенсорной денервации

Денервационные синдромы при выпадении афферентной стимуляции с периферии включают в себя нарушения чувствительности, нарушения локомоции и вызывают изменения в постсинаптических нейронах. Промежуточная зона спинного мозга (СМ) является интегративной областью, обеспечивающей реализацию соматосенсорных и висцеросенсорных рефлекторных путей [1, 2]. Выпадение контролирующих афферентных влияний с периферии связано с растормаживанием и повышением возбудимости деафферентированных спинальных интернейронов вследствие выпадения супраспинальных нисходящих тормозных влияний, нарушения спинальных механизмов тормозного контроля [3, 4].

Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) действует как тормозной нейротрансмиттер в нейронных сетях СМ и играет решающую роль в регуляции боли, двигательных движений и дыхательных ритмов [5]. ГАМКергические нейроны присутствуют практически во всех пластинках СМ и являются основной частью нейронных сетей, участвуя в пресинаптическом торможении ноцицептивной и неноцицептивной импульсации, поступающей с первичных афферентов [6, 7].

Возбуждение нейронов всегда ограничивается механизмами тормозного контроля. Дефицит торможения и растормаживание нейронов присутствуют практически при всех формах патологии нервной системы. В условиях патологии содержание внутриклеточного кальция может сохраняться на высоком уровне, а одним из механизмов снижения содержания кальция является его внутриклеточное депонирование кальций-связывающими белками [1, 8]. В онтогенетических исследованиях установлено, что кальций-связывающий белок парвальбумин (ПАВ) экспрессируется в популяции спинальных тормозных интернейронов [9, 10].

Цель исследования — изучение структурных характеристик интернейронов промежуточной зоны СМ, содержащих декарбоксилазу глутаминовой кислоты 67 кДа и кальций-связывающий белок ПАВ, в условиях длительного антиортостатического вывешивания и химической деафферентации капсаицином у взрослых самок мышей.

Объектом исследования стали нейроны промежуточной зоны (сегментов T3—T5) СМ самок мышей C57BL/6 в возрасте 16 нед. Животные были разделены на три группы: группа контроля (n=4) — животные находились в условиях свободного поведения; группа АОВ (n=4) — животные в модели длительного антиортостатического вывешивания; группа ДА (n=4) — животные в условиях химической деафферентации. В группе АОВ моделировали условия по методу Ильина—Новикова в модификации Morey—Holton [11], характерные для пребывания в невесомости. Устраняли опорную и осевую нагрузку на мышцы задних конечностей с перераспределением крови к головной части тела мыши в результате вывешивания мышей за хвост под углом 45° относительно головы с опорой на передние лапы. В группе ДА моделировали условия, характерные для деафферентации путем подкожного введения капсаицина (Capsaicin, «Sigma») однократно в дозе 50 мг/кг в растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (0,01 М, pH 7,4) («БиолоТ», Россия), содержащего 10% этилового спирта и 10% твина-80 [12]. Забор материала осуществлялся через 30 сут от начала эксперимента, в группах АОВ и ДА одновременно с группой контроля. Эксперименты выполнялись в соответствии с решением этического комитета ФГБОУ ВО «Ярославский государственный медицинский университет» Минздрава России (протокол №21 от 02.08.17).

Эвтаназию животных осуществляли под уретановым наркозом (3 г/кг, внутрибрюшинно) путем транскардиальной перфузии раствора стандартного ФСБ (0,01 М, pH 7,4) («БиолоТ», Россия), затем 4% раствора параформальдегида («Sigma», США) на ФСБ. Для исследования использованы сегменты T3—T5 СМ, которые дополнительно фиксировали в 4% растворе параформальдегида на ФСБ, криопротекцию проводили в 30% растворе сахарозы. Из образцов СМ в криостате Shandon E («Thermo Scientific», Великобритания) готовили поперечные серийные срезы толщиной 14 мкм. Для выявления нейронов использовали каждый 5-й из серийных срезов — по 15 срезов с каждого объекта.

Иммунореактивные (ИР) интернейроны к белкам декарбоксилазе глутаминовой кислоты 67 кДа (ГАД67) и ПАВ выявляли иммуногистохимическим методом: первичные антитела моноклональные мышиные против ГАД67 (MAB5406, «Merck», США) и поликлональные кроличьи против ПАВ (ab11426, «Abcam», Великобритания) в разведениях 1:500; вторичные ослиные антитела («Jackson Immuno Research Laboratories», США) против мышиного иммуноглобулина G2а, конъюгированные с индокарбоцианином (Cy3), дающим красную флюоресценцию нейронов, и против кроличьего иммуноглобулина G, конъюгированные с флюоресцеина изотиоцианатом (FITC), дающим зеленую флюоресценцию нейронов, в разведениях 1:100. Для исключения неспецифической реакции часть срезов инкубировали без первичных и/или вторичных антител. Окраску клеток всей популяции интернейронов проводили красителем, флюоресцирующим в красной области спектра, Neuro Trace Red Fluorescent Nissl Stains («Molecular Probes», США), разведение 1:200. Колокализацию белков ГАД67 и ПАВ в спинальных интернейронах выявляли иммуногистохимическим методом одномоментного двойного мечения первичными антителами, вторичные антитела конъюгировали последовательно. После этого срезы отмывали в ФСБ и заключали в среду для иммунофлюоресценции Vectashield («Vector Laboratories», США).

Препараты анализировали на микроскопе Olympus BX43 («Olympus Corporation», Япония), оснащенном набором флюоресцентных фильтров-блоков. Изображения получали посредством охлаждаемой цифровой видеокамеры TCC-5.0ICE («Tucsen», Китай). На срезах под объективом 10×0,30 изучали топографические характеристики нейронов промежуточной зоны СМ, устанавливая их соответствие пластинке VII, конфигурация которой соответствовала сегментам T3—T5 СМ мыши [13]. Подсчет количества и измерение площади сечения (ПС) нейронов проводили по программе Image J («NIH», США) на изображениях срезов, полученных под объективом 20×0,50. Долю ПАВ-ИР и ГАД67-ИР интернейронов определяли как их отношение к общему количеству интернейронов, выявленных с помощью Neuro Trace Fluorescent Nissl Stains, которое принимали за 100%. Анализу подлежали нейроны, срез которых прошел через ядро с видимым ядрышком и с флюоресценцией, превышающей фоновое свечение. Для определения средних арифметических и их стандартных ошибок использовали программу Statistica v. 10 («StatSoft, Inc.», 2011). Учитывая количество групп сравнения (более двух) и то, что полученные выборки были разного объема, для детального поиска различий в исследовании применяли однофакторный дисперсионный анализ вариаций ANOVA и критерий Тьюки анализа post hoc. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

У мышей группы контроля общее количество интернейронов на поперечном срезе СМ в промежуточной зоне составило 37,2±0,4, оно значимо не менялось после вывешивания (у мышей группы АОВ) — 38,9±1,2 и у мышей группы ДА — 35,7±0,3. Количество ПАВ-ИР и ГАД67-ИР интернейронов в промежуточной зоне СМ было всегда значительно меньше, чем общее количество интернейронов, выявленных с помощью Neuro Trace Fluorescent Nissl Stains, в каждой группе наблюдения.

На поперечных срезах СМ в пластинке VII ПАВ-ИР и ГАД67-ИР интернейроны располагались диффузно в виде одиночных клеток, характеризовались яркой флюоресценцией нейроплазмы и проксимальных частей отростков (см. рисунок). Интенсивность свечения была одинаковой во всех группах наблюдения. Область локализации симпатических преганглионарных нейронов была иммунонегативна к обоим белкам. Гистологический анализ показал, что все ПАВ-ИР интернейроны содержали ГАД67, но не все ГАД67-ИР интернейроны содержали ПАВ.

Парвальбумин (а, б, д, е) и ГАД67 (в—е) содержащие нейроны в промежуточной зоне грудного спинного мозга у мышей С57BL/6 в контроле (а, в, д) и после химической деафферентации капсаицином (б, г, е) (×200).

Позиционирование (д, е) путем объединения изображений одного и того же поля зрения, полученных мультиканальной флюоресценцией с различными спектрами флюорохромов в следующих комбинациях: а+в(д); б+г(е). Римскими цифрами обозначены пластинки спинного мозга.

Подсчет интернейронов с ПАВ+ГАД67 показал, что доля их не превышала 1% у мышей группы контроля и группы АОВ; у мышей группы ДА отмечалось значимое увеличение доли ПАВ+ГАД67-ИР нейронов — более чем в 7 раз по сравнению с группой контроля (см. таблицу).

Относительное содержание иммунореактивных нейронов и их площадь сечения в пластинке VII спинного мозга (X±S_x)

Примечание. ОС — относительное содержание; ПС — площадь сечения; * — различия достоверны по сравнению с контролем (p<0,05).

ПС ПАВ+ГАД-ИР интернейронов у мышей группы контроля составила 128,5±2,2 мкм² и значимо не менялась после вывешивания (в группе АОВ) (см. таблицу). У мышей группы ДА наблюдалось значимое увеличение ПС ПАВ+ГАД67-ИР интернейронов (ПС на 13% больше, чем в группе контроля).

Во всех группах наблюдения подсчет интернейронов с ГАД67 показал, что доля их не превышает 6% (см. таблицу). ПС ГАД67-ИР интернейронов у мышей группы контроля составила 132,4±2,5 мкм² и значимо не менялась после вывешивания (в группе АОВ). У мышей группы ДА наблюдалось значимое увеличение ПС ГАД67-ИР интернейронов (ПС на 12% больше, чем в группе контроля).

Таким образом, в отличие от антиортостатического вывешивания химическая деафферентация изменяла количественные и структурные характеристики ПАВ+ГАД67-ИР интернейронов промежуточной зоны СМ.

Особенности распределения нейронов с ПАВ в сером веществе СМ позволяют сделать вывод о топографической обособленности этой популяции нейронов. Зоны экспрессии ПАВ в сером веществе СМ ограничены глубокой областью дорсального рога (пластинки III—IV—V) [14], промежуточной зоной (пластинка VII) [1] и областью вентрального рога (пластинка VIII) [15]. Известно, что в этих пластинках локализуются вставочные нейроны, обеспечивающие интеграцию сенсорной информации с информацией, которая спускается от супраспинальных структур мозга [1, 2]. Серое вещество СМ содержит множество тормозных интернейронов, опосредующих межнейрональные связи через ГАМК и/или глицин [5]. Так, к нейронам глубокой области СМ проецируется импульсация от мышечных и кожных афферентов, от нижележащих сегментов, а также от путей пирамидной и экстрапирамидной систем, включая ретикулярную формацию. Дендритные проекции обнаруживают связи с нейронами поверхностной области СМ (пластинки I—II), а аксональные проекции к интернейронам промежуточной зоны свидетельствуют о принадлежности этих нейронов к комиссуральным и ипсилатеральным премоторным интернейронам [1, 14]. Последними исследованиями установлено, что ПАВ экспрессируется именно в популяции типичных тормозных спинальных нейронов у кошек и крыс [16], что согласуется с полученными данными.

Известно, что ПАВ не только участвует в буферизации свободного внутриклеточного кальция, но также играет роль в поддержании кальциевого гомеостаза спинальных нейронов [8]. Из-за различий в структуре кальций-связывающих доменов семейство кальций-связывающих белков обладает различной степенью сродства к кальцию [17]. ПАВ также связывает катионы натрия и калия, при этом белок связывает ионы натрия на порядок сильнее по сравнению с ионами калия [8].

Таким образом, ассоциативные нейроны промежуточной зоны СМ, содержащие ПАВ и ГАД67, включаются в спинальные нейронные сети, реализующие ноцицептивный ответ на уровне СМ. Выраженные изменения экспрессии ПАВ в нейронах этой области СМ в условиях химической деафферентации, очевидно, связаны с чрезмерным накоплением ионов кальция и натрия с развитием отека в результате отсутствия ноцицептивных влияний.

Влияние капсаицина на ноцицепцию не ограничивается его способностью вызывать боль. Используемые в работе токсические дозы капсаицина приводят к десенсибилизации, а одним из механизмов индуцированной капсаицином аналгезии является десенситизация TRPV1-рецепторов вследствие гибели сенсорных нейронов. Ранее нами было установлено, что деструкция нейронов чувствительных узлов обусловлена повышением уровня внутриклеточного кальция и натрия, что создает порочные круги в развитии десенситизации TRPV1-рецепторов: избыточный приток кальция в нейрон активирует кальций-связывающие белки, кальций-зависимые белки ингибируют кальциевые каналы и увеличивают приток внеклеточного натрия [18]. При этом чрезмерное накопление внутриклеточного кальция в свою очередь также может приводить к патологии нейрона, вызывая его гибель [19]. В то же время избыток натрия и кальция деполяризует мембрану нейрона и возбуждает дендриты. Считается, что пресинаптические окончания ГАМКергических нейронов промежуточной зоны СМ формируют синаптические триады, образуя аксо-аксональные синапсы не только с первичными афферентами, но и с дендритами, которые являются постсинаптическими по отношению к первичным афферентам.

Одним из механизмов снижения содержания внутриклеточного кальция является его внутриклеточное депонирование ПАВ, который обладает функцией цитоплазматического депо [8]. Показано, что особенно высока экспрессия ПАВ в нейронах, разряжающихся с высокой частотой [6]. ПАВ связывает катионы кальция, блокирует выход ионов калия из нейрона, тем самым препятствуя развитию гиперполяризации и обеспечивая высокочастотные ответы [20]. Таким образом, увеличение содержания ПАВ в тормозных спинальных нейронах может рассматриваться как один из компенсаторных механизмов снижения содержания активного кальция в нейронах в условиях ограничения ноцицептивных влияний, индуцированных капсаицином.

Отсутствие ноцицептивных влияний приводит к изменению тормозных контролирующих спинальных механизмов интегративной зоны грудного СМ и сопровождается структурно-функциональными перестройками спинальных нейронов этой области спинного мозга. Увеличение содержания ПАВ в популяции нейронов с ГАД67 соответствует накоплению в них катионов кальция, что обеспечивает в данных условиях нечувствительность популяции ГАМКергических нейронов к стимуляции или же повышает чувствительность этих нейронов к возможной сохранной или последующей восстановительной их стимуляции в условиях созданного дефицита ноцицептивной афферентации. Отсутствие деструкции и гибели нейронов этой области СМ позволяет предположить именно адаптивный эффект ПАВ, направленный на коррекцию содержания кальция в популяции тормозных нейронов промежуточной зоны СМ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.