Введение

Опухолевые стволовые клетки (ОСК) — специфические клетки опухоли, которые ассиметричным делением дают начало опухолевым прогениторным клеткам и сохраняют стволовой потенциал. Считается, что ОСК играют решающую роль в возникновении, прогрессировании, метастазировании и рецидиве опухоли.

В последнее время активно изучается роль ОСК в диагностике и оценке эффективности лечения онкологических заболеваний. Большинство противоопухолевых препаратов вызывают массированную гибель опухолевых клеток, при этом ОСК не погибают, и их дальнейшее деление стимулирует восстановление злокачественного образования, что приводит к рецидиву заболевания. В связи с этим актуальным является поиск возможности идентифицировать ОСК, что позволит оценивать эффективность лечения онкологических патологий. Несмотря на накопленные к настоящему времени экспериментальные и теоретические данные о функционировании ОСК, многие биологические свойства ОСК остаются малоизученными.

На данный момент предпринимаются попытки характеризовать ОСК при глиобластоме с использованием экспрессии уникальных поверхностных биомаркеров. Одним из таких биомаркеров является CD133 (проминин-1), трансмембранный гликозилированный белок. При этом в ряде работ CD133 позиционируется как прогностический молекулярный маркер и терапевтическая мишень во многих солидных опухолях, включая глиомы, карциному предстательной железы, колоректальный рак и др. Повышенную представленность CD133 в опухоли связывают с ее рецидивом, неблагоприятным прогнозом, низкой выживаемостью пациентов. При этом ряд других исследований ставят под сомнение подобную значимость CD133 для оценки злокачественности опухоли. В данном обзоре предпринята попытка проанализировать различные данные и продвинуться в понимании прогностической значимости CD133 при глиоме головного мозга.

Опухолевые стволовые клетки и маркеры ОСК

Традиционный взгляд на опухолевые клетки предполагает, что все они обладают потенциалом к самообновлению, размножению, росту и рецидиву опухоли. Во время раннего периода развития опухоли одна или несколько клеток трансформируются, вследствие эволюционного накопления различных мутаций с последующим нарушением систем поддержания стабильности генома. Такие изменения клеток приводят к образованию гетерогенных субпопуляций внутри опухоли и ее неконтролируемому росту. То есть все клетки считаются онкогенными и являются мишенями для лечения. Другая теория возникновения опухоли — это теория ОСК [1, 2]. Эта гипотеза предполагает, что единичные мутировавшие ОСК получают неограниченный пролиферативный потенциал, и именно эти клетки создают опухоль. Пролиферирующие клетки, стимулирующие ее рост, рецидив и устойчивость, составляют малый процент опухоли и обладают некоторыми качествами стволовых клеток. Большинство клеток-потомков продолжают симметрично делиться, накапливая разнообразные мутации и увеличивая ее гетерогенность. В рамках этой гипотезы происхождения опухоли ОСК находятся на вершине энтропийной иерархии и позволяют новообразованию сохранять устойчивость к терапии. Следует помнить, что множество маркеров, используемых для выделения ОСК, определяет множество клеток в разных клеточных состояниях с разными генотипами; и зачастую разные исследовательские группы используют термин «ОСК» для обозначения совершенно разных популяций клеток [3].

Впервые ОСК были выделены и описаны D. Bonnet и Y.E. Dick в 1997 г. [4]. В качестве маркеров ОСК глиомы могут выступать NESTIN, SALL4, OCT-4, STAT3, NANOG, c-Myc, KLF4, KLF4, CD133, CD44, CD15, GFAP, OLIG2, BMI1, L1CAM A2B5, Musashi, Integrin 6α1 [5,6]. Однако для характеризации ОСК глиомы удобны именно поверхностные маркеры, которые можно распознавать специфичными антителами, а внутриклеточные маркеры, подобные NESTIN, редко используются для прижизненной клеточной идентификации [6].

Биохимические характеристики CD133

CD133 представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой около 97 кДа (см. рисунок). Белок содержит внеклеточный N-концевой домен (EC1), пять трансмембранных участков, которые разделяют две небольшие внутриклеточные петли (IC1 и IC2) и две большие внеклеточные петли (EC2 и EC3), а также внутриклеточный C-концевой домен, называемый терминальным (IC3) [7]. Внеклеточные петли содержат 9 предполагаемых сайтов N-гликозилирования. Гликозилирование CD133 увеличивает массу белка до 120 кДа, изменяет общую третичную структуру и повышает стабильность. Ген CD133, который получил название проминин 1 (PROM1), [8] контролируется пятью альтернативными промоторами, три из которых расположены на CpG-островках и частично регулируются метилированием. Эти промоторные области ответственны за альтернативный сплайсинг мРНК CD133 и структурные варианты CD133 с потенциально уникальными функциями [7]. У белка имеется 3 изоформы [6].

Структурная организация белка CD133 на поверхности ОСК глиомы человека.

Создано с использованием ресурса https://biorender.com.

CD133 участвует в клеточной дифференцировке, эпителиально-мезенхимальном переходе и является маркером нейральных стволовых клеток человека. Белок выполняет функции модулятора эффектов широкого спектра цитокинов и влияет на активность различных мембранных рецепторов, а увеличение представленности данного маркера может привести к структурно-функциональным изменениям клеток с повышенной вероятностью их опухолевой трансформации [9].

Показано, что клетки CD133⁺ обладают высокой активностью теломеразы — вероятно, это является фактором повышенной жизнеспособности и пролиферации ОСК глиомы [6].

CD133 как маркер стволовых клеток глиомы

Существуют два кардинально различных мнения о значимости CD133 как маркера ОСК глиомы. С одной стороны, опубликовано большое количество исследований, которые доказывают, что наличие CD133 на поверхности опухолевых клеток обуславливает сохранение их стволовых свойств [10]. Есть работы, которые показывают, что в глиобластоме CD133 экспрессируется эндотелием, который поддерживает пролиферацию микрососудов и ускоряет рост опухоли [11, 12]. Было выдвинуто предположение, что экспрессия CD133 характеризует высокую представленность ОСК и говорит об активном росте опухоли головного мозга [13].

Однако существует и альтернативная точка зрения, что клетки, экспрессирующие CD133, не критичны для глиомагенеза. Было обнаружено, что ОСК глиомы присутствуют как в популяции клеток CD133⁺, так и в популяции клеток CD133^— глиобластомы человека [14]. Кроме того, ни одна популяция стволовых клеток из любого типа ткани не была выделена до клональной чистоты только на основе CD133. Если соотнести обе гипотезы, то, по крайней мере, можно утверждать, что идентификация ОСК не может быть основана исключительно на экспрессии одного CD133 [5].

На данный момент достаточно убедительным для идентификации ОСК глиомы является использование CD34 в сочетании с CD133 и CD90, при условии отсутствия CD38 [15].

Кроме того, неоднозначность характеризации ОСК обуславливается наличием и разной представленностью различных сплайс-форм CD133 [12].

CD133 остается предметом споров ученых и по сей день, однако многие исследователи все же склоняются к тому, что CD133 является маркером ОСК глиомы. Так, в исследовании K. Holmberg Olausson и соавт. [16] наблюдали вариабельность уровней экспрессии CD133 в глиобластоме человека, где более высокая экспрессия CD133 коррелировала с более короткой выживаемостью пациентов.

В новой работе M. Rehfeld и соавт. показано, что CD133 по-разному экспрессируется пролиферирующими и непролиферирующими клетками глиомы. Представлены доказательства, что более 50% пролиферирующих клеток в эпендимальных опухолях экспрессировали CD133, и при этом наблюдали значительно меньший процент его экспрессии в опухолях олигодендроглиального и астроцитарного происхождения [17].

Влияние CD133 на более короткое выживание, прогрессирование и рецидив опухоли

Если не поднимать спор о CD133 как маркере ОСК глиомы, а остановиться только на значимости CD133 как маркера низкой выживаемости, то и тут мнения разнятся. Одни ученые предполагают, что в опухолях ЦНС повышенная доля клеток CD133⁺ коррелирует с более низкой общей выживаемостью (ОВ), а количество мРНК PROM1 позволяет отличить глиобластому от опухолей низкой степени злокачественности. Другие ученые утверждают, что нельзя считать CD133 единичным молекулярным маркером агрессивности опухоли и предполагают, что за агрессию отвечает их совокупность. Но есть и работы, показывающие, что CD133 вовсе не является прогностическим признаком и не может считаться маркером злокачественности. Таким образом, корреляция между экспрессией CD133 с развитием опухоли и с выживаемостью больных все еще требует изучения. В таблице представлены публикации, отражающие мнения о значимости CD133 для злокачественности опухоли ЦНС.

Мнения авторов научных исследований о значимости CD133 для злокачественности опухоли

Примечание. ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения; grade — степень злокачественности опухоли.

Метилирование промотора CD133 как прогностический фактор

В ряде работ выдвигается предположение, что важна именно степень метилирования промоторной области гена PROM1. В работе X. Wu и соавт. оценили прогностическую значимость экспрессии CD133 и статуса метилирования промотора CD133 в серии из 170 образцов глиом различной степени злокачественности и гистологии [31]. Было показано, что статус метилирования промотора CD133 является значимым прогностическим фактором. Не было выявлено корреляции между представленностью белка CD133 в клетках опухоли и выживаемостью пациентов. Также не наблюдалось корреляции между экспрессией белка CD133 и статусом метилирования промотора CD133. Совокупность этих результатов позволяет предположить, что степень метилирования промотора CD133 является многообещающим инструментом для диагностики.

Методы детектирования CD133

Для визуализации и анализа CD133 используют различные молекулярные методы: иммуногистохимию, проточную цитометрию, иммуносортинг. Вестерн-блот анализ или ПЦР в реальном времени не очень популярны при оценке представленности CD133 в клетках, поскольку в ней присутствует две формы этого белка — цитоплазматический PROM1 и мембранный CD133. Недостатком иммуногистохимии и проточной цитометрии является то, что оба метода требуют использования антител для идентификации клеток, экспрессирующих CD133, а поскольку CD133 представляет собой гликопротеин с несколькими структурами N-гликанов, вариабельность гликозилирования может влиять на связывание антител [7, 8].

Однако, вопреки вышеописанным недостаткам, наиболее популярным методом идентификации CD133 считаются проточная цитометрия [32], например, с использованием иммобилизованных на магнитных шариках антител [33].

Регуляция экспрессии CD133: эпигенетические факторы, сигнальные пути, микроРНК

Безусловно, экспрессия CD133 должна регулироваться многоуровневым контролем и влиять на опухолевые каскады. Известна роль различных сигнальных путей в контроле этой экспрессии. Все больше данных свидетельствуют о функциональной связи CD133⁺ ОСК с протеинкиназой B (AKT). Предполагают, что химиорезистентность CD133+ ОСК может быть обусловлена именно активацией Akt [34].

Исследования роли CD133 в различных сигнальных каскадах при онкогенезе ведутся не только на опухолях ЦНС. Например, обнаружено, что CD133 клетки в гепатоцеллюлярной карциноме активируют сигнальный путь AKT/PKB и увеличивают экспрессию внутриклеточного Bcl-2, что приводит к повышению устойчивости опухолевых клеток к химиотерапии. Обработка CD133⁺ клеток ингибитором, специфичным для Akt1, снижала экспрессию белков Akt, Bad и Bcl-2 и улучшала чувствительность клеток к химическому воздействию [34].

В другой работе было показано, что повышенная экспрессия CD133 в клетках рака поджелудочной железы приводила к снижению экспрессии EGF, возрастанию экспрессии теломеразы и усилению фосфорилирования Akt, что также способствовало увеличению жизнеспособности опухолевых клеток [35].

Что касается регуляции экспрессии CD133 в опухолевых клетках глиомы, то было доказано участие Sp1 и Myc в этом процессе: повышение экспрессии Sp1 или Myc увеличивало уровень CD133 в опухоли [36].

Следует отметить, что важную роль играет и микроокружение внутри опухоли. Было показано, что гипоксия в микроокружении опухоли глиомы способствует экспрессии CD133 в опухолевых клетках за счет повышения уровня индуцируемого гипоксией фактора-1α [37].

Интересные данные получили Tian и соавт., которые показали регуляцию CD133 посредством малых РНК [38]. В работе Bisson и соавт. сообщается о значимой роли CD133 как индуктора передачи сигналов Wnt/β-catenin в ОСК [39]. В частности, подавление CD133 было связано с потерей ядерной локализации β-catenin и снижением канонической передачи сигналов Wnt.

Предполагается функционирование CD133 как рецептора клеточной поверхности для AKT-зависимой активации Wnt, что может иметь значение для разработки новых терапевтических подходов нацеленных на PI3K/AKT или Wnt [40].

A.B. Mak и соавт. показали, что деацетилаза HDAC6 физически связывается с CD133 и β-катенином в виде тройного комплекса, стабилизируя β-катенин. Снижение экспрессии CD133 либо HDAC6 приводило к усилению деградации β-катенина, что коррелировало с уменьшением пролиферативного потенциала опухолевых клеток [41].

Становится понятным, что CD133 может рассматриваться в качестве неканонического рецептора опухолевых клеток для активации ряда онкогенных сигнальных путей. Канонический сигнальный путь Wnt характеризуется накоплением β-катенина в ядре клетки: β-катенин контролирует клеточную пролиферацию посредством активации транскрипции TERT [42], и TERT можно рассматривать как одну из ключевых мишеней сигнального пути Wnt/β-catenin. Также TERT обладает способностью взаимодействовать с брахма-геном-1 (BRG1), фактором ремоделирования хроматина и облегчает привлечение BRG1 к генам β-катенина для активации их транскрипции [43]. Учитывая тот факт, что теломераза может положительно регулировать экспрессию β-катенина, логичным будет допустить существование обратной связи между уровнями TERT и β-катенином в CD133⁺ ОСК.

Терапевтические стратегии, нацеленные на CD133

Полученные результаты дают надежду, что терапия, направленная на CD133⁺ опухолевые клетки, может обеспечить перспективы. Сообщалось, что повышенная экспрессия CD133 коррелировала с плохим прогнозом результатов лечения пациентов с глиобластомой [44, 45]. Учитывая, что подобный вывод был сделан как при высокой представленности ОСК, так и при фракции CD133⁺ клеток можно предположить, что эти две фракции как минимум пересекаются [46].

Таргетное лечение, нацеленное на CD133, рассматривает терапевтическое действие не только на CD133⁺ опухолевые клетки, но и окружающие опухолевые клетки без CD133, а также на микроокружение опухоли посредством везикулярной межклеточной коммуникации [12].

Показано, что терапия глиобластомы, направленная на CD133, значительно снижает пролиферацию клеток и рост опухоли как в CD133⁺ клетках in vitro, так и in vivo [23].

Поэтому на данный момент разрабатываются различные методы терапии, специфичные к CD133⁺. Одна из привлекательных технологий — это использование наночастиц, насыщенных терапевтическими молекулами и таргетных к CD133⁺ опухолевым клеткам. Например, была показана эффективность доставки наночастиц, нацеленных на CD133, с использованием РНК-аптамеров [47, 48].

Выводы

Характеристики соматических стволовых клеток были идентифицированы в опухолевых клетках, поэтому в последнее время большая часть исследований глиомы была сосредоточена на гипотезе ОСК, предполагая, что они обладают способностью инициировать новые злокачественные образования. Более того, ОСК глиомы были предложены в качестве причины резистентности к лучевой- и химиотерапии. Предполагается, что ОСК глиомы характеризуются совокупностью молекулярных маркеров, одним из которых является CD133.

На текущий момент клинические исследования, как проанализировано в обзорах [7, 49], продолжают подтверждать мнение, что CD133 может быть важным прогностическим маркером в отношении ОВ и выживаемости без прогрессирования заболевания у пациентов с онкологией головного мозга. Несмотря на отсутствие знаний о молекулярных основах функционирования CD133 при злокачественной опухоли, большинство текущих исследований действительно предполагают, что CD133 обладает прогностической ценностью для оценки выживаемости при различных солидных опухолевых заболеваниях. Таким образом, клиническая применимость CD133 как прогностического биомаркера глиобластомы требует дальнейшего изучения.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации «Развитие биоресурсной коллекции опухолей нервной системы человека с молекулятно-генетической паспортизацией для персонифицированного лечения пациентов с нейроонкологическими заболеваниями» (соглашение №075-15-2021-1343 от 4 октября 2021 г.).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Зверева М.Э.

Сбор и обработка материала — Зверева М.Э., Кисиль О.В., Грабовенко Ф.И., Павлова Г.В.

Написание текста — Зверева М.Э., Кисиль О.В., Грабовенко Ф.И., Павлова Г.В.

Редактирование — Кисиль О.В., Грабовенко Ф.И., Павлова Г.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.