Рак легкого — прогностически неблагоприятная высоколетальная опухоль в связи с поздней диагностикой. Аденокарцинома легкого (АКЛ) отличается высокой резистентностью к большинству методов современной противоопухолевой терапии [1]. Хирургическое лечение, химио- и лучевая терапия оказываются неэффективными, поскольку не способны уничтожить ключевые клетки канцерогенеза — раковые стволовые клетки (РСК), биологические свойства которых обусловливают устойчивость к традиционным методам терапии, опухолевую прогрессию, а также рецидивы после лечения и метастазирование [2, 3]. В опухоли РСК присутствуют в небольшом количестве и представляют собой динамическую популяцию за счет присущей им пластичности, способности самообновляться, создавая гетерогенную опухолевую массу [4]. РСК существуют не изолированно, они находятся в тесной взаимосвязи и взаимодействии с окружающими их клетками и компонентами стромы. Вместе они формируют так называемую нишу РСК. Взаимодействие клеточных и неклеточных компонентов ниши позволяет реализовывать все биологические эффекты РСК за счет секреторных и ростовых факторов, выработка которых осуществляется посредством сигнальных путей, аналогичных путям регуляции стволовых клеток организма [5]. Гетерогенность в группе клеток с признаками «стволовости», приводит к появлению субпопуляций РСК, различающихся по биологическому потенциалу и предназначению, и как следствие — к молекулярному профилю, который может изменяться в процессе жизненного цикла, обусловливая тем самым сложности при их выявлении [5—8].

Маркеры стволовости, которые по результатам наших исследований и данным литературы [9—11] экспрессируются в РСК рака легкого с наибольшей частотой, — это ALDH1, CD133 и CD34.

ALDH1 представляет собой внутриклеточный фермент группы альдегиддегидрогеназ, вовлечен в сигнальные пути, связанные с важнейшими метаболическими процессами, важнейший из которых детоксикация токсичных метаболитов, включая химиотерапевтические препараты и дифференцировку клеток; признан маркером, позволяющим идентифицировать РСК в солидных опухолях легкого, молочной железы, колоректальном раке и др. [12, 13]. В ряде работ [14, 15] показаны высокое содержание этого фактора в РСК в отличие от нормальных, а также способность ALDH1+позитивных-клеток образовывать сфероиды и проявлять онкогенность при трансплантации иммунодефицитным мышам.

CD133 представляет собой гликопротеин, экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках и стволовых клетках взрослого организма, считается поверхностным маркером РСК, в том числе рака легкого, обсуждается его роль в регулировании сигнальных метаболических путей и в межклеточной коммуникации с формированием CD133+ микровезикул и/или экзосом [16, 17]; его рассматривают как потенциальную терапевтическую мишень и прогностический фактор у пациентов с раком легкого, предстательной железы и колоректальной карциномой. Имеются данные, что CD133 может регулировать пролиферацию и химиорезистентность раковых клеток [18].

CD34 представляет собой поверхностный трансмембранный белок. Биологическое значение CD34 многогранно и неоднозначно: участие в васкуло- и ангиогенезе, кроветворении, регенераторных процессах и воспалении. Он используется для идентификации и выделения стволовых кроветворных клеток и РСК в гематологических и негематологических злокачественных новообразованиях [11]. Известно участие CD34 в адгезии клеток и ее регуляции посредством воздействия на интегрины и селектины, которые в свою очередь играют решающую роль в миграции, пролиферации и дифференцировке клеток. В ряде работ показано, что CD34+позитивные РСК обладают повышенной способностью к самообновлению и инициации образования опухоли по сравнению с CD34-негативными РСК. Существует гипотеза, что экспрессия CD34 в ткани опухоли может быть связана с повышенной агрессивностью опухоли и устойчивостью к химиотерапии, склонностью к рецидивам и возникновению метастазов [19—21].

Вопросы, касающиеся идентификации РСК, их возможной гетерогенности и взаимодействия РСК с микроокружением в опухолях легкого чрезвычайно сложны, не до конца изучены и остаются актуальными, поскольку поиск методов терапии, воздействующих непосредственно на РСК, с минимизацией возможных побочных эффектов и осложнений представляется в настоящее время одним из основных направлений в борьбе с онкологическими заболеваниями [22—24].

Цель исследования — выявление раковых клеток АКЛ с признаками стволовости и их гетерогенности по экспрессии маркеров ALDH1, CD133 и CD34 в клеточной культуре A549 и операционном материале в зависимости от гистологического типа, степени злокачественности и стадии опухолевого процесса.

Материал и методы

Был изучен операционный материал АКЛ от 32 пациентов. Кроме того, в опытах in vitro мы исследовали культуру клеток АКЛ A549 (ПраймБиоМед).

Операции производились в торакальном отделении УКБ №1 и УКБ №4 Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Макроскопическое исследование операционного материала сопровождалось забором не менее 3 фрагментов опухолевой ткани, 3 кусочков интактной ткани легкого, а также лимфатических узлов. Образцы фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали в парафин, изготавливали парафиновые срезы и окрашивали гематоксилином и эозином [25]. Иммуногистохимическое исследование проводили иммунопероксидазным способом по стандартному протоколу [26] с использованием полилизиновых стекол (Leica Biosystems, предметные стекла Snowcoat X-TRA с адгезивной поверхностью, не требующие дополнительной обработки) на парафиновых срезах первичной АКЛ, лимфатические узлы подвергались гистологическому исследованию без идентификациии РСК в метастатических очагах. Для верификации диагноза и подтверждения первичного характера процесса использовали антитела к TTF1 (SpringBioscience, SP141, 1:100), СК7 (ПраймБиоМед, PBM-12F1, 1:100), Napsin A (Leica Biosystems, Novocastra, клон NCL-L-Napsin A, разведение 1:400), Ki-67 (ПраймБиоМед, клон GM010, 1:100), CDX2 (ПраймБиоМед, клон PBM-1C7, 1:100), SATB2 (Cell Marque Corporation, клон lEP281, 1:100).

Клетки A549 культивировали в среде DMEM, содержащей 2 мМ глутамина, раствор антибиотика-антимикотика (100 Е пенициллина, 100 мкг стрептомицина и 250 нг амфотерицина B в 1 мл) с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, при 37 °C и 5% CO₂. Морфологическое исследование проводили после окрашивания гематоксилином и эозином по стандартной методике [25]. Для иммуногистохимических исследований клетки A549 промывали раствором Версена, снимали с чашек 0,25% трипсином, подсчитывали и рассаживали в чашки Петри на стерильные предметные стекла с полилизиновым покрытием по 10⁶ клеток в 1 мл ростовой среды и инкубировали в течение суток. Неокрашенные стекла с клетками подвергали иммуногистохимическому исследованию. В качестве первичных антител, маркеров РСК, применяли антитела к ALDH1 (Huabio, Polyclonal Rabbit Antibody, разведение 1:200), CD133 (Huabio, Polyclonal Rabbit Antibody, разведение 1:500), CD34 (Huabio, Polyclonal Rabbit Antibody, разведение 1:2000). В качестве вторичных антител использовали антитела к антимышиным и антикроличьим иммуноглобулинам, ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательного контроля проводили иммуногистохимическую реакцию без внесения соответствующего антитела. В качестве положительного контроля для проведения реакции с антителами к ALDH1 использовали срезы ткани печени, с антителами к CD133 — образцы ткани почки. Оценку результатов реакций выполняли морфометрически путем подсчета соотношения количества клеток опухоли со специфическим окрашиванием ядра и/или цитоплазмы на 3000 клеток опухоли, выраженного в процентах. Использовали статистический U-критерий Манна—Уитни для оценки различий между малыми выборками.

Результаты

Морфологическая характеристика операционного материала

Макроскопическая характеристика

В подавляющем большинстве случаев изучены периферические АКЛ, которые располагались субплеврально, сопровождаясь втяжением плевры в проекции опухоли; на разрезе имели вид плотноэластичного узла белесовато-сероватого цвета с нечеткими границами (рис.1, а). Размер узлов варьировал от 0,8 до 6 см в наибольшем измерении. В 3 наблюдениях АКЛ представлены сероватыми студенистыми участками без четких границ. Окружающая ткань полнокровная, воздушная, розовато-серого или красноватого цвета, эластичная. Лимфатические узлы серовато-черные, плотноэластичные, размером от 0,5 до 1 см, в отдельных случаях обнаруживался конгломерат белесовато-серых лимфатических узлов с неразличимыми границами.

Рис. 1. Макроскопическое и микроскопическое исследование периферических аденокарцином легкого.

а — атипичная резекция верхней доли правого легкого с опухолью (стрелка); инвазивная немуцинозная аденокарцинома легкого с участками: б — ацинарного и папиллярного строения; в — микропапиллярного строения; г — муцинозная аденокарцинома; окраска гематоксилином и эозином.

Гистологическая характеристика

АКЛ представлены инвазивной аденокарциномой (32 наблюдения). Аденокарциномы преимущественно со стелющимся типом роста диагностированы в 7 случаях, с ацинарным и папиллярным паттернами — в 19 (рис. 1, б). Солидный, микропапиллярный (рис. 1, в) и криброзный варианты строения обнаружены у 5 пациентов. Аденокарциномы микропапиллярного строения характеризовались наличием фокусов инвазии в висцеральную плевру, а также наличием периневральной и лимфоваскулярной инвазии. В 6 наблюдениях имелись опухоли с муцинозной (рис. 1, г) дифференцировкой ацинарного строения и со стелющимся ростом, в 3 из них отмечался мультицентрический характер поражения.

Патологоанатомическая стадия процесса определялась при гистологическом исследовании по критериям Международной классификации стадий злокачественных новообразований TNM [28]. Стадии pT1 соответствовало 14 случаев, все без метастазов в лимфатических узлах (pN0). Стадия pT2 диагностирована в 13 наблюдениях, из них в 3 метастазы в лимфатических узлах не обнаружены (pN0), в 3 установлены метастазы в перибронхиальных лимфатических узлах на стороне поражения (pN1) и в 1 наблюдении найдены метастазы в бифуркационном лимфатическом узле на стороне поражения (pN2). У 3 пациентов определена стадия pT3, у 2 из них с метастазами в регионарных лимфатических узлах (pN1). Со стадией pT4 в исследование включены 2 пациента, у обоих имелись метастазы в бифуркационных лимфатических узлах (pN2). У 1 из этих пациентов через 5 мес после атипичной резекции легкого с опухолью развился рецидив АКЛ и диагностированы отдаленные метастазы. У 5 пациентов отмечались фокусы инвазии в висцеральную плевру, соответствующие стадии PL1 и PL2. На основании категорий T, N, M пациенты в исследовании были распределены согласно стадиям в соответствии с классификацией ВОЗ, 2021 г. [27]: стадия Ⅰ — 23 пациента, стадия II — 4 пациента, стадия III — 5 пациентов (табл. 1).

Таблица 1. Распределение материала по преобладающему паттерну роста (степени злокачественности) и по стадиям согласно критериям Международной классификации стадий злокачественных новообразований TNM (8-е издание, 2017) и классификации ВОЗ, 2021 г.

Иммуногистохимическая характеристика

В аденокарциномах отмечалась экспрессия TTF1, CK7 и маркеров стволовости ALDH1, CD133 и CD34. Пролиферативная активность по Ki-67 на ранних стадиях соответствовала 3—10%, в случае распространенного опухолевого процесса достигала максимально 20%.

РСК с экспрессией ALDH1 были обнаружены во всех АКЛ (рис. 2). Отмечалось диффузное окрашивание цитоплазмы опухолевых клеток различной интенсивности с тенденцией к увеличению количества окрашенных клеток с ростом стадии процесса (p<0,05).

Рис. 2. Экспрессия ALDH1, CD133 и CD34 в аденокарциномах легкого в зависимости от стадии и степени дифференцировки опухоли.

В АКЛ Grade 1 со стелющимся типом роста, АКЛ Grade 2 (ацинарный и папиллярный паттерны) и АКЛ с солидным, криброзным и микропапиллярным характером роста, относящимся к высокой степени злокачественности (рис. 3, а), количество клеток с позитивным окрашиванием цитоплазмы составило в среднем 30% (рис. 3, б).

Рис. 3. Маркеры раковых стволовых клеток в аденокарциноме легкого у пациента со II стадией (pT2 pN1).

а — инвазивная немуцинозная аденокарцинома легкого смешанного строения,; позитивное окрашивание цитоплазмы РСК в реакции с антителами к: б — ALDH1; в — CD34; г — CD133. а — окраска гематоксилином и эозином, б — г — иммунопероксидазная реакция.

Наибольшее количество позитивно окрашенных клеток, достигающее в среднем 80%, обнаруживалось у пациентов с раком III стадии и метастазами в бифуркационных лимфатических узлах pT4 pN2 G3 (p<0,05). Мы отметили, что позитивно окрашенные клетки местами располагались группами из 2—3 клеток, а также преимущественную их локализацию в зонах инвазивного роста опухоли. В части срезов мы выявляли окрашивание клеток опухоли, выстилающих щелевидные пространства, напоминающие сосуды, некоторые из этих пространств содержали эритроциты.

Позитивное окрашивание в реакциях с антителами к CD34 обнаруживалось в цитоплазме клеток аденокарцином и в эндотелии сосудов как в опухоли, так и за ее пределами в окружающей легочной паренхиме. Окрашивание было диффузным цитоплазматическим различной интенсивности. Уровень экспрессии у пациентов в зависимости от степени злокачественности опухоли не отличался: обнаруживались единичные окрашенные клетки опухоли (в среднем 5%). Значительное увеличение количества окрашенных клеток в ткани опухоли было найдено у пациентов с метастазами (p<0,05): оно достигало в среднем 70—80% вне зависимости от размера опухоли, стадии процесса и степени злокачественности (рис. 3, в).

Позитивное окрашивание в реакциях с антителами к CD133 было выявлено в цитоплазме клеток в каждой аденокарциноме (см. рис. 2). Окрашивание клеток было диффузным и апикальным. При этом результаты окрашивания были аналогичны таковым при окрашивании с антителами к ALDH1: у пациентов с опухолями различной степени злокачественности I—III стадии, в том числе с метастазами в лимфатических узлах, количество клеток в первичной АКЛ с позитивным окрашиванием было в среднем 20% (рис. 3, г). Максимальное значение найдено у пациентов с раком III стадии pT4pN2 G3 и достигало в среднем 80% окрашенных клеток опухоли (p<0,05). Отмечалось также окрашивание клеток опухоли, формирующих щелевидные пространства, содержащие эритроциты.

Таким образом, экспрессия маркеров стволовости ALDH1, CD133 и CD34 отмечалась во всех АКЛ. Мы проанализировали количество окрашенных РСК с разными маркерами стволовости в срезах и их локализацию. Во всех случаях АКЛ I—III стадии (pT1-pT3) без поражения лимфатических узлов количество клеток с позитивным окрашиванием в реакциях с антителами к ALDH1 преобладало над таковым с антителами к CD133 и CD34 (см. рис. 2), что дало основание говорить о количественной гетерогенности РСК по содержанию маркеров стволовости у пациентов ранних стадий: наибольшее количество клеток содержали ALDH1 (в среднем до 30%), несколько меньше РСК — CD133 (в среднем до 20% клеток), количество CD34+позитивных РСК было наименьшим у пациентов без признаков метастатического поражения лимфатических узлов (в среднем до 5% клеток) (см. рис. 2). Количественная гетерогенность по содержанию маркеров стволовости не наблюдалась при раке III стадии (pT4 pN2 М0) с поражением лимфатических узлов: число позитивно окрашенных клеток опухоли со всеми факторами в среднем достигало 80% (см. рис. 2). Окрашенные клетки в реакциях с маркером ALDH1 преимущественно обнаруживались в зонах инвазивного роста. При изучении пошаговых срезов одной и той же опухоли клетки с экспрессией ALDH1 и CD133 обнаруживались не только в одном и том же фокусе, но и в разных. Анализ расположения позитивно окрашенных клеток в реакциях с антителами ко всем трем маркерам в пошаговых срезах опухолей у пациентов I—III стадии без поражения лимфатических узлов показал, что в отдельных локусах аденокарцином как в непосредственной близости друг к другу, так и в различных фокусах обнаруживались клетки, экспрессирующие ALDH1, CD133 и CD34. У пациентов с наличием поражения лимфатических узлов существенно преобладали клетки с позитивным окрашиванием в реакциях с CD34. При этом у пациентов с III стадией (pT4pN2М0) и поражением лимфатических узлов экспрессия всех трех указанных маркеров стволовости выявлялась в подавляющем большинстве опухолевых клеток в ткани АКЛ.

Степень злокачественности в АКЛ в соответствии с классификацией ВОЗ определяется по преобладающему гистологическому паттерну роста, мы не выявили достоверной корреляции между степенью злокачественности (преобладающим гистологическим паттерном) и количеством окрашенных клеток опухоли.

Цитологическая характеристика культуры клеток A549

При исследовании культуры клеток АКЛ A549 обнаруживались кластеры опухолевых клеток с признаками железистой дифференцировки, растущие в виде солидных пластов и местами формирующие сфероидные агрегаты, возвышающиеся над пластом опухолевых клеток (рис. 4, а). Фигуры митозов встречались нередко и в среднем составляли 9% опухолевых клеток.

Рис. 4. Раковые стволовые клетки в культуре раковых клеток А549.

а — окраска гематоксилином и эозином; б — экспрессия ALDH1 в цитоплазме раковых стволовых клеток; в — экспрессия CD34 в цитоплазме раковых стволовых клеток; г — экспрессия CD133; б — г — иммунопероксидазная реакция.

Иммуногистохимическое исследование на адгезивных стеклах с культурой клеток АКЛ A549 выявило позитивное окрашивание цитоплазмы части клеток (табл. 2): ALDH1+позитивные РСК составили в среднем 25% от общего количества раковых клеток (рис. 4, б), CD34+позитивные РСК — 31% раковых клеток (рис. 4, в), CD133+позитивные РСК — около 10% раковых клеток (рис.4, г) (p<0,05). Различия в процентном содержании ALDH1+ РСК, CD34+ РСК и CD133+ РСК свидетельствуют об их гетерогенности в культуре A549.

Таблица 2. Маркеры стволовости в РСК в клеточной культуре А549

Обсуждение

В результате проведенного исследования АКЛ различной степени злокачественности и культуры клеток АКЛ A549 мы обнаружили клетки опухоли, экспрессирующие маркеры стволовости ALDH1, CD133 и CD34. При этом в случае метастатического рака III стадии (pT4pN2М0) с поражением лимфатических узлов их количество является максимальным, достигая в среднем 80% (см. рис. 2). Злокачественность опухоли является многофакторным понятием, однако данные литературы [2—5] и полученные нами данные подтверждают, что РСК в АКЛ являются ключевыми клетками, ответственными за реализацию эффектов, характеризующих опухолевую прогрессию: активацию процессов пролиферации и эпителиально-мезенхимальной трансформации (ЭМТ); увеличение их количества в опухолях — признак роста пролиферативного, инвазивного и метастатического потенциала, а значит, и возрастания летальности, что совпадает с данными литературы [5].

Относительное количество CD34+ РСК, ALDH1+ РСК и CD133+ РСК минимальное у пациентов при раке без поражения лимфатических узлов и возрастает при наличии метастазов в лимфатических узлах и распространенном раке в десятки раз. Увеличение количества CD34+РСК с повышением стадии выражено в большей степени, что, по-видимому, определяет особая роль CD34+ РСК в канцерогенезе, причем на это также указывают и ряд авторов [19—21]. Можно предположить, что возрастание инвазивного и метастатического потенциала и, следовательно, агрессивности АКЛ связано с участием CD34+ РСК, а также ALDH1+РСК и CD133+РСК в процессах ангиогенеза, адгезии и ЭМТ.

Была выявлена гетерогенность РСК по изученным маркерам в АКЛ. Мы подтвердили концепцию, что РСК — это гетерогенная совокупность динамичных субпопуляций клеток с признаками стволовости, выполняющих в пределах своей ниши определенные задачи и имеющих биологические свойства, позволяющие им реализовывать эти задачи [5—8]. Количество клеток, проявляющих признаки стволовости, является величиной, подверженной изменениям вследствие пластичности и ЭМТ, и зависит от внешних условий и внутренних стимулов микроокружения. Установлена также количественная гетерогенность РСК по маркерам ALDH1, CD133 и CD34, которая была обнаружена как в операционном материале ткани АКЛ, так и в культуре клеток АКЛ A549. У пациентов без метастазов в лимфатических узлах обнаружено преобладание ALDH1+РСК, что позволяет предполагать приоритетное значение ALDH1+РСК в опухоли для обеспечения резистентности к внешним неблагоприятным воздействиям (терапия) [12—15]; у пациентов с наличием метастазов в лимфатических узлах вне зависимости от размеров опухолевого узла выявлено преобладание) CD34+РСК, что может отражать высокий уровень ЭМТ и ангиогенеза [19—21]. Мы отметили, что маркеры стволовости ALDH1, CD133 и CD34 в случае метастатического рака III стадии определяются на серийных срезах одновременно в подавляющем большинстве клеток, и предположили, что перечисленные маркеры могут обнаруживаться в одной и той же раковой клетке. В то же время у пациентов, имеющих более ранние стадии, маркеры стволовости в серийных срезах обнаруживались в различных сочетаниях и по отдельности в разных участках опухоли. Учитывая, что маркеры являются звеньями сигнальных путей и непосредственными мишенями в сложной цепи молекулярных взаимодействий, результатом которых является реализация определенных пока не до конца установленных эффектов, правомочной становится гипотеза, что в одной клетке могут одновременно коэкспрессироваться как все перечисленные факторы одновременно, так и в различных сочетаниях, в том числе по отдельности, в зависимости от биологической задачи, стоящей перед той или иной субпопуляцией клеток с признаками стволовости. Выдвинутые предположения могут быть исследованы с помощью методов двойных-тройных антител и конфокальной микроскопии. Биологические задачи определяют дифференцировку (созревание) конкретной РСК или группы РСК в опухоли, следствием чего, очевидно, является появление в клетках молекулярных факторов, определяемых иммуногистохимически на различных этапах жизни каждой отдельно взятой РСК и коррелирующих с возрастанием резистентности к терапии, худшим прогнозом, появлением метастазов. Это соотносится с понятием об иерархии и гетерогенности клеток с признаками стволовости.

Заключение

В АКЛ как в операционном материале, так и в культуре A549 обнаружены РСК с экспрессией маркеров стволовости ALDH1, CD133 и CD34.

Увеличение количества РСК с экспрессией маркеров стволовости ALDH1, CD34 и CD133 в ткани опухоли достигает максимальных значений в случаях рака с метастазами в лимфатических узлах.

Значительное количество РСК с экспрессией ALDH1, CD34 и CD133 в АКЛ может свидетельствовать о выраженном инвазивном и метастатическом потенциале АКЛ, интенсивности процессов ЭМТ, а, следовательно, о высокой летальности.

Относительное увеличение CD34+РСК в ткани опухоли у пациентов с наличием метастазов в лимфатических узлах может выступать в роли раннего индикатора возрастания процессов эпителиально-мезенхимальной трансформации, а, следовательно, усиления агрессивности опухоли, склонности к инвазии и метастазированию.

В АКЛ отмечается гетерогенность РСК по изученным маркерам: на ранних стадиях у пациентов без метастазов в ткани опухоли преобладают ALDH1+ РСК, при появлении метастатического поражения лимфатических узлов доминируют популяции CD34+ РСК вне зависимости от размеров узла опухоли. Количественная гетерогенность прослеживается также и в культуре клеток A549: наибольшее количество составили CD34+ РСК, чуть меньшее — ALDH1+РСК и клеток с CD133+РСК было менее всего.

Исследования Е.А. Коган, Г.А. Мееровича, И.В. Решетова выполнены при поддержке гранта РНФ № 24-45-00020 и в рамках билатерального Российско-Китайского проекта.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Коган Е.А., Щелокова Е.Е., Демура Т.А., Решетов И.В.

Сбор и обработка материала — Щелокова Е.Е., Коган Е.А., Жарков Н.В., Ковязина Н.В., Меерович Г.А., Меерович И.Г., Ермакова Е.А., Холщенкова А.Е.

Статистическая обработка данных — Ковязина Н.В., Холщенкова А.Е.

Написание текста — Щелокова Е.Е., Коган Е.А., Ковязина Н.В.

Редактирование — Коган Е.А., Щелокова Е.Е.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.