Плоскоклеточная карцинома вульвы является одной из редких злокачественных опухолей [1, 2]. На сегодняшний день в онкологической практике еще недостаточно сведений, касающихся механизмов и факторов канцерогенеза опухоли данной локализации. Представленная в новой классификации ВОЗ дуалистическая теория развития карцином подразделяет их на ассоциированные с вирусом папилломы человека (ВПЧ) и ВПЧ-независимые [3]. Это разные с точки зрения патогенеза заболевания, различающиеся по молекулярному профилю и предопухолевому состоянию. В настоящее время продолжается поиск причин и механизмов, объясняющих влияние ВПЧ как фактора канцерогенеза на формирование различий в характеристиках опухолей.

Применяемая сегодня тактика лечения больных не зависит от этиологии заболевания, однако появляются данные о различиях в прогнозе в зависимости от механизма опухолевой трансформации [4]. Проведенный метаанализ показал, что ВПЧ-ассоциированный рак вульвы связан с лучшей общей и безрецидивной выживаемостью по сравнению с ВПЧ-независимой карциномой [5, 6], а значит, для установления ВПЧ-статуса опухоли существует необходимость в определении наиболее эффективных методов лечения.

Исследования, изучающие связь между ВПЧ-статусом опухоли вульвы и гистологическим типом, показали различия в морфологическом строении карцином. ВПЧ-положительные опухоли чаще базалоидного или бородавчатого типа, тогда как ВПЧ-независимые, как правило, ороговевающие [7—9]. Однако только лишь гистологический тип опухоли не в полной мере отражает способность клеток опухоли к созреванию, а также различия клеток в размерах для понимания механизмов канцерогенеза. При этом остается неясным роль ВПЧ в формировании отличий. В литературе отсутствуют данные о морфометрических показателях клеток опухоли ВПЧ-ассоциированной и ВПЧ-независимой карциномы и результаты сравнения их с показателями нормальных клеток.

Цель исследования — сравнить морфометрические и гистологические характеристики плоскоклеточных ВПЧ-ассоциированных и ВПЧ-независимых карцином вульвы, а также рассчитать показатели специфичности гистологического, иммуногистохимического методов, а также полимеразно-цепной реакции (ПЦР) в установлении ВПЧ-статуса опухоли.

Материал и методы

В исследование ретроспективно были включены 74 пациентки с впервые выявленной плоскоклеточной карциномой вульвы, обследованных в ГАУЗ СО СООД в период с 2016 по 2021 г. Критерии включения: впервые выявленное заболевание, наличие гистологических блоков с биопсийным или операционным материалом, достаточное количество срезов для анализа. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ УГМУ, протокол №4 от 26.05.23. Гистологическое заключение сформулировано согласно Классификации опухолей женских репродуктивных органов, ВОЗ 2014 г. Проводилось иммуногистохимическое исследование, а также качественное определение антигена p16INK4a (набор реагентов CINtec Histology). Окрашивание оценивалось положительно только в случаях с сильной диффузной и постоянной ядерной или цитоплазматической экспрессией (блочное окрашивание, p16+); очаговая и слабая диффузная экспрессия оценивалась как отрицательная (гетерогенное окрашивание, р16-). Выполнялось качественное определение антигена p53 (набор реагентов Cell Marque). Экспрессия p53 оценивалась как «дикий» тип (p53wt) при разбросанном или среднеэпителиальном паттерне. При базальном, базально-парабазальном, нулевом или цитоплазматическом паттернах экспрессия p53 определялась как «мутантный» тип (p53mut). Типирование ВПЧ проводили методом ПЦР-realtime с использованием наборов реагентов «АмплиСенсÒ ВПЧ ВКР генотип-FL» и «АмплиСенс ВПЧ 6/11-FL».

Визуализацию осуществляли с помощью оптического микроскопа Leica DM2500 и подключенной к ней камеры Leica DFC420. Для обработки изображений использовали программу LAS Core V4.9. Сканирование препаратов проводили при увеличении 200. Оценку морфометрических показателей не менее 100 клеток выполняли в каждом образце. В качестве морфометрических показателей определяли общую площадь клетки, цитоплазмы и ядра (в мкм²), а также ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) согласно формуле:

.

При наличии в клетках опухолевого эпителия двух или более ядер оценивалась совокупная площадь ядер. Оценивали показатели опухолевых клеток, а также многослойного плоского эпителия вульвы вне опухоли (n=18) для разных слоев (клетки базального/парабазального, промежуточного и поверхностного слоев).

Статистический анализ осуществляли с использованием программы StatTech v. 3.1.10 (разработчик ООО «Статтех», Россия). Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка или Колмогорова–Смирнова. Сравнение двух групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение, выполняли с помощью t-критерия Стьюдента. Сравнение трех групп и более по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполняли с помощью критерия Краскела–Уоллиса, апостериорные сравнения — критерия Данна с поправкой Холма. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Расчет показателей эффективности методов произведен с помощью MedCalc Software Ltd. Diagnostic test evaluation calculator.

Результаты

Согласно проведенному исследованию, частота ВПЧ-ассоциированной карциномы (молекулярный подтип р16+р53wt) составила 28,4 % (n=21). ВПЧ-независимая карцинома (молекулярные подтипы p16-p53mut, p16-p53wt, р16+p53mut) выявлена в 53 (71,6%) случаях. ВПЧ-независимые карциномы ороговевающие диагностированы в 94,3% (n=50) и неороговевающие — в 5,7% (n=3) (рис. 1). ВПЧ-ассоциированные карциномы в 57,1% (n=12) представлены базалоидным гистотипом, а в 42,9% (n=9) — ороговевающим (рис. 2, 3). Выявленные различия статистически значимы (p<0,001).

Рис. 1. ВПЧ-независимая карцинома вульвы.

а, б — ороговевающий гистотип; в — гетерогенная экспрессия p16; г — базально-парабазальный паттерн экспрессии p53. а, б — окраска гематоксилином и эозином, в, г — иммуногистохимическая реакция; а — ×100, б–г — × 200.

Рис. 2. ВПЧ-ассоциированная карцинома вульвы.

а, б — базалоидный гистотип; в — блочная экспрессия p16; г — разбросанный паттерн экспрессии p53. а, б — окраска гематоксилином и эозином; в, г — иммуногистохимическая реакция. а — ×100, б–г — ×200.

Рис. 3. ВПЧ-ассоциированная карцинома вульвы.

а, б — ороговевающий гистотип; в –блочная экспрессия p16; г — среднеэпителиальный паттерн экспрессии p53. а, б — окраска гематоксилином и эозином; в, г — иммуногистохимическая реакция. а — ×100, б–г — ×200.

Распространенность ДНК ВПЧ среди всех обследованных пациенток составила 45,9% (n=34). В 24,5% (n=13) ВПЧ-независимых карцином было обнаружено присутствие ДНК ВПЧ без блочной экспрессии p16. Специфичность определения ВПЧ-статуса с использованием только гистологических характеристик опухоли составила 80,65% (95 ДИ 68,63—89,58), что ниже по сравнению с иммуногистохимической оценкой экспрессии p16 и p53 — 96,36% (95 ДИ 87,47—99,56), но выше по сравнению с наличием ДНК ВПЧ в материале опухоли — 75,47% (95 ДИ 61,72—86,24).

Согласно морфометрическим показателям, при созревании нормальных клеток многослойного плоского эпителия площадь цитоплазмы увеличивалась, а площадь ядра уменьшалась. Выявленные различия статистически значимы (p<0,001). При анализе морфометрических показателей опухолевых клеток в зависимости от ВПЧ-статуса опухоли получены статистически значимые различия площади эпителиальных клеток, ядер и ядерно-цитоплазматического соотношения. Клетки ВПЧ-ассоциированной опухоли были меньше по сравнению с клетками ВПЧ-независимой карциномы, в то время как ядерно-цитоплазматическое соотношение было выше (см. таблицу).

Морфометрические показатели нормальных клеток и клеток плоскоклеточной карциномы вульвы в зависимости от ВПЧ-статуса

При оценке морфометрических показателей клеток ороговевающей ВПЧ-ассоциированной и ороговевающей ВПЧ-независимой карциномы были получены статистически значимые различия показателей площади клеток опухоли и ядерно-цитоплазматического соотношения (p<0,001 и p=0,006 соответственно). Площадь клеток ВПЧ-независимой карциномы вульвы больше (732,20±388,73 мкм²) по сравнению с ВПЧ-ассоциированной карциномой (304,52±144,50 мкм²), в то время как ядерно-цитоплазматическое соотношение ниже (0,18 Q₁ — Q₃ 0,12—0,21 для ВПЧ-независимой и 0,46 Q₁ — Q₃ 0,27—0,65 для ВПЧ-ассоциированной). Площадь ядра/ядер клеток карцином составила 99,31±74,11 и 107,63±57,90 для ВПЧ-ассоциированной и ВПЧ-независимой ороговевающей карциномы соответственно и статистически значимо не различалась (p=0,774).

Обсуждение

Установление ВПЧ-статуса при раке вульвы может быть дополнительным фактором при планировании лечения и стратегии наблюдения после него. У молодых женщин чаще развивается ВПЧ-положительный рак вульвы, который, по-видимому, имеет менее агрессивный характер и благоприятный прогноз. Это может означать, что ВПЧ-положительный рак вульвы, вероятно, можно лечить более консервативно, принимая во внимание потенциально более высокую чувствительность к лучевой терапии. Более того, высокая скорость прогрессирования ВПЧ-отрицательных опухолей указывает, что этим женщинам будет полезна стратегия интенсивного наблюдения для выявления рецидива рака [5, 6]. Несмотря на высокую корреляцию между гистологическим типом и ВПЧ-статусом карциномы, этого недостаточно для установления окончательного типа опухоли. Иммуногистохимическое определение экспрессии p16 и p53 — более точный метод для окончательного определения ВПЧ-статуса карциномы (специфичность 96,36% (95 ДИ 87,47—99,56).

Результаты исследования показывают различия в гистологических характеристиках ВПЧ-ассоциированных и ВПЧ-независимых опухолей, что согласовывается с данными предыдущих работ [9, 10]. Карциномы, связанные с ВПЧ, как правило, имеют базалоидную или неороговевающую морфологию, представленную относительно мелкими незрелыми клетками многослойного плоского эпителия со скудной цитоплазмой и крупными ядрами. Площадь размера клеток сопоставима с таковой нормальных клеток базально-парабазального слоя эпителия. Размеры ядра статистически значимо больше, что приводит к смещению ядерно-цитоплазматического соотношения в сторону ядра, в то время как ВПЧ-независимые опухоли преимущественно ороговевающие, состоящие из зрелых дифференцированных клеток многослойного плоского эпителия с обильной цитоплазмой и признаками ороговения. Площадь опухолевых клеток больше по сравнению с нормальными клетками промежуточного слоя многослойного плоского эпителия, но меньше по сравнению с поверхностным эпителием.

Различия в характеристиках опухоли, вероятно, возникают вследствие воздействия вирусных онкопротеинов. Согласно данным литературы, ВПЧ использует продукты генов инфицированных базальных клеток на протяжении всего цикла их развития. Это позволяет в S-фазе одновременно с репликацией клеточной ДНК осуществить репликацию вирусной ДНК, в профазе начать процесс транскрипции генов капсидных белков, в метафазе передать эписомную вирусную ДНК дочерним клеткам. Максимальную продукцию реплицированных копий ДНК ВПЧ определяет экспрессия вирусных белков E6 и E7, воздействие которых на семейства клеточных белков p53, pRb, p16 и p21 исключает возможность остановки цикла клетки для репарации ее ДНК или запуска апоптоза при возникающих при репликации ДНК мутаций ее генов [12—14].

Нарушение механизмов созревания инфицированных клеток приводит к изменению морфологии опухолевого эпителия, что подтверждают данные нашего исследование. По сравнению с ВПЧ-ассоциированным раком в ВПЧ-независимых карциномах клетки опухоли еще сохраняют способность к дифференцированию и созреванию эпителия, что характеризуется большей площадью эпителия и смещением ядерно-цитоплазматического соотношения в сторону цитоплазмы. Согласно исследованию J. Hatterschide и соавт. [15], показана способность вирусного онкопротеина E7 приводить к деградации клеточного белка PTPN14, который является предполагаемым онкосупрессором, что приводит к ингибированию дифференцировки эпителия. Молекулярные механизмы канцерогенеза, не связанного с вирусом, на данный момент остаются малоизученными [16—18]. Открытым остается вопрос причинно-следственной связи между ВПЧ-независимым канцерогенезом и высокодифференцированным ороговевающим типом опухоли. Существуют предположения, согласно которым потеря функции белка p53 в результате мутации TP53 позволяет эпителию дифференцироваться, при этом апоптоз поврежденных клеток не индуцируется [11—19].

Однако результаты и нашего исследования, и данные ранее проведенных работ свидетельствуют, что ВПЧ-ассоциированные карциномы могут быть также высокодифференцированными ороговевающими [9, 10]. При сравнении морфометрических показателей опухолевых клеток при одинаковом ороговевающем гистотипе мы обнаружили, что при ВПЧ-зависимом процессе клетки остаются меньше по размеру, а ядерно-цитоплазматическое соотношение выше по сравнению с ВПЧ-независимыми карциномами. Вероятно, даже при сохранении созревания эпителиального пласта при вирусассоциированном канцерогенезе морфология клеток претерпевает изменения. Результаты микрочипового анализа показали, что онкогены E6 и/или E7 ВПЧ 16-го генотипа способны подавлять экспрессию нескольких генов, участвующих в дифференцировке кератиноцитов (таких как десмоколлин-1, кератин 4, S100 кальцийсвязывающий белок A8) по крайней мере частично, путем подавления их промоторной активности [20].

Ограничениями нашего исследования являются его ретроспективный характер и небольшое количество пациентов. Однако размер выборки был аналогичен используемому в части других опубликованных исследований и отражал относительно низкую заболеваемость данным типом карцином.

Заключение

Иммуногистохимическое определение экспрессии p16 и p53 является доступным и наиболее эффективным методом диагностики ВПЧ-статуса плоскоклеточного рака вульвы. Точность определения ВПЧ-статуса с использованием только гистологических характеристик опухоли значительно ниже по сравнению с результатами иммуногистохимического метода. Мы впервые получили данные о морфометрических показателях опухолевых клеток ВПЧ-ассоциированной и ВПЧ-независимой карциномы вульвы. Различия, вероятно, обусловлены механизмами и факторами злокачественной трансформации эпителия, связанными с воздействием вируса папилломы человека. Данные могут внести вклад в изучение влияния ВПЧ-инфекции на механизмы канцерогенеза данной локализации.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования —Пахарукова М.И., Юшков Б.Г.

Сбор и обработка материала — Пахарукова М.И.

Статистическая обработка — Пахарукова М.И.

Написание текста — Пахарукова М.И.

Редактирование — Юшков Б.Г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.