Коробко Д.С.

Областной центр рассеянного склероза, Государственная новосибирская областная клиническая больница

Малкова Н.А.

Новосибирский окружной центр рассеянного склероза

Булатова Е.В.

Областной центр рассеянного склероза и других аутоиммунных заболеваний нервной системы, Государственная новосибирская областная клиническая больница

Бабенко Л.А.

Областной центр рассеянного склероза и других аутоиммунных заболеваний нервной системы, Государственная новосибирская областная клиническая больница; Кабинет клинических исследований рассеянного склероза, Сибирский окружной медицинский центр ФМБА России

Сазонов Д.В.

ФГБУ "Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России", Москва

Соколова Е.А.

ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН, Новосибирск, Россия; ФГБОУ ВО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия

Филипенко М.Л.

ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН, Новосибирск, Россия; ФГБОУ ВО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия

Влияние генетических факторов на фенотипическую экспрессию рассеянного склероза

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Спецвыпуски. 2013;113(2-2): 10-16

Просмотров : 169

Загрузок :

Как цитировать

Коробко Д. С., Малкова Н. А., Булатова Е. В., Бабенко Л. А., Сазонов Д. В., Соколова Е. А., Филипенко М. Л. Влияние генетических факторов на фенотипическую экспрессию рассеянного склероза. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Спецвыпуски. 2013;113(2-2):10-16.

Авторы:

Коробко Д.С.

Областной центр рассеянного склероза, Государственная новосибирская областная клиническая больница

Все авторы (7)

Существующие на сегодняшний день данные позволяют определить рассеянный склероз (РС) как полигенное мультифакториальное заболевание, подверженность к которому определяется сочетанием вариантов генов, взаимодействующих с различными факторами окружающей среды [1, 2, 14]. При этом генетические факторы могут влиять на фенотипическую экспрессию РС. В семьях больных женщины болеют в 5-6 раз чаще мужчин [1]. В парах сиблингов больных РС прослеживается умеренная, но значимая конкордантность по клиническому течению заболевания [20, 39, 40, 44].

Использование подхода «ген-кандидат» позволяет выявить ассоциации генов не только с заболеванием в целом [15], но и с различными его характеристиками. Обсуждается роль полиморфизмов генов в развитии различных типов течения РС, скорости прогрессирования, интенсивности воспалительной реакции и других важных клинико-патогенетических особенностей РС [2, 5, 7, 8, 15].

Наиболее активно изучалась ассоциация между клиническим течением РС и полиморфизмом генов системы HLA [41]. Однако в этой области были получены противоречивые результаты. Первоначально L. Barcellos и соавт. [10] не было найдено никакого влияния гаплотипа DR2 на течение заболевания, затем ими [11] было отмечено, что носительство DR2 ассоциируется с более тяжелым течением РС. Но позднее на большой американо-европейской когорте больных они [12] не смогли эти данные подтвердить. Другая группа авторов [31] с учетом данных МР-спектроскопии и МРТ показала, что аллель HLA-DRB1*15 влияет на тяжесть заболевания. Было также установлено [13], что носительство аллеля HLA-DRB1*01 отмечается реже при злокачественных формах РС по сравнению с его мягкими вариантами. Большой интерес представляют данные о том, что протективный эффект HLA-DRB1*01 проявляется на значимом уровне только тогда, когда другая хромосома несет аллель HLA-DRB1*15 [35].

В отличие от ситуации с генами системы HLA исследования ассоциаций других генов-кандидатов с клиническим течением РС немногочисленны. Есть отдельные работы [3, 6-8, 18], в которых были выявлены значимые ассоциации с фенотипическими проявлениям, прежде всего, по генам, продукты которых участвуют в развитии иммунного ответа - гены цитокинов, ко-стимулирующих молекул, хемокинов [5] и их рецепторов. Однако и здесь были получены противоречивые результаты и сделаны неоднозначные заключения [9, 23, 34, 36, 42].

Цель настоящего исследования - изучение роли полиморфизмов системы генов цитокинов в патогенезе РС. В задачи исследования входило: изучить полиморфизмы rs6074022, rs1883832, rs1535045 и rs11086998 гена CD40, а также двух полиморфизмов, не относящихся к генам цитокинов rs10492972 (KIF1B) и rs3135388; уточнить предварительные данные по ассоциациям отдельных генотипов со скоростью прогрессирования, характером течения РС и клиническими характеристиками заболевания; оценить вклад генетических факторов в формирование своеобразной клинической картины РС на примере семейных случаев; оценить прогностическое значение выявленных ассоциаций для больных РС.

Материал и методы

В исследование были включены 326 больных РС. Диагноз во всех случаях ставился в соответствии с критериями McDonald (2005) [33]. Обследованные были русскими по национальности и проживали в Новосибирске и Новосибирской области. Исследование было одобрено этическими комитетами Государственной новосибирской областной клинической больницы и Новосибирского государственного медицинского университета. Для участия в исследовании у всех пациентов было получено письменное информированное согласие.

В контрольную группу вошли 575 проживающих в Новосибирске человек, 203 мужчины и 372 женщины (средний возраст - 33,6±10,9 года), без воспалительных заболеваний центральной нервной системы. Группа контроля соответствовала по половому и национальному составу группе больных РС.

Все пациенты прошли стандартное клиническое обследование (тщательный сбор анамнеза, включая семейный, физикальный и неврологический осмотр), МРТ на высокопольном томографе, молекулярно-генетическое исследование. На каждого участника заполнялась специально разработанная анкета, включающая демографические данные (возраст, пол, национальность), медицинскую информацию (возраст дебюта, длительность заболевания, скорость прогрессирования, тип течения, сопутствующие аутоиммунные заболевания) и генетический статус (наличие родственников с РС или другими аутоиммунными заболеваниями).

В группе больных отмечалось преобладание женщин в соотношении 1:1,9 (112 мужчин и 214 женщин). Медиана возраста составила 35 лет. Начало заболевания определялось по времени появления первых симптомов. Средняя длительность заболевания составила 8,98±8,70 года.

Медиана возраста дебюта РС составила 26 лет (min - 9, max - 51). Длительность первой ремиссии в среднем - 16 мес (min - 1, max - 300). За последний год до включения в программу наблюдения каждый больной перенес в среднем одно обострение (среднее значение 1,01±0,73). Среднегодовое количество обострений было рассчитано ретроспективно на основании медицинских документов и со слов пациента в подгруппе с ремиттирующим течением РС. За временной интервал для анализа выбраны первые 10 лет заболевания. Среднегодовая частота обострений в указанной подгруппе составила 0,82±0,62.

Тип течения РС определялся в соответствии с международной классификацией, предложенной F. Lub­­lin и S. Reingold [28]. У большинства (69%) больных этой группы был диагностирован ремиттирующий характер течения РС (РРС). Вторично-прогрессирующее течение (ВПРС) наблюдалось у 22% пациентов, ремиттирующе-прогредиентное (РПРС) и первично-прогредиентное (ППРС) - по 3%. У 3% пациентов, включенных в исследуемую группу, заболевание находилось на стадии клинически изолированного синдрома (КИС) с высоким риском развития РС.

Для объективизации клинической картины заболевания использовалась оценка функциональных систем (FS) по Куртцке и расширенная шкала инвалидизации по Куртцке - EDSS (Expanded Disability Status Scale) [27].

Для оценки быстроты нарастания неврологического дефицита (т.е. прогрессирования РС) использовались 2 параметра: балл по шкале тяжести РС (MSSS, Multiple Sclerosis Severity Score) [38] и скорость прогрессирования, определяемая путем соотношения степени тяжести в баллах шкалы EDSS к длительности заболевания в годах [4, 43]. Ключевой принцип MSSS - корректировка единичного балла по шкале инвалидизации отдельного пациента путем сравнения с распределением значений баллов EDSS у пациентов с аналогичной продолжительностью болезни. В рамках сотрудничества 16 различных исследовательских групп на основе обследования 9892 пациентов была создана база данных (таб­лица Global MSSS) и разработан простой частотно-ранговый алгоритм для получения балла MSSS. Все пациенты со средним уровнем инвалидизации для своей продолжительности болезни будут иметь балл MSSS около 5. Соответственно больные с ускоренными темпами прогрессирования получат более высокие значения этого индекса. Для расчета баллов MSSS нами использовалась специально разработанная программа MSSStest (версия 3.0, 2007), реализующая основные принципы метода, описанного R. Roxburgh и соавт. [38].

В табл. 1 приведена обобщенная характеристика больных РС и группы контроля.

Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН. Были исследованы 6 полиморфизмов: CD40 (rs6074022, rs1883832, rs1535045 и rs11086998), rs10492972 (KIF1B), rs3135388 (генетический маркер носительства аллеля HLA-DRB1*15). Все изученные варианты являются однонуклеотидными заменами (SNP, от англ. Single nucleotide polymorphism). Интерес именно к этим генам не случаен, поскольку во многих исследованиях показана роль кодируемых ими белков в патогенезе РС.

ДНК выделяли из 3-5 мл венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК от примесей путем экстракции смесью фенола с хлороформом и осаждение ДНК этанолом [24]. Генотипирование проводилось с использованием технологии TaqMan. Амплификация проводилась с помощью амплификатора iCycler iQ5 («Bio-Rad», США).

Статистический анализ полученных результатов осуществлялся на Intel-совместимом персональном компьютере с использованием статистических программ Statistica for Windows 8.0 («StatSoft, Inc».) и языка программирования R (version 2.11.0, www.r-project.org). Различия в возрасте пациентов анализировали с помощью U-критерия Манна-Уитни. В качестве нулевой гипотезы принималась гипотеза об отсутствии различий в группах. Корреляционный анализ данных проведен с помощью определения коэффициента корреляции Пирсона.

Для выявления ассоциации возраста начала, длительности заболевания, EDSS и средней скорости прогрессирования с генотипом использовали линейный регрессионный анализ (функция «glm» языка программирования R). Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга и выявление ассоциаций генотипа с развитием заболевания проводили методом &khgr;2 с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия) [21]. Рассчитывались отношения шансов (OR, odds ratio) с указанием 95% доверительного интервала (95% ДИ). Нулевыми гипотезами являлись соответствие распределению Харди-Вайнберга и отсутствие ассоциаций (OR=1).

Для выявления ассоциаций темпов прогрессирования по баллу MSSS с генотипом и определения достоверности различий медиан нескольких подгрупп рассчитывался H-критерий Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis test) с помощью программы MSSStest. Для сравнений двух групп генотипов применялся идентичный тесту Краскела-Уоллиса U-критерий Манна-Уитни. Пациенты с длительностью заболевания менее 1 года были исключены из данного анализа, так как на основании EDSS оценки в 1-й год болезни нельзя адекватно спрогнозировать дальнейшую скорость прогрессирования заболевания.

Для всех видов статистического анализа различия считались статистически достоверными при достигнутом уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

В группе больных РС преобладали пациенты с легкой и умеренной степенью инвалидизации, на что указывает средний показатель EDSS 3,01±1,76 балла (min 1, max 8,5). Показатели темпов нарастания инвалидизации также указывают на среднюю скорость прогрессирования РС у большинства больных. Медиана балла MSSS составила 3,90 [2,1; 6,1], скорости прогрессирования - 0,55 балла в год [0,2; 0,6], при этом у 30% пациентов скорость прогрессирования составила менее 0,25 балла в год, у 46% больных - от 0,25 до 0,75 балла и у 24% - была выше 0,75 балла в год.

На основании данных литературы для исследования были выбраны 4 полиморфизма гена CD40: rs6074022 T->C; rs1883832 C->T; rs1535045 C->T; rs11086996 C->G. Частоты аллелей всех четырех полиморфных локусов приведены в табл. 2.

Были изучены также еще 2 полиморфизма - rs10492972 (ген KIF1B) и rs3135388. Распределение генотипов всех изученных полиморфизмов соответствовало закону Харди-Вайнберга в группе больных РС и группе контроля (HWE p>0,05).

В табл. 3 представлено распределение пациентов с РС и лиц из контрольной группы по генотипам всех исследованных полиморфизмов.

Выявлены статистически значимые ассоциации двух полиморфных локусов с развитием РС: rs3135388 (риск-аллель T, OR=3,23, 95%ДИ 2,43-4,29, p=3,8·10–17) и rs1883832 (ген CD40, для аллели T OR=1,74, 95%ДИ 1,34-2,32, p=2,96·10–7). Т.е. гомозиготы, имеющие генотип TT по полиморфизмам rs3135388 и rs1883832, имеют наиболее высокие риски развития РС в представленной когорте (OR=7,84, 95%ДИ 3,19-19,27, p=1,9·10–7 и OR=3,31, 95%ДИ 2,012-5,452, p=1,02·10–6 соответственно). Эти варианты генов можно считать генетическими риск-факторами РС в новосибирской популяции. Для других трех полиморфных локусов статистически значимых различий частоты встречаемости генотипов между группой больных РС и контрольной не выявлено (см. табл. 3).

В исследованной когорте больных не отмечается достоверной ассоциации полиморфного локуса rs6074022 гена CD40 с развитием РС, что согласуется с данными, полученными на популяции Алтайского края. Такое противоречие с результатами некоторых исследований [7, 16] может объясняться как генетической гетерогенностью набранных пациентов и недостаточно высоким для такого рода исследований числом больных, чтобы преодолеть эту гетерогенность, так и региональными особенностями РС.

Согласно результатам полногеномного исследования, полиморфный локус rs3135388 находится в сильном неравновесии по сцеплению с HLA-DRB1*15 [19]. Полученные нами результаты подтверждают, что HLA-DRB1*15 является значимым фактором риска развития РС у жителей Новосибирской области.

Изучение влияния генотипа на такие характеристики течения заболевания, как возраст дебюта, длительность первой ремиссии, частота обострений, балл по EDSS и средняя скорость прогрессирования РС, проводили с помощью линейного регрессионного анализа.

Было выявлено влияние генетических факторов на проявления РС, начиная с дебюта заболевания. Возраст манифестации РС оказался статистически значимо ниже на 1,9±0,9 года у носителей редкого аллеля С полиморфизма rs10492972 гена KIF1B (p=0,04). Этот ген расположен на коротком плече первой хромосомы в районе, где наблюдаются делеции при большинстве нейрогенных опухолей. Кодируемый геном KIF1B белок кинезин участвует в аксональном транспорте митохондрий и синаптических везикул и, как предполагается, исходя из данных исследований на животных, может воздействовать на процесс демиелинизации/ремиелинизации [29].

В проведенной работе не выявлено ассоциации полиморфного локуса rs10492972 гена KIF1B с риском РС и показателями прогрессирования, и вообще вопрос о наличии такой ассоциации является очень дискутабельным [17]. В исследованиях на итальянской и греческой популяции также не выявлено влияния этого полиморфизма на риск РС и его прогрессирование [25, 30]. В метаанализе, проведенном Е.А. Кудрявцевой и соавт. [26], был показан статистически значимый (р=0,02) протективный эффект аллеля С полиморфизма rs10492972 в отношении риска РС. Международный консорциум по генетике РС в 2011 г. исключил данный полиморфизм из списка больших риск-факторов РС [22]. Это подчеркивает необходимость очень крупных размеров выборки, чтобы исключить ложноположительные результаты и применить соответствующие статистические методы.

Более ранний дебют (на 1,5±0,8 года) отмечается и у носителей редкого аллеля Т полиморфизма rs1535045 гена CD40 (p=0,04). Причем это согласуется с другой ассоциацией, полученной по данному полиморфизму. У гомозигот по редкому аллелю Т, т.е. у пациентов с генотипом TT полиморфизма rs1535045 гена CD40, достоверно более низкий балл MSSS - 3,32 (против 4,16 у гетерозигот и 4,41 у носителей CC), т.е. наблюдается более медленное прогрессирование РС (p=0,04).

Возраст больных к периоду дебюта заболевания оказался статистически значимо выше на 7,2±3,3 года у носителей редкого аллеля G rs11086998. Возможно, этот аллель мог бы быть использован в качестве предиктора более позднего начала заболевания, а значит, более тяжелого течения. Однако это предположение требует дальнейшего изучения и уточнения. По другим клиническим параметрам статистически значимых различий не выявлено. В некоторых исследованиях также не было установлено связей полиморфизмов в гене CD40 с показателями тяжести РС [36].

По другому полиморфизму гена CD40 rs6074022 при анализе его связи со скоростью прогрессирования РС c помощью линейного регрессионного анализа выявлена значимая ассоциация. У носителей редкого аллеля С этого полиморфного локуса скорость прогрессирования статистически значимо выше на 0,14±0,06 балла в год (p=0,01). Балл по шкале MSSS также выше у носителей генотипа CC (5,45 против 4,20 и 4,24), однако различие не достигло статистически значимого уровня (p=0,26). Наши результаты согласуются с данными C. Jensen и соавт. [23], которые в своей работе приводят доказательства влияния полиморфного локуса rs6074022 на показатели тяжести РС у мужчин, и российских исследований [7, 8].

На следующем этапе работы мы проанализировали подгруппу семейных случаев РС. Родственники пациентов с РС имеют в 15-50 раз более высокий риск развития РС, чем популяция в целом. Величина этого риска коррелирует со степенью родства [37].

В некоторых работах подчеркивается отличие семейных случаев РС от спорадических, что также может быть связано с наследственными факторами [1]. Другие исследователи [32] не находят отличительных черт и указывают на гетерогенность семейного РС.

Случай РС определялся как семейный при наличии у пациента как минимум одного родственника (любой степени родства) с данным заболеванием. В исследованной группе выявлены 25 больных, имеющих родственников с РС, в 23 семьях (в 68% случаев - родственники первой линии родства: мать - дочь/сын; отец - дочь/сын; сестра-брат). Семейный риск повторяемости составил 7,0% у родственников первой, второй или третьей степени родства, общий риск повторяемости - 7,6%.

После проведенного анализа выявлено, что группа больных с семейными случаями РС статистически значимо не отличалась от остальных включенных в исследование больных РС по возрасту, длительности заболевания и уровню инвалидизации (EDSS). Однако при этом выявлены клинические особенности по другим параметрам, в том числе относящимся традиционно к прогностическим.

Возраст больных к периоду дебюта РС в группе семейных случаев оказался немного ниже по сравнению со спорадическими, однако статистически не достоверно (23,6±9,22 против 27,5±8,61 года, р=0,09). Симптомы дебюта были различными, но при семейном РС преобладали зрительные, глазо­двигательные и чувствительные нарушения (60%) и не встречались прогностически неблагоприятные тазовые расстройства, только в 1 (4%) случае первыми симптомами были мозжечковые нарушения. Достоверных различий в длительности первой ремиссии РС не выявлено (р>0,05).

Показатель прогрессирования заболевания, оцененный по шкале MSSS, в подгруппе семейного РС был достоверно ниже по сравнению со спорадическими случаями (3,27 против 4,38, р=0,03). Причем балл MSSS коррелировал с возрастом дебюта (r=0,49, p<0,05) и длительностью первой ремиссии (r= –0,35, p<0,05).

У больных, имеющих родственников с РС, отмечена бо`льшая частота аллеля Т полиморфизма rs3135388 (44% против 33%, р=0,003). Поскольку данный полиморфный локус является генетическим маркером носительства аллеля HLA-DRB1*15 и увеличивает риск РС более чем в 3 раза, по данным нашего исследования, можно предполагать, что гаплотип HLA в определенной мере вносит вклад и в формирование своеобразного течения семейных форм заболевания. Также, возможно, аллель HLA-DRB1*15 определяет бо'льшую вероятность передачи РС последующим поколениям, т.е. появления новых семейных случаев.

На уровне тенденции отмечена немного более высокая частота аллеля T полиморфного варианта rs1883832 гена CD40, однако не достигшая уровня статистической значимости.

В ходе исследования подробно изучены полиморфизмы генов нескольких групп: цитокинов (на примере гена CD40), не относящихся к процессам иммунного воспаления (KIF1B), и маркера носительства аллеля системы HLA. Выявлено влияние генотипов rs1883832 гена CD40 (риск-аллель T) и rs3135388 (риск-аллель T).

Уточнены некоторые предварительные данные по ассоциациям отдельных генотипов со скоростью прогрессирования и клиническими характеристиками заболевания, в частности с возрастом дебюта. С помощью линейного регрессионного анализа выявлена ассоциация редкого аллеля С полиморфизма rs6074022 (CD40) с более высокой скоростью прогрессирования. А генотип TT полиморфизма rs1535045 гена CD40 сопряжен с более медленным прогрессированием РС и ранней манифестацией заболевания, что может с определенной долей вероятности говорить о протективной роль аллеля Т.

Таким образом, в данной работе на репрезентативном клиническом материале (сибирская когорта) было подтверждено, что семейные случаи PC отличаются от спорадических более мягким, доброкачественным течением. Выявлены некоторые молекулярно-генетические и клинические особенности дебюта семейного РС.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что имеется достоверное влияние генетических факторов на фенотипическую экспрессию РС. Продемонстрирован вклад всех изученных полиморфизмов в развитие своеобразной клинической картины.

Данное исследование является пилотным и содержит много теоретических предположений, в связи с чем необходимы дальнейшие специальные исследования, в том числе семейных случаев. Изучение генетики семейных форм, возможно, станет еще одним шагом к пониманию патогенеза РС.

В заключение необходимо отметить, что име­ющиеся в литературе противоречивые данные об ассоциации различных полиморфных локусов и клинических проявлений заболевания могут быть связаны как с небольшим числом обследованных пациентов, малой продолжительностью наблюдения и разными критериями включения пациентов в исследование, так и с региональными особенностями мест проживания пациентов. Все это делает актуальным проведение дальнейших исследований в генетически разнородных популяциях для выявления новых связанных с РС биомаркеров, которые могут быть использованы как прогностические факторы или терапевтические мишени для модуляции аутоиммунного ответа у пациентов с РС. Изучение регио­нальных особенностей генетических факторов РС внесет свой вклад в понимание патогенеза этого комплексного и гетерогенного заболевания, будет способствовать улучшению оказания помощи больным, страдающим РС, и приближению к эре персонифицированной медицины.

Работа поддержана Российской федеральной программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2012-1.5-12-000-1002). Государственный контракт №8490.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail