Существующие на сегодняшний день данные позволяют определить рассеянный склероз (РС) как полигенное мультифакториальное заболевание, подверженность к которому определяется сочетанием вариантов генов, взаимодействующих с различными факторами окружающей среды [1, 2, 14]. При этом генетические факторы могут влиять на фенотипическую экспрессию РС. В семьях больных женщины болеют в 5-6 раз чаще мужчин [1]. В парах сиблингов больных РС прослеживается умеренная, но значимая конкордантность по клиническому течению заболевания [20, 39, 40, 44].

Использование подхода «ген-кандидат» позволяет выявить ассоциации генов не только с заболеванием в целом [15], но и с различными его характеристиками. Обсуждается роль полиморфизмов генов в развитии различных типов течения РС, скорости прогрессирования, интенсивности воспалительной реакции и других важных клинико-патогенетических особенностей РС [2, 5, 7, 8, 15].

Наиболее активно изучалась ассоциация между клиническим течением РС и полиморфизмом генов системы HLA [41]. Однако в этой области были получены противоречивые результаты. Первоначально L. Barcellos и соавт. [10] не было найдено никакого влияния гаплотипа DR2 на течение заболевания, затем ими [11] было отмечено, что носительство DR2 ассоциируется с более тяжелым течением РС. Но позднее на большой американо-европейской когорте больных они [12] не смогли эти данные подтвердить. Другая группа авторов [31] с учетом данных МР-спектроскопии и МРТ показала, что аллель HLA-DRB1*15 влияет на тяжесть заболевания. Было также установлено [13], что носительство аллеля HLA-DRB1*01 отмечается реже при злокачественных формах РС по сравнению с его мягкими вариантами. Большой интерес представляют данные о том, что протективный эффект HLA-DRB1*01 проявляется на значимом уровне только тогда, когда другая хромосома несет аллель HLA-DRB1*15 [35].

В отличие от ситуации с генами системы HLA исследования ассоциаций других генов-кандидатов с клиническим течением РС немногочисленны. Есть отдельные работы [3, 6-8, 18], в которых были выявлены значимые ассоциации с фенотипическими проявлениям, прежде всего, по генам, продукты которых участвуют в развитии иммунного ответа - гены цитокинов, ко-стимулирующих молекул, хемокинов [5] и их рецепторов. Однако и здесь были получены противоречивые результаты и сделаны неоднозначные заключения [9, 23, 34, 36, 42].

Цель настоящего исследования - изучение роли полиморфизмов системы генов цитокинов в патогенезе РС. В задачи исследования входило: изучить полиморфизмы rs6074022, rs1883832, rs1535045 и rs11086998 гена CD40, а также двух полиморфизмов, не относящихся к генам цитокинов rs10492972 (KIF1B) и rs3135388; уточнить предварительные данные по ассоциациям отдельных генотипов со скоростью прогрессирования, характером течения РС и клиническими характеристиками заболевания; оценить вклад генетических факторов в формирование своеобразной клинической картины РС на примере семейных случаев; оценить прогностическое значение выявленных ассоциаций для больных РС.

В исследование были включены 326 больных РС. Диагноз во всех случаях ставился в соответствии с критериями McDonald (2005) [33]. Обследованные были русскими по национальности и проживали в Новосибирске и Новосибирской области. Исследование было одобрено этическими комитетами Государственной новосибирской областной клинической больницы и Новосибирского государственного медицинского университета. Для участия в исследовании у всех пациентов было получено письменное информированное согласие.

В контрольную группу вошли 575 проживающих в Новосибирске человек, 203 мужчины и 372 женщины (средний возраст - 33,6±10,9 года), без воспалительных заболеваний центральной нервной системы. Группа контроля соответствовала по половому и национальному составу группе больных РС.

Все пациенты прошли стандартное клиническое обследование (тщательный сбор анамнеза, включая семейный, физикальный и неврологический осмотр), МРТ на высокопольном томографе, молекулярно-генетическое исследование. На каждого участника заполнялась специально разработанная анкета, включающая демографические данные (возраст, пол, национальность), медицинскую информацию (возраст дебюта, длительность заболевания, скорость прогрессирования, тип течения, сопутствующие аутоиммунные заболевания) и генетический статус (наличие родственников с РС или другими аутоиммунными заболеваниями).

В группе больных отмечалось преобладание женщин в соотношении 1:1,9 (112 мужчин и 214 женщин). Медиана возраста составила 35 лет. Начало заболевания определялось по времени появления первых симптомов. Средняя длительность заболевания составила 8,98±8,70 года.

Медиана возраста дебюта РС составила 26 лет (min - 9, max - 51). Длительность первой ремиссии в среднем - 16 мес (min - 1, max - 300). За последний год до включения в программу наблюдения каждый больной перенес в среднем одно обострение (среднее значение 1,01±0,73). Среднегодовое количество обострений было рассчитано ретроспективно на основании медицинских документов и со слов пациента в подгруппе с ремиттирующим течением РС. За временной интервал для анализа выбраны первые 10 лет заболевания. Среднегодовая частота обострений в указанной подгруппе составила 0,82±0,62.

Тип течения РС определялся в соответствии с международной классификацией, предложенной F. Lub­­lin и S. Reingold [28]. У большинства (69%) больных этой группы был диагностирован ремиттирующий характер течения РС (РРС). Вторично-прогрессирующее течение (ВПРС) наблюдалось у 22% пациентов, ремиттирующе-прогредиентное (РПРС) и первично-прогредиентное (ППРС) - по 3%. У 3% пациентов, включенных в исследуемую группу, заболевание находилось на стадии клинически изолированного синдрома (КИС) с высоким риском развития РС.

Для объективизации клинической картины заболевания использовалась оценка функциональных систем (FS) по Куртцке и расширенная шкала инвалидизации по Куртцке - EDSS (Expanded Disability Status Scale) [27].

Для оценки быстроты нарастания неврологического дефицита (т.е. прогрессирования РС) использовались 2 параметра: балл по шкале тяжести РС (MSSS, Multiple Sclerosis Severity Score) [38] и скорость прогрессирования, определяемая путем соотношения степени тяжести в баллах шкалы EDSS к длительности заболевания в годах [4, 43]. Ключевой принцип MSSS - корректировка единичного балла по шкале инвалидизации отдельного пациента путем сравнения с распределением значений баллов EDSS у пациентов с аналогичной продолжительностью болезни. В рамках сотрудничества 16 различных исследовательских групп на основе обследования 9892 пациентов была создана база данных (таб­лица Global MSSS) и разработан простой частотно-ранговый алгоритм для получения балла MSSS. Все пациенты со средним уровнем инвалидизации для своей продолжительности болезни будут иметь балл MSSS около 5. Соответственно больные с ускоренными темпами прогрессирования получат более высокие значения этого индекса. Для расчета баллов MSSS нами использовалась специально разработанная программа MSSStest (версия 3.0, 2007), реализующая основные принципы метода, описанного R. Roxburgh и соавт. [38].

В табл. 1 приведена обобщенная характеристика больных РС и группы контроля.

Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН. Были исследованы 6 полиморфизмов: CD40 (rs6074022, rs1883832, rs1535045 и rs11086998), rs10492972 (KIF1B), rs3135388 (генетический маркер носительства аллеля HLA-DRB1*15). Все изученные варианты являются однонуклеотидными заменами (SNP, от англ. Single nucleotide polymorphism). Интерес именно к этим генам не случаен, поскольку во многих исследованиях показана роль кодируемых ими белков в патогенезе РС.

ДНК выделяли из 3-5 мл венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК от примесей путем экстракции смесью фенола с хлороформом и осаждение ДНК этанолом [24]. Генотипирование проводилось с использованием технологии TaqMan. Амплификация проводилась с помощью амплификатора iCycler iQ5 («Bio-Rad», США).

Статистический анализ полученных результатов осуществлялся на Intel-совместимом персональном компьютере с использованием статистических программ Statistica for Windows 8.0 («StatSoft, Inc».) и языка программирования R (version 2.11.0, www.r-project.org). Различия в возрасте пациентов анализировали с помощью U-критерия Манна-Уитни. В качестве нулевой гипотезы принималась гипотеза об отсутствии различий в группах. Корреляционный анализ данных проведен с помощью определения коэффициента корреляции Пирсона.

Для выявления ассоциации возраста начала, длительности заболевания, EDSS и средней скорости прогрессирования с генотипом использовали линейный регрессионный анализ (функция «glm» языка программирования R). Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга и выявление ассоциаций генотипа с развитием заболевания проводили методом &khgr;² с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия) [21]. Рассчитывались отношения шансов (OR, odds ratio) с указанием 95% доверительного интервала (95% ДИ). Нулевыми гипотезами являлись соответствие распределению Харди-Вайнберга и отсутствие ассоциаций (OR=1).

Для выявления ассоциаций темпов прогрессирования по баллу MSSS с генотипом и определения достоверности различий медиан нескольких подгрупп рассчитывался H-критерий Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis test) с помощью программы MSSStest. Для сравнений двух групп генотипов применялся идентичный тесту Краскела-Уоллиса U-критерий Манна-Уитни. Пациенты с длительностью заболевания менее 1 года были исключены из данного анализа, так как на основании EDSS оценки в 1-й год болезни нельзя адекватно спрогнозировать дальнейшую скорость прогрессирования заболевания.

Для всех видов статистического анализа различия считались статистически достоверными при достигнутом уровне значимости р<0,05.

В группе больных РС преобладали пациенты с легкой и умеренной степенью инвалидизации, на что указывает средний показатель EDSS 3,01±1,76 балла (min 1, max 8,5). Показатели темпов нарастания инвалидизации также указывают на среднюю скорость прогрессирования РС у большинства больных. Медиана балла MSSS составила 3,90 [2,1; 6,1], скорости прогрессирования - 0,55 балла в год [0,2; 0,6], при этом у 30% пациентов скорость прогрессирования составила менее 0,25 балла в год, у 46% больных - от 0,25 до 0,75 балла и у 24% - была выше 0,75 балла в год.

На основании данных литературы для исследования были выбраны 4 полиморфизма гена CD40: rs6074022 T->C; rs1883832 C->T; rs1535045 C->T; rs11086996 C->G. Частоты аллелей всех четырех полиморфных локусов приведены в табл. 2.

В табл. 3 представлено распределение пациентов с РС и лиц из контрольной группы по генотипам всех исследованных полиморфизмов.

Выявлены статистически значимые ассоциации двух полиморфных локусов с развитием РС: rs3135388 (риск-аллель T, OR=3,23, 95%ДИ 2,43-4,29, p=3,8·10^–17) и rs1883832 (ген CD40, для аллели T OR=1,74, 95%ДИ 1,34-2,32, p=2,96·10^–7). Т.е. гомозиготы, имеющие генотип TT по полиморфизмам rs3135388 и rs1883832, имеют наиболее высокие риски развития РС в представленной когорте (OR=7,84, 95%ДИ 3,19-19,27, p=1,9·10^–7 и OR=3,31, 95%ДИ 2,012-5,452, p=1,02·10^–6 соответственно). Эти варианты генов можно считать генетическими риск-факторами РС в новосибирской популяции. Для других трех полиморфных локусов статистически значимых различий частоты встречаемости генотипов между группой больных РС и контрольной не выявлено (см. табл. 3).

В исследованной когорте больных не отмечается достоверной ассоциации полиморфного локуса rs6074022 гена CD40 с развитием РС, что согласуется с данными, полученными на популяции Алтайского края. Такое противоречие с результатами некоторых исследований [7, 16] может объясняться как генетической гетерогенностью набранных пациентов и недостаточно высоким для такого рода исследований числом больных, чтобы преодолеть эту гетерогенность, так и региональными особенностями РС.

Согласно результатам полногеномного исследования, полиморфный локус rs3135388 находится в сильном неравновесии по сцеплению с HLA-DRB1*15 [19]. Полученные нами результаты подтверждают, что HLA-DRB1*15 является значимым фактором риска развития РС у жителей Новосибирской области.

Изучение влияния генотипа на такие характеристики течения заболевания, как возраст дебюта, длительность первой ремиссии, частота обострений, балл по EDSS и средняя скорость прогрессирования РС, проводили с помощью линейного регрессионного анализа.

Было выявлено влияние генетических факторов на проявления РС, начиная с дебюта заболевания. Возраст манифестации РС оказался статистически значимо ниже на 1,9±0,9 года у носителей редкого аллеля С полиморфизма rs10492972 гена KIF1B (p=0,04). Этот ген расположен на коротком плече первой хромосомы в районе, где наблюдаются делеции при большинстве нейрогенных опухолей. Кодируемый геном KIF1B белок кинезин участвует в аксональном транспорте митохондрий и синаптических везикул и, как предполагается, исходя из данных исследований на животных, может воздействовать на процесс демиелинизации/ремиелинизации [29].

В проведенной работе не выявлено ассоциации полиморфного локуса rs10492972 гена KIF1B с риском РС и показателями прогрессирования, и вообще вопрос о наличии такой ассоциации является очень дискутабельным [17]. В исследованиях на итальянской и греческой популяции также не выявлено влияния этого полиморфизма на риск РС и его прогрессирование [25, 30]. В метаанализе, проведенном Е.А. Кудрявцевой и соавт. [26], был показан статистически значимый (р=0,02) протективный эффект аллеля С полиморфизма rs10492972 в отношении риска РС. Международный консорциум по генетике РС в 2011 г. исключил данный полиморфизм из списка больших риск-факторов РС [22]. Это подчеркивает необходимость очень крупных размеров выборки, чтобы исключить ложноположительные результаты и применить соответствующие статистические методы.

Более ранний дебют (на 1,5±0,8 года) отмечается и у носителей редкого аллеля Т полиморфизма rs1535045 гена CD40 (p=0,04). Причем это согласуется с другой ассоциацией, полученной по данному полиморфизму. У гомозигот по редкому аллелю Т, т.е. у пациентов с генотипом TT полиморфизма rs1535045 гена CD40, достоверно более низкий балл MSSS - 3,32 (против 4,16 у гетерозигот и 4,41 у носителей CC), т.е. наблюдается более медленное прогрессирование РС (p=0,04).

Возраст больных к периоду дебюта заболевания оказался статистически значимо выше на 7,2±3,3 года у носителей редкого аллеля G rs11086998. Возможно, этот аллель мог бы быть использован в качестве предиктора более позднего начала заболевания, а значит, более тяжелого течения. Однако это предположение требует дальнейшего изучения и уточнения. По другим клиническим параметрам статистически значимых различий не выявлено. В некоторых исследованиях также не было установлено связей полиморфизмов в гене CD40 с показателями тяжести РС [36].

По другому полиморфизму гена CD40 rs6074022 при анализе его связи со скоростью прогрессирования РС c помощью линейного регрессионного анализа выявлена значимая ассоциация. У носителей редкого аллеля С этого полиморфного локуса скорость прогрессирования статистически значимо выше на 0,14±0,06 балла в год (p=0,01). Балл по шкале MSSS также выше у носителей генотипа CC (5,45 против 4,20 и 4,24), однако различие не достигло статистически значимого уровня (p=0,26). Наши результаты согласуются с данными C. Jensen и соавт. [23], которые в своей работе приводят доказательства влияния полиморфного локуса rs6074022 на показатели тяжести РС у мужчин, и российских исследований [7, 8].

На следующем этапе работы мы проанализировали подгруппу семейных случаев РС. Родственники пациентов с РС имеют в 15-50 раз более высокий риск развития РС, чем популяция в целом. Величина этого риска коррелирует со степенью родства [37].

В некоторых работах подчеркивается отличие семейных случаев РС от спорадических, что также может быть связано с наследственными факторами [1]. Другие исследователи [32] не находят отличительных черт и указывают на гетерогенность семейного РС.

Случай РС определялся как семейный при наличии у пациента как минимум одного родственника (любой степени родства) с данным заболеванием. В исследованной группе выявлены 25 больных, имеющих родственников с РС, в 23 семьях (в 68% случаев - родственники первой линии родства: мать - дочь/сын; отец - дочь/сын; сестра-брат). Семейный риск повторяемости составил 7,0% у родственников первой, второй или третьей степени родства, общий риск повторяемости - 7,6%.

После проведенного анализа выявлено, что группа больных с семейными случаями РС статистически значимо не отличалась от остальных включенных в исследование больных РС по возрасту, длительности заболевания и уровню инвалидизации (EDSS). Однако при этом выявлены клинические особенности по другим параметрам, в том числе относящимся традиционно к прогностическим.

Возраст больных к периоду дебюта РС в группе семейных случаев оказался немного ниже по сравнению со спорадическими, однако статистически не достоверно (23,6±9,22 против 27,5±8,61 года, р=0,09). Симптомы дебюта были различными, но при семейном РС преобладали зрительные, глазо­двигательные и чувствительные нарушения (60%) и не встречались прогностически неблагоприятные тазовые расстройства, только в 1 (4%) случае первыми симптомами были мозжечковые нарушения. Достоверных различий в длительности первой ремиссии РС не выявлено (р>0,05).

Показатель прогрессирования заболевания, оцененный по шкале MSSS, в подгруппе семейного РС был достоверно ниже по сравнению со спорадическими случаями (3,27 против 4,38, р=0,03). Причем балл MSSS коррелировал с возрастом дебюта (r=0,49, p<0,05) и длительностью первой ремиссии (r= –0,35, p<0,05).

У больных, имеющих родственников с РС, отмечена бо`льшая частота аллеля Т полиморфизма rs3135388 (44% против 33%, р=0,003). Поскольку данный полиморфный локус является генетическим маркером носительства аллеля HLA-DRB1*15 и увеличивает риск РС более чем в 3 раза, по данным нашего исследования, можно предполагать, что гаплотип HLA в определенной мере вносит вклад и в формирование своеобразного течения семейных форм заболевания. Также, возможно, аллель HLA-DRB1*15 определяет бо'льшую вероятность передачи РС последующим поколениям, т.е. появления новых семейных случаев.

На уровне тенденции отмечена немного более высокая частота аллеля T полиморфного варианта rs1883832 гена CD40, однако не достигшая уровня статистической значимости.

В ходе исследования подробно изучены полиморфизмы генов нескольких групп: цитокинов (на примере гена CD40), не относящихся к процессам иммунного воспаления (KIF1B), и маркера носительства аллеля системы HLA. Выявлено влияние генотипов rs1883832 гена CD40 (риск-аллель T) и rs3135388 (риск-аллель T).

Уточнены некоторые предварительные данные по ассоциациям отдельных генотипов со скоростью прогрессирования и клиническими характеристиками заболевания, в частности с возрастом дебюта. С помощью линейного регрессионного анализа выявлена ассоциация редкого аллеля С полиморфизма rs6074022 (CD40) с более высокой скоростью прогрессирования. А генотип TT полиморфизма rs1535045 гена CD40 сопряжен с более медленным прогрессированием РС и ранней манифестацией заболевания, что может с определенной долей вероятности говорить о протективной роль аллеля Т.

Таким образом, в данной работе на репрезентативном клиническом материале (сибирская когорта) было подтверждено, что семейные случаи PC отличаются от спорадических более мягким, доброкачественным течением. Выявлены некоторые молекулярно-генетические и клинические особенности дебюта семейного РС.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что имеется достоверное влияние генетических факторов на фенотипическую экспрессию РС. Продемонстрирован вклад всех изученных полиморфизмов в развитие своеобразной клинической картины.

Данное исследование является пилотным и содержит много теоретических предположений, в связи с чем необходимы дальнейшие специальные исследования, в том числе семейных случаев. Изучение генетики семейных форм, возможно, станет еще одним шагом к пониманию патогенеза РС.

В заключение необходимо отметить, что име­ющиеся в литературе противоречивые данные об ассоциации различных полиморфных локусов и клинических проявлений заболевания могут быть связаны как с небольшим числом обследованных пациентов, малой продолжительностью наблюдения и разными критериями включения пациентов в исследование, так и с региональными особенностями мест проживания пациентов. Все это делает актуальным проведение дальнейших исследований в генетически разнородных популяциях для выявления новых связанных с РС биомаркеров, которые могут быть использованы как прогностические факторы или терапевтические мишени для модуляции аутоиммунного ответа у пациентов с РС. Изучение регио­нальных особенностей генетических факторов РС внесет свой вклад в понимание патогенеза этого комплексного и гетерогенного заболевания, будет способствовать улучшению оказания помощи больным, страдающим РС, и приближению к эре персонифицированной медицины.

Работа поддержана Российской федеральной программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (2012-1.5-12-000-1002). Государственный контракт №8490.