Биомаркеры бокового амиотрофического склероза

Боковой амиотрофический склероз (БАС) — прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся гибелью мотонейронов головного и спинного мозга, проявляющееся в виде прогрессирующей мышечной слабости и амиотрофий. БАС считается гетерогенным по своему патогенезу заболеванием, развитие которого связано с комбинацией генетических факторов, факторов внешней среды, а также процессов естественного старения [1, 2]. Отмечена высокая степень вариабельности возраста начала заболевания, его первых проявлений, скорости прогрессирования. Средняя продолжительность жизни с момента установления диагноза составляет 3 года. В патогенезе БАС важную роль играют механизмы оксидативного стресса, нарушение аксонального транспорта, митохондриальная дисфункция, эксайтотоксичность, нарушение метаболизма протеинов и РНК, образование белковых агрегатов, астроцитарная дисфункция, активация микроглии, нейровоспаление [3, 4].

До 95% всех случаев БАС относят к спорадической форме. Лишь в 5—10% случаев заболевание связано с наследованием мутантного гена. Известно более 40 генов, вовлеченных в этиопатогенез БАС [5]. Самыми распространенными являются мутации генов C9orf72, SOD1, TARDBP, FUS и TBK-1.

На сегодняшний день существует несколько актуальных проблем БАС. Существующая классификация не учитывает всей гетерогенности патологии, а современные диагностические критерии обладают низкой чувствительностью [6]. Еще одной проблемой является большое количество неудачных клинических исследований потенциальных лекарственных средств. Причинами этих неудач в том числе являются включение пациентов в исследования на поздних стадиях и высокая вариабельность форм БАС [7]. Также при оценке эффективности лекарственных препаратов очень редко исследуются биомаркеры, которые могут более объективно отражать их влияние на патогенетические мишени. Исследование биомаркеров может помочь в решении данных проблем.

Биомаркер — это характеристика, которую можно объективно измерить, и которая является показателем нормальных или патологических процессов, а также различных реакций на терапевтическое вмешательство [8]. Развитие молекулярной биологии, иммунологии, генетики, протеомики и метаболомики открывает большой простор для научных исследований в поисках наилучших маркеров БАС.

Наиболее репрезентативным источником биомаркеров считается цереброспинальная жидкость (ЦСЖ), так как она находится в непосредственном контакте с нервной тканью и лучше всего может отражать патологические процессы и изменения, происходящие в нервной системе. Однако получение образцов ЦСЖ является инвазивной процедурой, несет риски осложнений, имеет ряд неудобств для пациента. Также этот метод имеет явные этические преграды, особенно для вовлечения здоровых лиц в клинические исследования. Поэтому кровь представляется более доступным для исследования источником биомаркеров. Однако в крови может происходить трансформация биомаркеров, поступающих из ЦНС, что может сказаться на репрезентативности исследований. При этом кровь может лучше отражать другие патологические процессы, происходящие за пределами ЦНС, например в мышечной ткани или нервно-мышечных синапсах. Привлекательными субстратами для исследований представляются моча и слюна. Забор этих жидкостей является неинвазивной манипуляцией, очень простой в исполнении, лишенной возможных рисков для пациента.

На сегодняшний день наиболее изученными биомаркерами БАС являются фосфорилированные тяжелые цепи нейрофиламента (pNFH) и легкие цепи нейрофиламента (NFL). Нейрофиламенты — это структурные белки цитоскелета, экспрессирующиеся в нейронах. Агрегация и аккумуляция этих белков приводят к нарушению аксонального транспорта, морфологическим и функциональным изменениям мотонейронов и их массивной гибели, что является характерной чертой БАС [9]. Цепи нейрофиламента достаточно стабильны, поэтому с использованием серологических методов исследования достаточно легко определять их концентрацию в таких биологических жидкостях, как ЦСЖ и кровь. В исследованиях было показано повышение концентрации pNFH в ЦСЖ и крови на ранних стадиях БАС по сравнению со здоровыми лицами и пациентами с другими неврологическими заболеваниями, что говорит о достаточной специфичности для БАС [10—12]. В случае семейной формы БАС концентрация NFL повышается примерно за 1 год до появления первых симптомов, что может использоваться в прогностических целях у носителей мутантных генов.

В настоящее время в ряде исследований установлены чувствительность и специфичность для pNFH в диагностике БАС. При определении pNFH в ЦСЖ чувствительность составляет от 77 до 97,3%, специфичность — от 80 до 95%. При определении цепей нейрофиламента в крови чувствительность и специфичность составляют 89—90% и 71—75% соответственно [13]. Показано, что уровень концентрации pNFH коррелирует с продолжительностью жизни (установлена обратная зависимость) и скоростью прогрессирования заболевания (прямая зависимость) [12, 14, 15]. Это может использоваться в прогностических целях и для разделения пациентов на группы с быстро и медленно прогрессирующими формами БАС.

Также установлено, что повышение концентрации pNFH и NFL коррелирует со степенью поражения верхних мотонейронов [10].

Микро-РНК (miRNA) — это некодирующие цепочки РНК длиной в 20—25 нуклеотидов, которые участвуют в регуляции экспрессии генов на транскрипционном и посттранскрипционном этапе путем РНК-интерференции. Микро-РНК имеют тканеспецифичную экспрессию [16]. Они выявляются во многих физиологических жидкостях, в исследованиях БАС их определяют в ЦСЖ, крови и мышечных биоптатах. Дисрегуляция в экспрессии микро-РНК играет роль в развитии нейродегенеративных заболеваний в общем, и БАС в частности [17].

Наиболее изученной микро-РНК при БАС является miR-206. Это специфичная для мышечной ткани микро-РНК, экспрессия которой подвергается изменениям при развитии БАС [18]. Считается, что miR-206 играет протективную роль, обеспечивая выживаемость синаптических контактов и активность спрутинга. Определение miR-206 в плазме крови обладает прогностическим потенциалом, что было показано в исследовании G. Dobrowolny и соавт. [19]. В данном исследовании, помимо miR-206, еще для двух микро-РНК, miR-133a и miR-155a-5p, было показано значимое увеличение их концентрации в плазме крови при БАС по сравнению с контролем. Также имеется тесная корреляция между их концентрацией и темпами прогрессирования заболевания. Чем больше копий данных микро-РНК в плазме на начальных стадиях болезни, тем ниже темпы прогрессирования БАС. В клинической практике определение данных микро-РНК позволит выделять пациентов с быстро и медленно прогрессирующим БАС.

Интересным представляется исследование микро-РНК экзосом. Экзосомы — это везикулы, образованные в ходе естественного экзоцитоза клеткой, содержащие различные типы РНК, ДНК, липиды и белки [20]. Экзосомы захватываются соседними клетками, и их содержимое влияет на клеточные функции клетки-реципиента, что обеспечивает межклеточные взаимодействия. Экзосомы очень стабильны, их содержимое не подвергается воздействию различных ферментов. Таким образом, содержащиеся в экзосомах микро-РНК являются наилучшими маркерами, которые непосредственно отражают дисрегуляцию метаболизма микро-РНК в клетках при различных патологиях, представляющих интерес.

В исследовании, проведенном C. Ricci и соавт., использовался метод выделения из плазмы крови пациентов с БАС экзосом, образованных нейронами [21]. В данном исследовании было выделено несколько микро-РНК, экспрессия которых значимо меняется в случае БАС. Так, для miR-146a-5p, miR-199a-3p, miR -199a-5p, miR-151a-3p, miR-151a-5p было показано увеличение экспрессии, а для miR-4454, miR-10b-5p, miR-29b-3p — снижение экспрессии по сравнению с группой контроля.

Учитывая высокую стабильность в биологических жидкостях, а также тканеспецифичную экспрессию, микро-РНК представляются наиболее перспективными биомаркерами БАС. На сегодняшний день данные некоторых исследования противоречат друг другу, что может быть связано с гетерогенностью патологии, применением разных методов определения микро-РНК, несовершенством выборок пациентов и контролей [22]. Потому еще требуется время для стандартизации методов и технологий определения микро-РНК и валидизации референсных значений.

Общей чертой многих нейродегенеративных заболеваний является активация глии, сопровождающаяся повышением уровня медиаторов воспаления, что потенциирует нейровоспаление и гибель нейронов. БАС не является исключением, потому достаточно много исследований посвящено изучению воспалительных профилей при БАС [23].

Так, исследование панели из 35 медиаторов воспаления показало значительное повышение концентрации таких медиаторов, как интерлейкин (ИЛ)-10, ИЛ-6, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), ИЛ-2 и ИЛ-15 в ЦСЖ при БАС по сравнению с другими нейродегенеративными заболеваниями. Эти маркеры обладают высокими чувствительностью и специфичностью (87,5 и 91,2% соответственно), однако их уровни не коррелируют с длительностью заболевания или клиническим вариантом БАС [24].

В исследовании M. Olesen и соавт. было установлено, что для разных вариантов БАС характерны свои воспалительные профили, которые коррелируют с продолжительностью заболевания [25]. В этом исследовании сравнивались воспалительные профили пациентов с БАС, имеющих мутацию в гене SOD1 (mSOD1), с гексануклеотидной экспансией C9orf72 и все остальные случаи БАС. Так, в случае C9orf72 заметно выше значения альфа-интерферона в ЦСЖ. В сравнении с mSOD1 и C9orf72 в прочих случаях БАС в ЦСЖ было выявлено более высокое значение фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α). Продолжительность жизни пациентов с mSOD1 обратно пропорциональна уровню лиганда семейства TNF, индуцирующего апоптоз (TRAIL) в ЦСЖ. При наличии гексануклеотидной экспансии C9orf72 продолжительность жизни коррелирует с уровнем ИЛ-1β плазмы крови (обратная зависимость), в остальных же случаях БАС продолжительность жизни коррелирует с уровнями TNF-α, ИЛ-10 и TRAIL плазмы крови (обратная зависимость).

В ряде исследований было показано изменение концентраций различных провоспалительных медиаторов и медиаторов иммунного ответа, что говорит о вовлечении различных механизмов воспалительных реакций и различных путях их регулирования в патогенезе БАС. Таким образом, исследование профилей медиаторов воспаления можно использовать для дифференциальной диагностики БАС, отбора пациентов в различные группы в клинических исследованиях, а также для оценки эффективности таргетной терапии.

p75NTR экспрессируется в большом количестве в мотонейронах в период эмбрионального развития, в постнатальном же периоде экспрессия значительно снижается, а при повреждении мотонейронов экспрессия рецептора нейротрофина вновь значительно возрастает [26]. Данный белок опосредует два противоположных процесса — выживание и гибель нервных клеток в зависимости от наличия или отсутствия нейротрофинов. При БАС данный рецептор запускает процессы апоптоза в мотонейронах. Гистологически была показана гиперэкспрессия p75NTR в α-мотонейронах спинного мозга пациентов с БАС [27].

Внеклеточный домен рецептора нейротрофина выделяется с мочой, где его можно обнаружить у новорожденных и в значительно меньшем количестве у взрослых. В исследованиях было показано, что по сравнению со здоровыми лицами и пациентами с неврологическими заболеваниями у пациентов с БАС достоверно выше концентрация p75NTR в моче, и чем выше уровень p75NTR, тем быстрее темпы прогрессирования БАС. Чувствительность и специфичность для p75NTR составляют 93 и 100% соответственно по сравнению со здоровыми людьми, и 93 и 79% соответственно по сравнению с другими нейродегенеративными заболеваниями [28].

Одной из наиболее распространенных генетических причин развития БАС является экспансия гексануклеотидных повторов GGGGCC в гене C9orf72, которая обнаруживается в 30—40% семейных и до 10% спорадических случаев БАС [29]. Эта мутация ведет к потере функции кодируемого белка, участвующего в аксональном транспорте и межнейрональном взаимодействии, а также к приобретению нейротоксических свойств синтезируемой РНК [30]. С этих РНК возможна трансляция белков с дипептидными повторами (DPR), которые можно обнаружить в ЦСЖ с помощью иммунологических методов [31, 32]. DPR представляется потенциальным биомаркером, который, вероятно, позволит оценивать эффективность таргетной терапии.

TDP-43 (TAR ДНК-связывающий протеин 43 кДа) является ключевым компонентом цитоплазматических убиквитинированных включений при спорадических и семейных формах БАС [33]. Скопления этого белка обнаруживаются в нервной ткани в 97% случаев и являются высокоспецифичным патоморфологическим признаком БАС. Потому TDP-43 может оказаться очень ценным биомаркером для большинства пациентов с БАС. В ряде исследований было показано повышение концентрации TDP-43 в ЦСЖ и плазме крови, однако есть сообщения и об исключительно высокой вариабельности значений TDP-43 [34]. Учитывая наличие различных изоформ TDP-43, а также его взаимодействия с различными белками и мРНК, требуется дальнейшее изучение TDP-43 для валидизации методов его определения в ЦСЖ и плазме крови.

Cu/Zn-супероксиддисмутаза относится к семейству антиоксидантных ферментов и катализирует реакцию дисмутации супероксида в кислород и пероксид водорода и играет важную роль в защите клеток от оксидативного стресса [35]. Мутации гена Cu/Zn-SOD1 приводят к образованию нерастворимых патологических агрегатов этого белка, нарушающих множество важных клеточных функций, и являются причиной около 20% всех семейных и 1—2% спорадических случаев БАС [36]. Патологические агрегаты Cu/Zn-SOD1 выявляются в ЦСЖ, однако статистически значимых различий между пациентами с БАС и группами контроля обнаружено не было, потому данный фермент не может рассматриваться в качестве диагностического биомаркера [37]. Однако Cu/Zn-SOD1 может рассматриваться в качестве маркера эффективности таргетной терапии семейной формы SOD1-БАС — в исследовании было показано значимое снижение концентрации агрегатов Cu/Zn-SOD1 в ЦСЖ в ответ на интратекальное введение антисмысловых олигонуклеотидов [38].

Цистатин C является ингибитором цистеиновых протеаз и участвует в некоторых заболеваниях ЦНС [39]. При БАС цистатин C выявляется в небольших эозинофильных включениях в телах нижних мотонейронов [40]. При БАС было обнаружено значительное снижение концентрации цистатина C в ЦСЖ пациентов с БАС по сравнению с группами контроля. При этом уровень цистатина C прямо коррелирует с продолжительностью жизни пациентов [41]. Противоположные данные были получены при исследовании цистатина C в плазме крови, где было показано значимое увеличение его концентрации у пациентов с БАС по сравнению со здоровыми лицами [42].

Диагностической ценностью может обладать исследование активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в плазме крови. Еще в 1981—1983 гг. было показано специфическое увеличение активности АХЭ в плазме крови пациентов с БАС по сравнению со здоровыми лицами и пациентами, страдающими различными нервно-мышечными заболеваниями [43, 44]. Также в этих исследованиях было установлено, что активность АХЭ повышается у пациентов с типичной формой БАС и прогрессирующей мышечной атрофией, в то время как у пациентов с первичным латеральным склерозом активность АХЭ не повышалась. Однако в случае БАС не было обнаружено корреляции между уровнем активности АХЭ и длительностью заболевания либо степенью его тяжести (стоит отметить, что в этих исследованиях для оценки тяжести БАС не применялась функциональная шкала БАС ALSFRS-r). В тех исследованиях было высказано предположение, что повышение активности АХЭ в плазме крови связано с поражением мотонейронов спинного мозга. Однако, например, у пациентов со спинальной мышечной атрофией подобного увеличения активности АХЭ обнаружено не было [45]. Вероятно, изменение активности АХЭ имеет специфический характер при БАС, потому АХЭ можно рассматривать в качестве потенциального маркера. Интересным является еще и тот факт, что активность АХЭ можно определить в слюне, что уже было проведено у пациентов с болезнью Альцгеймера и болезнью Паркинсона [46, 47].

Помимо цепей нейрофиламента, в ЦСЖ можно определять концентрацию других нейроспецифических белков. В работе Ю.Н. Рушкевич и соавт. [48] исследовались концентрации нейроспецифической энолазы (НСЭ) и белка S100b в ЦСЖ и плазме пациентов с БАС. НСЭ — это гликолитический фермент, экспрессирующийся в зрелых нервных клетках [49]. S100b — кальцийсвязывающий белок, синтезирующийся астроцитами и олигодендроцитами. В исследовании было показано значимое повышение концентрации НСЭ в ЦСЖ при разных клинических формах БАС (бульбарная, шейно-грудная, пояснично-крестцовая) по сравнению с контрольной группой (неврологически здоровые лица и пациенты с радикулопатией). Значимое повышение концентрации S100b в ЦСЖ было отмечено только при бульбарной форме БАС. В плазме крови только при шейно-грудной форме БАС было отмечено достоверное повышение концентрации НСЭ. Достоверных изменений концентрации этих белков при других формах БАС в плазме крови отмечено не было.

Стоит отметить, что концентрация НСЭ повышается в ЦСЖ при некоторых заболеваниях нервной системы, например при нарушениях мозгового кровообращения, черепно-мозговых травмах, эпилепсии [49]. Таким образом, НСЭ можно рассматривать как неспецифический маркер нейронального поражения. Требуются дальнейшие исследования для оценки чувствительности и специфичности определения НСЭ в ЦСЖ при БАС, а также корреляции между концентрацией НСЭ и темпами прогрессирования заболевания. Учитывая, что НСЭ отражает повреждение нервной системы, ее можно использовать как биомаркер в клинических исследованиях для объективной оценки эффективности лекарственных препаратов.

Возможно комплексное исследование биомаркеров. Так, совместное определение эндотелиального фактора роста сосудов и его рецептора (VEGF, VEGFR2) с TDP-43 в ЦСЖ и VEGFR2 с оптинейрином в плазме крови в комбинации с данными о возрасте и индексом массы тела пациента обладает высокой предсказательной способностью риска БАС с чувствительностью 98% и специфичностью 93% [50].

Помимо p75NTF, в моче были обнаружены еще несколько потенциальных биомаркеров БАС. У пациентов с БАС выявляется значимое снижение уровня глюкозил-галактозил-гидроксилизина — метаболита распада коллагена. По мере прогрессирования заболевания концентрация глюкозил-галактозил-гидроксилизина также постепенно снижается [51]. Также в моче пациентов с БАС можно обнаружить снижение концентрации коллагена IV типа [52]. Еще один потенциальный биомаркер — 8OH2’dG (8-гидроксил-2’-деоксигуанозин) отражает повреждения ДНК вследствие оксидативного стресса. Концентрация этого маркера повышается при БАС, уровень имеет обратную зависимость с темпами прогрессирования заболевания, что дает возможность его использования как прогностического маркера [53].

Как было показано в статье, на сегодняшний момент уже известен широкий спектр биомаркеров БАС. Однако они пока не используются в повседневной клинической практике. Некоторые из них обладают достаточно высокой специфичностью и чувствительностью, что может позволить ставить диагноз на более ранних стадиях. Ряд маркеров позволяет спрогнозировать темпы прогрессирования заболевания. Комплексная панель биомаркеров может обладать более значимым диагностическим и прогностическим потенциалом. Вероятно, некоторые из биомаркеров войдут в диагностические критерии БАС, что улучшит их чувствительность.

Применение биомаркеров на всех этапах разработки лекарственных препаратов, безусловно, позитивно отразится на рандомизированных клинических исследованиях, так как позволит включать в них пациентов на ранних, а возможно, и на досимптомной стадиях болезни, а также формировать менее гетерогенные выборки пациентов. Биомаркеры также могут стать дополнительным инструментом исследования фармакодинамики лекарственных препаратов.

Несмотря на то что в последнее десятилетие работы по обнаружению биомаркеров БАС были весьма успешными, необходимы дальнейшие исследования для надлежащей валидизации потенциальных биомаркеров и методов, используемых для их измерения.

Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда (РНФ) №19-15-00329.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.