С депрессией хотя бы 1 раз в жизни сталкивались 15—20% лиц в общей популяции [1], это заболевание является одним из глобальных приоритетов общественного здравоохранения, особенно с учетом того, что 30—40% пациентов с депрессией являются резистентными к фармакотерапии или психотерапии [2]. Депрессия представляет собой гетерогенное заболевание, затрагивающее метаболические процессы во всем организме [3].

Кишечная микробиота тесно связана с нервной системой, при этом кишечник и мозг двунаправленно влияют друг на друга. Кишечная микробиота участвует в правильном функционировании кишечника, является источником витаминов, аминокислот и короткоцепочечных жирных кислот, оказывает значительное влияние на процессы, связанные с синтезом нейромедиаторов, и модуляцию иммунной системы [4—6]. Изменение кишечного микробиома может привести к нарушению функционирования центральной нервной системы (ЦНС) [5]. В свою очередь нервная система влияет на кишечную микробиоту через блуждающий нерв, а также эндокринную систему, где велика роль стрессовых реакций [4].

В условиях нормального гомеостаза система, включающая влияние кишечной микробиоты на различные процессы в организме, сбалансирована во всех направлениях. Однако если, например, в кишечнике наблюдается патологический избыточный рост микроорганизмов, этот тонкий баланс нарушается, что может проявиться как на желудочно-кишечном или иммунном уровнях, так и на уровне ЦНС. Таким образом, дисбаланс в кишечной микробиоте человека может привести к развитию, казалось бы, не связанного с ней заболевания, например депрессии [5].

Микробиом является динамической системой, состав которой зависит от комбинации различных факторов (генетики, метаболизма, возраста, географии проживания, применения антибиотиков) и стресса [7]. Питание и пищевые добавки, такие как пробиотики и пребиотики, играют важную роль в модуляции микробиома в здоровом состоянии. Микробиом может быть легко изменен под воздействием некоторых факторов, таких как диета, и все больше признается, что он потенциально влияет на физиологию человека — пищеварение, всасывание питательных веществ, формирование иммунного ответа слизистой оболочки кишечника и на синтез или изменение множества потенциальных биологически активных соединений. Таким образом, диетическая коррекция микробиоты может быть использована для изменения физиологических особенностей хозяина, в том числе патологических, с целью оказания воздействия на развитие и прогрессирование заболеваний.

В настоящее время появляется все больше данных, свидетельствующих о значительном влиянии как диеты, так и микробиоты кишечника на эмоциональное поведение и неврологические процессы, в то же время, как было сказано ранее, микробиота кишечника сильно зависит от диеты [8]. С ростом понимания механизмов, вовлеченных в сложное взаимодействие между диетой и микробиомом кишечника и его влиянием на тревогу/депрессию, можно определить конкретные диетические модели, которые могут помочь предотвратить тревожные и аффективные расстройства или явиться дополнением к антидепрессантной терапии [5]. Исследования показывают, что существует связь между диетой и депрессией, однако их результаты противоречивы, а направленность и механизм этой связи в настоящее время неясны [8]. Стресс и депрессия в свою очередь могут изменять пищевые пристрастия пациента, что также влияет на кишечную микробиоту [8].

Цель исследования — поиск ассоциаций кишечных микроорганизмов с депрессивными расстройствами и изучение влияния диеты на кишечную микробиоту.

Материал и методы

Данная работа является дополнительной частью исследования «Метагеномный анализ кишечной микробиоты людей с депрессивными расстройствами для выявления маркерных композиций генов. Одноцентровое неинтервенционное наблюдательное поисковое исследование», код исследования PKB1-2020-01. Исследование было одобрено комиссией по этике ГБУЗ «НИИО им. Л.И. Свержевского» ДЗМ (протокол №2 от 20 мая 2020 г.).

Пациенты отбирались среди поступающих на стационарное лечение в ГБУЗ ПКБ №1 ДЗМ. Для психометрической оценки состояния пациентов в исследовании использовались следующие методики: шкала Гамильтона для оценки депрессии с 17 пунктами (HAMD-17) [9], Шкала депрессии центра эпидемиологических исследований (CES-D) [10] и Опросник генерализованного тревожного расстройства с 7 пунктами (ГТР-7) [11].

В исследование были включены 14 пациентов с депрессией и 14 здоровых добровольцев. Все обследованные подписали информированное согласие. Пациенты в возрасте от 18 до 60 лет получали лечение по поводу депрессивного эпизода средней и тяжелой степени тяжести (рубрики МКБ-10 F31.3; F31.4, F31.5; F32.1; F32.2; F32.3; и F32.8, F32.9, F33.1, F33.2, F33.3), с суммарным баллом по HAMD ≥14, общим баллом по CES-D ≥27 и общим баллом по ГТР-7 <10. Критерии включения для группы здоровых добровольцев: отсутствие психиатрического заболевания; общий балл по CES <18 и по GAD7 <5. Критерии невключения: наличие острых инфекционных заболеваний, хронических аутоиммунных заболеваний, хронических соматических заболеваний, прием антибиотиков и пробиотиков в течение последних 3 мес. Первичное обследование и сбор анамнеза проводились в соответствии с принятой в учреждении клинической практикой, включая антропометрические показатели (рост, вес).

Клинико-демографическая характеристика обследованных представлена в таблице. Пациенты и здоровые добровольцы не отличались по возрастно-половой характеристике, антропометрическим показателям, статусу курения и отношению к алкоголю.

Клинико-демографическая характеристика изученной выборки

Примечание. * — достоверные различия между группами, p≤0,001.

Опросник рациона питания (Diet History Questionnaire, Version 3 (DHQ-III)) [12] представляет собой стандартизованную методику, оценивающую частоту приема разных типов пищи за предшествующий обследованию год. Каждый пункт опросника представляет собой отдельное наименование пищи, оценка производится по частоте употребления в соответствии со следующими оценками: отсутствие приема или прием реже 1 раза в месяц, 1—3 раза в месяц, 1 раз в неделю, 2—4 раза в неделю, 5—6 раз в неделю, 1 раз в день, 2—3 раза в день, 4—5 раз в день, >6 раз в день. Таким образом, заполняется матрица, позволяющая оценить частоту приема каждого продукта. Для целей данного исследования каждой частоте приема продукта был присвоен ранг от 1 до 9.

Анализ микробиоты

Геномная ДНК выделялась из навесок замороженного кала при помощи набора QIAamp DNA Stool Mini Kit («Qiagen») по протоколу производителя. Концентрация ДНК определялась с помощью Qubit. Библиотеки для shotgun секвенирования готовились набором Hyper Library construction kit («Kapa Biosystems», Roche). Полученная геномная ДНК была фрагментирована на ультразвуковом фрагментаторе Covaris M220 («Covaris», США) до размера фрагментов 100—700 пар оснований (средний размер ~350 п.о.). Библиотеки ДНК для секвенирования готовились с использованием наборов реагентов NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina и NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 1) («NEB», Великобритания) согласно протоколу производителя. Для секвенирования были отобраны фрагменты длиной от 250 до 500 п.о., включая адаптерные последовательности. Библиотеки были проверены при помощи Agilent TapeStation и смешаны эквимолярно. Контроль качества полученных библиотек фрагментов ДНК проводили на приборе Agilent Bioanalyzer 2100 («Agilent Technologies», США) с помощью набора High Sensitivity Kit в соответствии с протоколом производителя. После контроля качества и определения количества при помощи qPCR пул библиотек был секвенирован на двух дорожках прибора Illumina HiSeq X Ten. В результате было получено 2,5 млрд чтений. Секвенированные данные депонированы в базе данных NCBI (BioProject ID PRJNA762199).

Контроль качества проводился при помощи программы FastQC. Для удаления последовательностей адаптеров и тримминга использовалась программа Trimmomatic v0.39. При тримминге применялись настройки HEADCROP:15 (удаление первых 15 нуклеотидов), SLIDINGWINDOW:4:20 (контроль качества прочтений по минимальному порогу Q=20), MINLEN:50 (минимальная длина оставшихся ридов не должна быть <50 нуклеотидов). Контаминация ДНК человека удалялась методом картирования секвенированных чтений на геном человека (версии hg19) при помощи Bowtie2. Финальная оценка качества и оценка параметров каждого сиквенса после контроля качества выполнялись при помощи программы FastQC. В результате секвенирования было отсеяно до 14% ридов. Минимальная длина рида составила 50 п.о., максимальная — 135 п.о. Средний размер сиквенса, вычисленный по медиане, равен 7,84 Гбаз.

Определение относительной представленности бактерий на таксономических уровнях филов, родов и видов проводилось с использованием программы MetaPhlAn3.

Статистический анализ выполнен с использованием программного обеспечения XLSTAT (Addinsoft (2021). XLSTAT statistical and data analysis solution. New York, USA. https://www.xlstat.com/en). Характеристика материала проведена методами описательной статистики. Категориальные переменные представлены в виде частот и процентов. Непрерывные переменные приведены в виде средних значений, стандартных отклонений, медиан и квартилей 1 и 3. Для анализа различий категориальных показателей между группами использовался точный критерий Фишера. Различия непрерывных переменных оценивались с помощью непараметрического теста Манна—Уитни с апостериорной поправкой на множественность сравнений по методу Benjamini—Hochberg. По результатам сравнения содержания различных видов микроорганизмов между группами был построен Volcano plot зависимости значимости различий (отрицательный десятичный логарифм значения p после коррекции на множественность сравнений) от логарифма с основанием 2 кратности различий содержания микроорганизмов в группах. Ассоциации между параметрами шкалы DHQ-III и представленностью микроорганизмов оценивались с помощью метода ранговой корреляции Спирмена с последующим построением тепловых карт корреляционных коэффициентов.

Результаты

На рис. 1 на цв. вклейке представлен график Volcano plot по результатам количественного определения микроорганизмов в кишечной микробиоте и сравнения результатов филогенетического анализа между группами пациентов и здоровых добровольцев. У пациентов с депрессией представленность Erysipelatoclostridium и Clostridium innocuum в микробиоте была выше в 11,3 и 14,4 раза (p<0,01) в сравнении со здоровым контролем. Виды Fusicatenibacter saccharivorans, Faecalibacterium prausnitzii и Roseburia faecis, а также другие представители рода Roseburia в совокупности оказались статистически значимо более распространены в микробиоте здоровых добровольцев (представленность в 6,5, 2,14, 8,75 и 5,2 раза выше соответственно) (p<0,01).

Рис. 1. График Volcano plot различий в составе микробиома кишечника в группах пациентов с депрессией и у контроля.

Выявленные ассоциации отобранных микроорганизмов Erysipelatoclostridium, Clostridium innocuum, Fusicatenibacter saccharivorans, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia faecis, Roseburia с баллами по пунктам шкалы питания приведены на рис. 2 на цв. вклейке в виде тепловых карт.

Рис. 2. Тепловые карты коэффициента корреляции между содержанием Erysipelatoclostridium, Clostridium innocuum, Fusicatenibacter saccharivorans, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia faecis, Roseburia и рангом частоты употребления продуктов по методике DHQ-III (обведены статистически значимые корреляции).

Выявляется статистически значимая положительная корреляция микроорганизмов, ассоциированных с депрессией, Erysipelatoclostridium, Clostridium innocuum с диетой, в основу которой входят жирные сорта рыб, отрицательная корреляция с диетой, в которую входят следующие продукты: яйца, низкокалорийный и обезжиренный йогурт, хлебцы. Выявляется статистически значимая положительная корреляция микроорганизмов, статистически значимо больше встречающихся у здоровых добровольцев — Fusicatenibacter saccharivorans, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia faecis, Roseburia — со следующими продуктами питания: чай, кофе и сидр, и отрицательная корреляция с диетой, содержащей ветчину, жареную рыбу, белый рис, киш, бульонные кубики и портвейн.

Обсуждение

Всесторонний анализ опубликованных исследований, посвященных изучению микробиома кишечника и депрессии, показал значительные различия между микробиотой пациентов с депрессией и здоровыми контрольными группами [13]. При депрессии в микробиоте наблюдается переизбыток потенциально вредных и вызывающих воспаление бактерий в сочетании с уменьшением количества полезных бактерий [14]. В нашем филогенетическом исследовании кишечной микробиоты была выявлена статистически значимая корреляция между уровнем содержания бактерий Erysipelatoclostridium и Clostridium innocuum и депрессией. Эти бактерии могут проявлять патогенные свойства [15]. При анализе корреляции этих микроорганизмов с типом питания были обнаружены их положительные ассоциации с потреблением пирогов и хлебобулочных изделий и отрицательные — с потреблением нежирного и обезжиренного йогурта. В метаанализе Y. Li и соавт. [16] было показано, что рацион питания, характеризующийся высоким потреблением фруктов, овощей, цельного зерна, рыбы, оливкового масла, молочных продуктов с низким содержанием жира и антиоксидантов и низким потреблением продуктов животного происхождения, ассоциировался со снижением риска развития депрессии. Модель питания, характеризующаяся высоким потреблением красного и/или переработанного мяса, рафинированного зерна, сладостей, молочных продуктов с высоким содержанием жира, сливочного масла, картофеля и соусов с высоким содержанием жира и низким потреблением фруктов и овощей, связана с повышенным риском депрессии. В настоящем исследовании обнаружена подобная взаимосвязь. Наличие ассоциированных с депрессией кишечных бактерий Erysipelatoclostridium и Clostridium innocuum отрицательно связано с потреблением нежирных продуктов, которые способствуют снижению риска развития депрессии согласно имеющимся данным [16]. Также потребление жареных продуктов отрицательно коррелировало с Fusicatenibacter saccharivorans, наличие которых характерно для здоровых людей. Как пример можно привести отрицательную корреляцию между потреблением отдельных «нездоровых» продуктов (например, как в нашем исследовании, бульонные кубики) с полезными микроорганизмами. Это косвенно подтверждает данные о том, что принятый «здоровый рацион» питания не способствует появлению связанной с депрессией микробиоты и депрессивному состоянию. Снижение представленности бактерий Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia faecis, Roseburia, которые относятся к полезным микроорганизмам, у пациентов с депрессией коррелирует с питанием. Наиболее сильная отрицательная корреляция (r>0,66) обнаружена с ветчиной и жареной рыбой, эти продукты тоже принято относить к «нездоровому питанию».

Еще одним возможным объяснением полученных в нашем исследовании результатов является то, что пациенты с депрессией, в отличие от здоровых добровольцев, получают терапию антидепрессантами. В исследовании M. Rogers и соавт. [17] была выявлена связь между Clostridium difficile и приемом антидепрессантов.

Мы не обнаружили корреляции выявленных бактерий с употреблением фруктов, мяса и сладостей, хотя многие исследователи говорят о том, что потребление мяса и сладостей ассоциировано с депрессией. Метаанализ показывает, что потребление мяса может быть связано с умеренно повышенным риском депрессии. Однако из-за ограниченного количества проспективных исследований необходимо провести дополнительные исследования для подтверждения этих выводов [18]. G. Grases и соавт. [19] в своей работе показали, что здоровые люди потребляли больше бобовых, фруктов и овощей, но меньше сладостей и выпечки, чем люди с депрессией. Ни с одним из этих параметров найденные нами микроорганизмы связаны не были.

Связь кишечной микробиоты и ЦНС неоднозначна и до конца не ясна. При различных нервно-психических заболеваниях меняется состав кишечной микробиоты. До сих пор нет четкого понимания, является ли изменение кишечной микробиоты симптомом психического заболевания или же это связано с одним из звеньев его патогенеза. Микробиом может изменяться под воздействием факторов окружающей среды. Определяющими факторами являются стресс и особенности питания (диета). В то же время микробиом может потенциально влиять на физиологические процессы в организме человека, и изменения микробиома при помощи диеты является перспективным инструментом для коррекции связанных с ней патологических состояний [20]. Некоторые исследователи считают, что применение персонализированного питания как части персонализированной медицины может быть полезно для выявления ключевых особенностей микробиома, что позволит предсказать индивидуальную реакцию на определенные пищевые компоненты и затем может послужить основой для разработки диеты, которая будет способствовать успешной терапии и профилактике заболеваний [20].

Стресс и депрессия могут изменять вкусовые предпочтения. Десятилетнее лонгитюдное исследование во Франции показало ассоциацию между распространенностью депрессии и плохим питанием и обнаружило, что, вероятно, существует обратная причинно-следственная связь, при которой депрессия повышает риск нарушений пищевого поведения [21]. Многие корреляционные исследования среди здоровых взрослых людей показали, что депрессия встречается реже у тех, кто питается в соответствии со «здоровым» режимом питания. Однако не все исследования показывают наличие такой связи [8]. Дополнительным свидетельством взаимосвязи особенностей диеты и депрессии является то, что для пациентов с депрессией характерен дефицит некоторых витаминов и микроэлементов [22, 23]. Эти микроэлементы оказывают влияние на продукцию и активность моноаминовых нейромедиаторов, таких как серотонин, изменения в системе гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, глутаматергическую сигнализацию, воспалительный и окислительный стресс, и через эти пути могут влиять на риск развития депрессивных расстройств. Известно, что диета с высоким содержанием фруктов и овощей содержит большее количество этих микроэлементов [8] и предположительно может способствовать снижению риска развития депрессивных расстройств. В целом выделяют пять рекомендаций для питания, которые способствуют предотвращению депрессии: 1) придерживаться «традиционных» моделей питания, таких как средиземноморская, норвежская или японская диета; 2) увеличить потребление фруктов, овощей, бобовых, цельнозерновых круп, орехов и семян; 3) включить большое количество продуктов, богатых омега-3 полиненасыщенными жирными кислотами; 4) заменить «нездоровую» пищу полезными питательными продуктами; 5) ограничить потребление переработанных продуктов, «быстрой» пищи, промышленных хлебобулочных изделий и сладостей [24].

Лимитирующим фактором нашего исследования в первую очередь является небольшая выборка пациентов. По этой причине не учтена и терапия антидепрессантами, которая тоже может влиять на состав микробиоты. Однако, несмотря на это, нам удалось выявить связь некоторых микроорганизмов с депрессией. Также мы обнаружили связь с питанием и подтвердили данные других авторов о том, что нежирная пища и «здоровое питание» могут влиять на риск развития депрессии.

Заключение

Наше исследование выявило группы микроорганизмов, которые отличаются у здоровых добровольцев и пациентов с депрессией. Бактерии Erysipelatoclostridium и Clostridium innocuum больше характерны для пациентов с депрессией. Fusicatenibacter saccharivorans, Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia faecis встречались в группе здоровых добровольцев. Также мы обнаружили связь данных микроорганизмов с диетой и частично подтвердили влияние «здорового питания» на развитие депрессивных расстройств.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда 20-14-00132.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.