Делеционный полиморфизм GSTT1 и гиперактивация процессов липопероксидации при инсомнии климактерического периода

Научная и практическая значимость исследований, посвященных изучению различных аспектов нарушений сна, определяется их широкой распространенностью среди населения, особенно у женщин при наступлении климактерия, достигая >60% в данном возрастном периоде [1, 2]. Наиболее частыми нарушениями сна у лиц женского пола являются инсомнические расстройства, коморбидность которых с другими патологическими состояниями, такими как сердечно-сосудистые заболевания [3], сахарный диабет [4], онкология [5], ожирение [6], депрессия [7], значительно снижает качество жизни женщин. В настоящее время многочисленные исследования направлены на изучение клеточных и молекулярных механизмов регуляции процессов сна [8]. При этом пристальное внимание уделяется изучению процессов свободнорадикального окисления при сомнологической патологии. Результаты таких исследований демонстрируют аккумуляцию активных продуктов тиобарбитуровой кислоты у женщин с инсомнией в постменопаузе [9—11], но не в перименопаузальном периоде [9]. Более того, активность системы перекисное окисление липидов—антиоксидантная защита (ПОЛ—АОЗ) у таких пациенток ассоциирована с полиморфизмом 3111Т/С гена Clock [12]. В то же время данные о работе системы АОЗ представляются неоднозначными. Известно, что наиболее мощным путем детоксикации альдегидов является их ферментативное связывание с глутатионом в глутатионтрансферазной реакции. В свою очередь активность глутатионтрансферазы зависит от полиморфизма генов системы детоксикации, одним из которых является ген GSTT1, кодирующий аминокислотную последовательность фермента тета-1 глутатион S-трансферазы [13].

Целью данной работы явилось исследование по изучению ассоциации активности системы липопероксидация—антиоксиданты с полиморфизмом гена GSTT1 при инсомнических расстройствах.

В исследовании приняла участие 181 женщина климактерического периода в возрасте от 45 до 60 лет (европеоидная раса, русские). Группы климактерического периода формировались согласно клиническим рекомендациям российского общества акушеров-гинекологов и российской ассоциации по менопаузе [14].

Критериями невключения были заболевания эндокринного генеза, ожирение, обострение хронических заболеваний, применение заместительной гормональной терапии, преждевременная ранняя менопауза, хирургическая менопауза, наличие хронических нарушений сна в анамнезе, применение гипнотиков в течение последних 2 нед, «вечерний» хронотип, работа по сменам, синдром обструктивного апноэ сна.

Результаты клинико-анамнестического обследования позволили разделить обследуемых на две группы: основную (с инсомнией, n=120, средний возраст 53,68±4,61 года, индекс массы тела 26,47±3,73 кг/м²) и контрольную (без инсомнии, n=61, средний возраст 52,64±4,91 года, индекс массы тела 27,69±3,11 кг/м²). Основная группа (с инсомнией) была сформирована согласно клиническим рекомендациям по диагностике и лечению хронической инсомнии у взрослых [15], а также на основе анкетирования [16].

Программа обследования женщин включала следующие методы: клинико-анамнестический (анкетирование, общеклиническое обследование, гинекологическое обследование), молекулярно-генетические, статистические.

Наличие нарушений сна определяли с помощью анкетирования с использованием теста для оценки субъективной тяжести инсомнии (Insomnia Severity Index, ISI) [16]. Для определения хронотипа использовали Мюнхенский тест (Munich Chronotype Questionnaire, MCTQ) [17]. Для верификации диагноза синдрома обструктивного апноэ сна у женщин с жалобами на храп проводилось полисомнографическое исследование по стандартной методике с использованием системы GRASS-TELEFACTOR Twin PSG (Comet) с усилителем As 40 с интегрированным модулем для сна SPM-1 (USA).

Участникам исследования проведено генотипирование гена GSTT1 с определением наличия («0/0» — полная делеция) или отсутствия («+/+» — нормальная аллель гена) делеции. Материалом для исследования служили образцы цельной венозной крови, забор которой производился из локтевой вены в пробирки с антикоагулянтом ЭДТА-К3. В дальнейшем из образцов крови осуществляли экстракцию геномной ДНК с использованием комплекта реагентов АмплиПрайм ДНК-сорб-В (ООО «НекстБио», Россия). Исследование I/D (инсерция/делеция) полиморфного маркера проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции в автоматическом термоциклере Терцик наборами реагентов, производитель ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (Россия). Детекцию продуктов амплификации осуществляли в 3% агарозном геле, результаты электрофореза регистрировали и документировали с помощью системы компьютерного гельдокументирования GelDoc.

Забор крови для определения биохимических параметров осуществляли из локтевой вены в раннее утреннее время натощак. Субстратное обеспечение процессов ПОЛ и содержание их продуктов, а также компонентов системы АОЗ определяли согласно стандартным методикам [9]. Измерительными приборами служили спектрофотометр Shimadzu RF-1650 (Япония) и спектрофлюорофотометр Shimadzu RF-1501 (Япония).

Исследование соответствует этическим нормам Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964 г., последний пересмотр Форталеза, Бразилия, 2013 г.). Каждая женщина подписала информированное согласие на участие в проводимом исследовании, протокол которого был одобрен Комитетом по биомедицинской этике ФГБНУ НЦ ПЗСРЧ (протокол №8 от 15.12.16).

Полученные данные обрабатывали в программе Statistica 6.1 («Stat-Soft Inc.», США). Распределение показателей в группах не соответствовало нормальному. Данные представлены в виде среднего арифметического (стандартное отклонение) (M (SD)) и медианы (первый квартиль; третий квартиль) (Me (Q1; Q3)). Статистически значимыми (p<0,05) различия между группами считались при наличии различий не менее 2 из 3 критериев — тест Манна—Уитни, тест Уалда—Вольфовица и тест Колмогорова—Смирнова.

Результаты сравнительного анализа частот генотипов гена GSTT1 у женщин с инсомническими расстройствами и без таковых представлены в табл. 1. В обеих исследуемых группах частота делеционного генотипа значимо ниже по сравнению с нормальным генотипом. Полученные данные согласуются с результатами исследований по распространенности генотипов гена GSTT1 в общей популяции [18]. При сравнении контроля и основной группы выявлена меньшая частота делеционного генотипа у пациенток с инсомнией (p=0,026).

Таблица 1. Частота генотипов гена GSTT1 в исследуемых группах

Результаты исследования активности системы липопероксидация — антиоксиданты представлены в табл. 2. У женщин контрольной группы — носителей делеционного генотипа — выявлено более низкое содержание субстратов для процессов ПОЛ (p=0,031) и их первичных продуктов (p=0,042) в сыворотке крови. При сравнении данных пациенток с инсомническими расстройствами обнаружено более высокое содержание вторичных продуктов ПОЛ (p=0,044) и активных продуктов тиобарбитуровой кислоты (p=0,003), а также более низкое содержание ретинола (p=0,027) и α-токоферола (p=0,040) у носителей делеционного генотипа.

Таблица 2. Параметры системы ПОЛ—АОЗ у женщин климактерического периода в зависимости от генотипа GSTT1

Примечание. p — статистически значимые различия между группами (при наличии различий не менее 2 из 3 критериев — тест Манна—Уитни, тест Уалда—Вольфовица и тест Колмогорова—Смирнова.

Note. p — statistically significant differences between groups (if there are differences of at least 2 of 3 criteria — Mann—Whitney test, Wald's test — Wolfowitz and Kolmogorov—Smirnov.

Сравнительный анализ параметров системы ПОЛ—АОЗ у женщин основной и контрольной групп показал у женщин с инсомнией — носителей нормального генотипа — более высокие показатели диеновых конъюгатов (p=0,039) при более низкой активности глутатионпероксидазы (p=0,045) по сравнению с женщинами группы контроля. При сравнении групп женщин — носителей делеционного генотипа отмечено статистически значимое повышение содержания субстратов и продуктов ПОЛ на всех этапах липопероксидации, окисленного глутатиона (p=0,039), активности глутатион-S-трансферазы (p=0,044) при снижении содержания восстановленного глутатиона (p=0,042) и ретинола (p=0,038) в группе женщин с инсомнией.

Предположение об аккумуляции в организме свободных радикалов во время бодрствования и их инактивации во время сна было впервые высказано E. Reimund [19] в 1994 г. Согласно данной гипотезе, сон способствует снижению скорости образования свободных радикалов с одновременным повышением эффективности работы системы АОЗ. С тех пор исследователями из разных стран были предприняты многочисленные попытки для подтверждения или опровержения данной гипотезы. К настоящему времени как в эксперименте, так и в исследованиях на человеке получены неоднозначные результаты. Так, результаты некоторых исследований на животных моделях демонстрируют зависимость интенсивности свободнорадикального окисления от времени депривации сна [20—22], однако встречаются работы, не подтверждающие это [23].

Неоднозначность имеющихся в литературе результатов научных работ по изучению свободнорадикального окисления у пациентов с инсомнией определяется объединением как мужчин, так и женщин в основную группу, хотя влияние пола на процессы липопероксидации не вызывают сомнений [24]. В связи с этим продемонстрированное при инсомнии понижение общего антиоксидантного статуса и повышение оксидантного звена представляются сомнительными [25]. В то же время в группах женщин с инсомнией показано снижение активности ферментативного звена глутатионовой системы при неизменной активности миелопероксидазы и супероксиддисмутазы с повышением уровня глутатиона и конечных продуктов липопероксидации [10], а в постменопаузе — повышение уровня активных продуктов тиобарбитуровой кислоты при отсутствии изменений активности каталазы и супероксиддисмутазы [11]. В проведенном нами ранее исследовании было показано, что у пациенток в перименопаузе происходит аккумуляция первичных продуктов, а в постменопаузе — первичных и конечных продуктов липопероксидации без изменений параметров системы АОЗ [9]. Отсутствие однонаправленного результата по изучению функционального состояния системы ПОЛ—АОЗ у пациеток с инсомнией свидетельствует о необходимости поиска механизмов, влияющих на течение свободнорадикальных процессов. Одним из таких механизмов может быть полиморфизм гена GSTT1, кодирующий белок глутатион-S-трансферазу тета 1, являющийся членом суперсемейства димерных белков. Глутатион-S-трансфераза катализирует реакции связывания глутатиона с токсинами, в результате чего образуются менее токсичные и легковыводящиеся из организма конъюгаты [13]. Полученные в ходе данного исследования результаты свидетельствуют о влиянии носительства того или иного полиморфизма гена GSTT1 на функциональное состояние системы ПОЛ—АОЗ при инсомнии. Так, у женщин с инсомнией по сравнению с контролем аккумуляция продуктов на всех этапах липопероксидации отмечается при носительстве делеционного полиморфизма гена GSTT1 с одновременным дисбалансом в работе глутатионовой системы. Повышение активности глутатион-S-трансферазы, связанное, вероятно, с другими полиморфизмами генов системы детоксикации, может быть реакцией на высокое содержание образующихся продуктов ПОЛ вследствие нехватки антиоксидантов, таких как ретинол. В данном случае фермент катализирует связывание токсичных продуктов с глутатионом, что приводит к снижению содержания его восстановленной формы и повышению концентрации окисленной. Однако накопление конечных продуктов липопероксидации свидетельствует о недостаточности ресурсов системы АОЗ и в первую очередь содержания глутатиона. Носительство функционального полиморфизма гена GSTT1 у пациенток по сравнению с контролем приводит к накоплению только первичных продуктов липопероксидации, не приводя к развитию окислительного стресса. Наравне с этим результаты настоящего исследования демонстрируют накопление продуктов ПОЛ, в том числе конечных, у пациенток — носителей делеционного полиморфизма гена GSTT1 по сравнению с пациентками — носителями функционального полиморфизма.

Полученные в ходе проведенного исследования результаты при сравнении как основной группы с контролем, так и пациенток в зависимости от носительства того или иного полиморфизма гена GSTT1 свидетельствуют об ассоциации делеционного полиморфизма с интенсификацией процессов липопероксидации у женщин климактерического периода с инсомническими расстройствами. Данные результаты свидетельствуют о необходимости персонализированного подхода в назначении антиоксидантной терапии при проведении коррекционных мероприятий по поводу нарушений сна.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.