Черепно-мозговая травма (ЧМТ) остается одной из основных причин возникновения тяжелых неврологических и психических расстройств, требующих длительного лечения и реабилитации. Ежегодно в России за медицинской помощью обращаются более 250 тыс. детей с ЧМТ, госпитализируются более 100 тыс., становятся инвалидами около 5 тыс. За 10 лет (2003—2012 гг.) травму головы получили более 2,5 млн детей, погибли более 18 тыс., инвалидами стали более 50 тыс. [1, 2].

Исход пациентов с ЧМТ — полное или частичное выздоровление, инвалидизация разной степени тяжести или летальность — зависит от совокупности медико-социальных факторов, включающих своевременную госпитализацию, адекватную ургентную терапию, патофизиологические особенности протекания раннего посттравматического периода, развитие вторичных повреждений мозга [1—3].

Несмотря на достижения в области изучения патофизиологии и лечения ЧМТ, различия в исходах не всегда поддаются объяснениям, а тяжесть перенесенной ЧМТ является не единственным критерием последующего состояния пациента. Ранее неоднократно предпринимались попытки оценить связь исходов и отдаленных последствий ЧМТ с полиморфизмами гена аполипопротеина Е (APOE) [4—12]. Анализ данных литературы свидетельствует, что из 3 аллелей гена APOΕ (ε2, ε3, ε4) лишь присутствие аллеля ε4 (APOΕ-epsilon4, APOΕ4) связывают с повышенным риском таких неврологических заболеваний, как семейная спорадическая болезнь Альцгеймера [13], ишемический инсульт [14], амилоидная ангиопатия и связанная с вирусом иммунодефицита человека деменция [15]. Однако единства мнений по вопросу связи аллеля APOΕ4 и исходов ЧМТ не существует. Так, некоторые авторы [7—9] выявили связь неблагоприятных исходов ЧМТ с присутствием ε4-аллеля в гене APOΕ. Другие исследователи [10—12], напротив, показали отсутствие связи между полиморфизмом APOΕ4 и восстановлением пациентов, перенесших ЧМТ разной степени тяжести. В исследованиях с проведением метаанализа (n=2427) [6] и по совокупности результатов работ независимых исследователей была установлена связь полиморфизма APOΕ4 и плохого клинического восстановления в отдаленном периоде (через 3—6 мес) после ЧМТ [16]. Замедленное восстановление утраченных психоневрологических функций у пациентов, перенесших тяжелую ЧМТ с различными аллелями APOΕ4, показано в работе S. Alexander и соавт. [17]. В исследовании R. Diaz-Arrastia и соавт. [18] была выявлена связь наличия ε4 аллеля с повышенным риском посттравматических эпилептических приступов. Таким образом, вопрос о неблагоприятном течении посттравматического периода у пациентов с аллельным вариантом APOΕ4 постоянно обсуждается в литературе и до сих пор остается открытым.

В последнее время течение и исход ЧМТ в значительной степени связывают с нарушением функции астроцитов, развитием астроглиоза [19]. Астроциты являются основным источником белка APOΕ, который в свою очередь играет важную роль в функционировании гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [20]. Дисфункция астроцитов, приводящая к потере их контроля над процессом воспаления, также может быть обусловлена генетическим полиморфизмом [19]. При достаточно большом количестве работ, посвященных изучению связи исходов ЧМТ с наличием аллеля ε4 гена APOΕ, нам не удалось найти исследований, в которых проводилось бы сопоставление различных аллелей гена APOΕ с маркерами повреждения мозга. В то же время для разных исходов тяжелой ЧМТ в раннем посттравматическом периоде ранее нами были выявлены определенная динамика и прогностическая значимость содержания в крови таких нейромаркеров, как белок S100b, нейронспецифическая енолаза (NSE), аутоантитела (аАТ) к рецепторам глутамата, аАТ к белку S100b и мозговой нейротрофический фактор (BDNF) [21—24]. Сопоставление данных о содержании в крови биохимических маркеров, способных отражать степень повреждения мозга в отдаленном посттравматическом периоде, с данными генотипирования APOΕ может значительно расширить наши представления о патогенезе ЧМТ и способствовать улучшению прогнозирования исходов ЧМТ у детей.

Цель работы — сопоставление генотипов APOΕ с исходами заболевания и уровнем нейромаркеров у детей с тяжелой ЧМТ.

Материал и методы

Обследовали 69 детей (49 мальчиков и 20 девочек в возрасте от 6 до 15 лет) с ЧМТ, госпитализированных в НИИ неотложной детской травматологии и хирургии Департамента здравоохранения Москвы в период с 2011 по 2014 г. Все дети получили тяжелую ЧМТ (ТЧМТ). Оценка состояния по шкале комы Глазго (ШКГ) составила <9 баллов. Согласно исходам ЧМТ по шкале исходов Глазго (ШИГ), все пациенты были разделены на группы: вегетативное состояние (ШИГ 2); тяжелая инвалидизация (ШИГ 3); легкая инвалидизация (ШИГ 4) и полное восстановление (ШИГ 5). Дети с летальным исходом после ТЧМТ (ШИГ 1) в течение 1-го месяца были исключены из исследований. У всех детей было проведено генотипирование APOΕ и определено содержание таких маркеров повреждения/репарации мозга, как NSE, глиальный белок S100b, содержание аАТ к рецепторам глутамата (к NR2-субъединице NMDA-рецепторов), аАТ к S100b, а также BDNF.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов венозной крови проводили с помощью коммерческого набора AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep (Kit, USA). Полиморфизм гена APOΕ определяли с помощью стандартной полимеразной цепной реакции с последующей идентификацией генотипа методом учета полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. Визуализацию результатов рестрикции осуществляли методом электрофореза в полиакриламидном геле. В работе использованы праймеры и система рестрикции, разработанные M. Kamboh и соавт. [25], C. Aslanidis и G. Schmitz [26].

Все биохимические показатели определяли в сыворотке крови в отдаленном периоде после ЧМТ, не ранее чем через 3 мес после травмы, для чего проводили повторную госпитализацию. Определение нейромаркеров в отдаленном периоде объяснялось тем, что в наших предыдущих работах было показано, что в раннем посттравматическом периоде (1-я неделя и особенно первые 3 дня) уровень большинства нейромаркеров претерпевает большие изменения (повышение концентрации S100b и NSE), однако не полностью отражает тяжесть перенесенной травмы мозга [21, 22]. Концентрацию NSE и S100b белка и BDNF определяли в сыворотке крови иммуноферментными методами с помощью наборов фирм «CanAg» (Швеция) и «R&D Systems» (США). В качестве нормальных величин использовали данные компаний-разработчиков и наши собственные, полученные при обследовании детей без неврологической патологии и патологии внутренних органов. Верхней границей нормальных величин для NSE считали величину, равную 13 мкг/л, для S100B — 90 нг/л cыворотки крови. В связи с большим разбросом величин BDNF в сыворотке крови проводили сравнение со значениями BDNF, находящимися в пределах 6,18 (минимум) — 42,58 (максимум) нг/мл. Содержание аАТ к белку S100b оценивали иммуноферментным методом, разработанным нами совместно с «ООО Герофарм» (Россия) [24]. В качестве сорбента аАТ к S100b был использован химически модифицированный пептид, являющийся фрагментом человеческого белка S100b. В качестве физиологической нормы использовали величины контрольных образцов («пулированный контроль», приготовленный из сыворотки крови здоровых людей). Содержание аАТ к S100b выражали в единицах оптической плотности (Е.О.П.) при λ=450 нм и рассчитывали в процентах от контрольных величин, принимаемых за 100%, при этом верхней границей нормы считали величину более 150%. Уровень аАТ к субъединице NR2A NMDA-рецепторов глутамата определяли с помощью метода, разработанного С.А. Дамбиновой и соавт. [27, 28], с использованием наборов фирмы «Gold Dot» (США) и выражали в нг/мл. Этот метод основан на иммуноферментном определении сорбированных антител на глутаматсвязывающих мембранных белках или синтетических пептидах, идентичных по аминокислотному составу N-концевым участкам NR2А-cубъединицы рецепторов глутамата. Верхней границей нормы считали величины, равные 2,0 нг/мл сыворотки крови.

Статистическая оценка полученных результатов проведена с помощью программ Statistica v.6 StatSoft Inc. и Excel Microsoft Corp. Проверка на соответствие нормальному закону распределения количественных данных проведена с помощью тестов Колмогорова—Смирнова и Лиллиефорса. В работе определены коэффициенты корреляции (коэффициент Гамма непараметрической статистики), проведены дисперсионный непараметрический анализ Краскела—Уоллиса Anova Ranks и анализ сочетанных признаков по критериям χ² и точному критерию Фишера. Статистически достоверными различиями величин считали результаты при p<0,05. Значения статистически значимых коэффициентов соотносили со шкалой Чеддока.

Результаты и обсуждение

У обследованных детей с тяжелой ЧМТ распределение полиморфизмов APOΕ и по ШИГ представлено на рисунке. Распределение идентифицированных генотипов APOΕ у обследованных детей с ЧМТ в целом соответствовало приводимым в литературе данным о встречаемости вариантов гена APOΕ в популяции взрослых людей [29]. В нашей выборке второе место по частоте встречаемости заняли дети с генотипом APOΕ 3/2, а третье место — с генотипом APOΕ 3/4. Группа с генотипом APOΕ 4/2 была исключена из исследования, так как включала 1 пациента.

Анализ числа пациентов по исходам показал, что наиболее многочисленными группами среди детей с ТЧМТ были ШИГ 3, 5 и 4.

Распределение исходов по генотипам и связь генотипов с исходами представлена в табл. 1. Для получения статистически надежных оценок мы провели объединение групп пациентов с ШИГ 2 и 3 в группу с неблагоприятным исходом и пациентов с ШИГ 4 и 5 — с благоприятным. При всех генотипах распределение между благоприятными и неблагоприятными исходами было практически одинаковым. Однако в группе детей с APOΕ 3/3 благоприятных исходов было на 20% больше, чем неблагоприятных. В группах с генотипами APOΕ 3/4 и APOΕ 3/2 распределение исходов было 50% на 50%. В исследованной выборке пациентов с ТЧМТ не выявлено корреляции между полиморфизмами гена APOΕ и исходами ЧМТ.

Примечание. Корреляцию считали значимой при p<0,05; n — число пациентов.

Анализ представленных в табл. 2 данных показывает, что достоверных различий в содержании нейромаркеров в отдаленном периоде у обследованных детей всех 3 генотипов APOΕ обнаружено не было. Можно лишь отметить тенденцию к повышению содержания белка S100b и NSE у детей с APOΕ 3/4 и снижению уровня BDNF у пациентов с APOΕ 3/2. Однако содержание аАТ к белку S100b и NR2-субъединице NMDA-рецепторов глутамата существенно превышало верхние границы нормы у пациентов всех 3 генотипов.

Примечание. Здесь и в табл. 4, 5: жирным шрифтом выделены значения, превышающие границы нормы. Здесь и в табл. 3: данные представлены в М±м (среднее значение ± ошибка среднего значения).

Сопоставление содержания нейромаркеров у пациентов с благоприятным и неблагоприятным исходами показало, что при неблагоприятных исходах содержание аАТ к S100b в 2,4 раза выше, чем при благоприятных (табл. 3).

Примечание. Жирным шрифтом выделены значения, превышающие границы нормы; * — статистически значимое различие, p<0,05.

Мы сочли необходимым представить индивидуальные данные по маркерам для двух малочисленных групп с генотипами APOΕ 3/4 и APOΕ 3/2 (табл. 4 и 5). Целесообразность индивидуального представления данных основывалась на известных фактах о «защитном» характере аллеля ε2 и представленных выше многочисленных данных о «негативном» характере аллеля ε4 [30].

Гетерозиготный вариант APOΕ 3/4, представленный одним аллелем ε3 и одним аллелем ε4, был найден у 11,6% пациентов. У этих детей, помимо повышения содержания в сыворотке крови аАТ к S100b и аАТ к NR2-субъединице NMDA-рецепторов глутамата, отмечено небольшое повышение содержания маркеров повреждения мозга — S100b и NSE (см. табл. 4).

Анализируя индивидуальные данные детей с APOΕ 3/4, следует отметить, что в этой группе отмечено наибольшее число пациентов с повышенным содержанием S100b и NSE. При различных исходах ЧМТ у всех детей отмечены отличные от нормы значения для разных показателей. Так, у пациента №1 при наиболее благоприятном исходе (ШИГ 5) значительно увеличено содержание NSE, имели место высокий уровень аАТ к S100b и достаточно низкое содержание BDNF. У пациента №3 с минимальной инвалидизацией (ШИГ 4) при нормальных показателях большинства нейромаркеров обнаружен минимальный уровень BDNF. В то же время у ребенка №8 с наиболее неблагоприятным исходом (ШИГ 2) получены практически нормальные значения для S100b и NSE на фоне наиболее низкого содержания BDNF и высокого уровеня аАТ к S100b. Аналогично группе с генотипом APOΕ 3/3 практически у всех детей с генотипом APOΕ 3/4 отмечено увеличение уровня аАТ к S100b и аАТ к NR2-субъединице NMDA-рецепторам глутамата.

У 14,5% детей с ЧМТ найден наиболее редкий тип гетерозиготного генотипа APOΕ, представленный одним аллелем ε3 и одним аллелем ε2. Индивидуальные данные у детей с генотипом APOΕ 3/2 представлены в табл. 5.

Средние значения показателей нейромаркеров в этой группе напоминали таковые в группе детей с генотипом APOΕ 3/3. Уровни NSE и S100b у 4 из 5 детей с благоприятными исходами (ШИГ 5 и 4) не превышали нормальных границ. В то же время уровень BDNF у 4 детей с ШИГ 5 и 4 был наиболее низким (№№2, 3, 4, 5). Низкий уровень содержания BDNF обнаруживали также у детей с этим генотипом APOΕ при неблагоприятных исходах (ШИГ 3 и 2) — №№6, 7, 10. У всех детей наблюдали повышенный уровень аАТ к субъединице NMDA-рецептора глутамата, и у 60% детей с APOΕ 2/3 отмечено увеличение аАТ к S100b. Анализ показателей содержания нейромаркеров крови детей с генотипом APOΕ 3/2 показывает, что превышение нормального уровня основных маркеров повреждения — NSE и S100b — наблюдается у меньшего числа пациентов, чем в группе с генотипом APOΕ 3/4. Однако в этой группе у 7 из 10 детей обнаружен низкий уровень BDNF. Представленные данные демонстрируют гетерогенность практически по всем показателям внутри групп с редкими генотипами.

В табл. 6 представлены результаты вычисления корреляционных коэффициентов, позволяющие оценить достоверность взаимосвязи уровня нейромаркеров, генотипов APOΕ и исходов ТЧМТ.

Анализ представленных в табл. 6 данных показывает, что достоверная корреляция с генотипами характерна только для BDNF, при этом абсолютные значения для достоверных γ-коэффициентов расцениваются по шкале Чеддока как умеренные и слабые. Положительная корреляция между уровнем BDNF и характером исхода означает, что для благоприятных исходов ЧМТ характерен его нормальный уровень, а для неблагоприятных — преимущественно низкий уровень. Именно низкий уровень BDNF характерен для детей с генотипом APOΕ 3/2, при этом пациенты с распространенным генотипом 3/3 имеют более высокий, нормальный уровень BDNF. Низкий уровень BDNF коррелирует с высоким уровнем аАТ к S100b, при этом уровень аАТ к S100b положительно коррелирует с содержанием аАТ к NR2-показателях рецептора глутамата.

Примечание. *— достоверная корреляция при p<0,05.

Травматическое повреждение мозга имеет множество причин и различные по тяжести отдаленные последствия [31], выражающиеся в расстройствах поведения, развитии эпилептических приступов и очагового неврологического дефицита [32]. ЧМТ причисляют к заболеваниям, при которых происходит быстрое развитие нейродегенерации. Наличие в анамнезе ЧМТ считается фактором риска для развития болезни Альцгеймера [33]. Установлено, что после ЧМТ у человека имеет место характерное для болезни Альцгеймера накопление амилоида (А_β) [34]. Амилоидные бляшки обнаруживают у 30% пациентов с ЧМТ, и, что особенно важно, развитие подобной амилоидной бляшки происходит достаточно рано, в течение 3 ч после травмы мозга [35, 36].

В последние десятилетия в литературе периодически обсуждается роль особенностей гена, кодирующего регуляторные аполипопротеины Е (APOΕ), в отрицательных исходах ЧМТ [4—12]. Полиморфные формы АPOЕ различаются между собой аминокислотными остатками, что влияет на сродство изоформ APOΕ к их рецепторам. Изоформы APOΕ (Е2, Е3, Е4) оказывают разное влияние на обмен липидов и обладают разной антиоксидантной активностью [30]. Однако роль APOΕ не ограничивается только участием в обмене липидов, изоформы этого белка оказывают различное влияние на уровень внутриклеточного Са²⁺ и выживаемость нейронов при травме мозга [37]. Представленный в мозге преимущественно в астроцитах (именно в астроцитах осуществляется синтез холестерола в мозге), APOΕ обнаруживается в количестве, в 100—200 раз превышающем норму, в участках повреждения нервного ствола, что может быть связано с его участием в регенерации поврежденных периферических нервов [38]. Известно также, что APOΕ защищает астроциты при гипоксии и глутамат-индуцированной нейротоксичности [39]. Показано, что изоформа ε2 обладает наиболее выраженными антиоксидантными свойствами, в то время как минимальной активностью обладает изоформа ε4 [40]. В экспериментах на животных было показано, что наличие ε4 в значительно большей степени увеличивает Са²⁺ в нейронах, что способствует развитию апоптоза нейронов [37]. Имеются данные о важной роли APOΕ в поддержании стабильности функционирования ГЭБ, что существенно влияет на течение посттравматического периода [41—43]. Показано, что APOΕ играет протективную роль при аутоиммунном энцефаломиелите, поддерживая целостность ГЭБ, при этом полиморфизм гена APOΕ, а именно экспрессия APOΕ4, у мышей вызывает нарушение неврологического статуса и повреждение ГЭБ через активацию NF-kB/MMP-9 в перицитах [20, 44]. В эксперименте на мышах было также показано, что разные изоформы APOΕ оказывают различное действие на неврологические функции и целостность ГЭБ после ЧМТ. Ухудшение состояния пациентов с ЧМТ при наличии изоформы ε4 в значительной степени связано с нарушением структурной целостности ГЭБ, чему способствует активация NF-kB/MMP-9, поэтому воздействие на это звено является важным моментом при подборе препаратов для лечения последствий ЧМТ [44, 45].

В настоящей работе представлены результаты обследований детей с тяжелой ЧМТ, т.е. детей с ШКГ<9 баллов и преимущественно <8 баллов. Ранее нами было показано, что после ТЧМТ в первые дни отмечается высокий уровень нейромаркеров повреждения (S100b и NSE) и низкий уровень BDNF [21]. Однако динамика изменений сильно отличается при различных исходах по ШИГ. Высокие значения уровня S100b и NSE остаются повышенными к концу 1-й недели только для неблагоприятных исходов. Наиболее тяжелыми являются группы ШИГ 1, 2 и 3, менее тяжелыми — группы ШИГ 4 и 5.

Анализ полученных данных позволил сделать вывод о том, что в обследованной нами выборке детей с ТЧМТ связь особенностей генотипов гена APOΕ и исходов по ШИГ отсутствовала. Для наиболее распространенного генотипа APOΕ 3/3 были характерны преобладание благоприятных исходов и нормальный или повышенный уровень BDNF. Генотип APOΕ 3/4, хотя и не предопределяет неблагоприятные исходы, но у детей этой группы в отдаленном периоде после ЧМТ отмечается тенденция к увеличению содержания в крови S100b и NSE. Генотип APOΕ 3/2, как предполагалось по данным литературы [30, 40], не обладает «защитными» свойствами и не предопределяет благоприятные исходы, что может быть связано с низким уровнем BDNF в этой группе. Неблагоприятные исходы у детей всех генотипов с ТЧМТ наблюдали в случае низкого уровня BDNF и высокого содержания аАТ к белку S100b.

Объединяющим для всех генотипов APOΕ является факт, что у 95% детей с ТЧМТ в отдаленном периоде отмечено достоверное повышение аАТ к рецепторам глутамата и у большинства детей — повышение аАТ к S100b в крови, что коррелирует с повышением уровня аАТ к NR2-субъединице NMDA-рецептора глутамата. Мы связываем этот факт с наличием гипоксии мозга, активацией аутоиммунных процессов и повышением проницаемости ГЭБ у детей с ТЧМТ. В значительной степени развитию аутоиммунного ответа со стороны рецепторов глутамата и повышению проницаемости ГЭБ могут способствовать увеличение образования NO, интенсификация окислительных процессов и модификация тирозиновых остатков белков в ходе свободнорадикального нитрования тирозина диоксидом азота (NO₂) и образования нитротирозина, что показано в наших предыдущих исследованиях [23, 46]. Поскольку NO₂ является одним из самых активных свободнорадикальных соединений, способных окислять/повреждать практически все биохимические соединения, в том числе SH-группы и тирозиновые остатки белков, гуаниновые основания ДНК и ненасыщенные жирные кислоты (окисление осуществляется по двойным химическим связям между атомами углерода –С=С–), эти повреждения могут иметь отдаленные последствия и приводить к повреждению ГЭБ, а в дальнейшем служить причиной ранних инфарктов миокарда и инсультов мозга. В связи с этим требуются длительные (на протяжении всей жизни) наблюдения за пациентами с ЧМТ и проведение профилактических мероприятий.

Работа выполнена при поддержке Государственного задания Минздрава России АААА-А19-119012590190-6 травма.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.