Ген RELN, расположенный на хромосомном участке 7q22.1 и кодирующий белок внеклеточного матрикса рилин, рассматривается как один из важных факторов, модифицирующих риск и проявления шизофрении [1, 2]. Это объясняется ролью рилина в развитии нервной системы, в частности в процессах миграции и позиционировании нейронов в эмбриональном периоде. Кроме того, имеются данные о снижении уровня этого гликопротеина в аутопсийных образцах мозга больных шизофренией [1, 2]. При полногеномном анализе данных выявлена ассоциация однонуклеотидного полиморфизма rs7341475 (G>A), расположенного в четвертом интроне RELN, с риском шизофрении у женщин [3]. Связь данного полиморфизма с шизофренией была подтверждена в ряде исследований, в том числе и метаанализом данных [4—6]. Результаты работ, посвященных изучению модифицирующей роли rs7341475 и других полиморфных сайтов в гене RELN в отдельных проявлениях болезни, позволяют предположить, что полиморфизм RELN может влиять как на остроту симптомов, в первую очередь позитивных [4, 7], так и на выраженность когнитивных нарушений, наблюдаемых при шизофрении, особенно регуляторно-исполнительных функций, связанных с префронтальной корой [7—9]. Последнее согласуется с важнейшей ролью рилина в процессах кортикогенеза на самых ранних стадиях формирования мозга и в регуляции пластичности синапсов и дендритогенезе во взрослом мозге [1]. Полученные результаты, естественно, нуждаются в подтверждении и расширении.

Следует отметить, что механизмы, посредством которых rs7341475 может модифицировать риск и проявления шизофрении, пока не ясны, так как связи rs7341475 с экспрессией RELN не обнаружено [10]. В то же время показано, что экспрессия RELN зависит от уровня метилирования промотора гена [11, 12], т. е. от присоединения метильной группы к цитозину преимущественно в составе динуклеотидов цитозин-гуанин (CpG). На этом основании предполагается, что гиперметилирование в промоторе RELN, обусловливающее снижение транскрипции гена, может быть важным звеном в каскаде событий, ведущих от пренатального стресса к нарушениям развития нервной системы, особенно строения префронтальной коры, и далее к изменениям процессов обработки информации и манифестации шизофрении [13]. Однако результаты изучения у больных метилирования промотора RELN противоречивы [14]. Так, две работы, в которых оценивалась связь уровня метилирования в гене рилина с когнитивным дефицитом (на материале аутопсийных образцов мозга больных) [15] и симптомами, измеренными PANSS (на материале клеток крови) [12], дали отрицательные результаты. Но обе эти работы имеют существенные ограничения. В частности, в них анализировали метилирование всего нескольких CpG в гене рилина. Между тем имеющиеся данные показывают, что метилирование CpG, расположенных в промоторе рилина, не является равномерным [16], и нарушения метилирования, ведущие к формированию психических расстройств, могут заключаться в изменении паттерна метилирования проксимальных и дистальных участков промотора гена [17].

В настоящей работе было продолжено изучение роли структурного полиморфизма (rs7341475) и метилирования промотора гена рилина и его связи с проявлениями шизофрении. При этом были использованы данные, полученные нами с помощью метода SMRT-BS (single-molecule real-time bisulfate sequencing), об уровне метилирования 170 CpG сайтов, образующих CpG-островок, включающий промотор и первый экзон RELN (участок ДНК длиной 1465 пар нуклеотидов — п.н.).

Цель работы — выявление связи характеристик гена рилина с выраженностью симптоматики, измеренной с помощью шкалы позитивных и негативных синдромов (PANSS), и таким нейропсихологическим признаком, как семантическая вербальная беглость (ВБ).

Семантическая ВБ — это способность быстро называть слова из заданной семантической категории. Выполнение подобной задачи зависит от состояния регуляторно-исполнительных функций, структуры и объема ментального лексикона, а также скорости обработки информации. Нарушения семантической ВБ представляют собой одну из ключевых характеристик когнитивного дефицита при шизофрении и в существенной степени отражают общий уровень когнитивного функционирования пациента [18, 19].

Для исследования была использована база данных лаборатории клинической генетики Научного центра психического здоровья РАН.

В выборку генотипирования вошли 556 пациентов в возрасте от 16 до 65 лет c расстройствами шизофренического спектра (по МКБ-10 рубрика F2). Все они в период обследования находились на лечении в указанном центре или в Московской клинической психиатрической больнице № 1 им. Н.А. Алексеева. Включали только лиц европейского происхождения, для которых русский был родным языком.

Критериями невключения были коморбидные интеллектуальные нарушения, наличие наркотической или алкогольной зависимости, тяжелых нейроинфекционных заболеваний и последствий черепно-мозговой травмы (с потерей сознания более 5 мин) в анамнезе. В дополнение к перечисленным выше критериям включения и невключения при отборе испытуемых для исследования метилирования использовали ограничение по возрасту до 45 лет и информацию о курении, так как эти факторы оказывают значительное влияние на метилирование ДНК.

Оценка метилирования проведена у 35 человек из группы пациентов, сформированной ранее для изучения влияния эпигенетических модификаций на нейрокогниции с учетом методологических особенностей проведения подобных исследований [20].

Клинико-демографические характеристики обследованных представлены в табл. 1.

Всеми пациентами было подписано информированное согласие на получение от них биологического материала и психологическое тестирование. Проведение исследования одобрено этическим комитетом Научного центра психического здоровья.

Симптоматику оценивали с помощью пятифакторной модели PANSS. Модель включает в себя позитивный, негативный, когнитивный, депрессивный синдромы и синдром возбуждения. В настоящее время сделан ряд попыток определить оптимальную факторную структуру PANSS. В данном исследовании была использована модель L. White и соавт. [21]. При оценке семантической вербальной беглости пациента просили называть в течение минуты животных, а затем фрукты/ягоды. Показателем В.Б. служило суммарное количество верно названных слов, принадлежащих к заданным категориям [18].

ДНК выделяли из венозной крови или смыва из ротовой полости стандартными методами. Генотипирование проводили с использованием технологии биочипов, как описано ранее [5]. В настоящем исследовании анализировали генотипы по локусу rs7341475 RELN.

Определение статуса метилирования осуществляли с помощью модифицированного метода SMRT-BS на основе бисульфитной конверсии и высокопроизводительного секвенирования третьего поколения Pacbio [22]. Показатели доли метилирования CpG, расположенных на участках протяженностью около 100 п.н., были усреднены для каждого испытуемого, как описано нами ранее [23], что позволило сократить количество показателей метилирования со 170 до 12. Следует отметить, что уровень метилирования изученных CpG был низким и не различался между больными и здоровыми [23].

Оценку ассоциации rs7341475 с проявлениями шизофрении проводили методом построения общих линейных моделей (GLM). Использовали пакет Statistica 12.0. Тестировали 2 модели. Независимыми переменным в каждой из них служили генотип, пол и возраст, а также взаимодействие генотип—пол. При этом генотип GG кодировали как 2, а генотипы GA и AA как 1. В первой модели зависимыми переменными были баллы по каждому из пяти факторов PANSS, во второй модели — показатель В.Б. Предварительно зависимые переменные проверяли на соответствие нормальному распределению. Для оценки связи метилирования промотора RELN с симптомами сначала проводили редукцию показателей метилирования методом главных компонент. Затем использовали пошаговую множественную регрессию со значениями статистически значимых компонент, полом, возрастом, курением и взаимодействием пол—курение в качестве независимых переменных. Тестировали две регрессионные модели — для 5 факторов PANSS и для ВБ.

При сравнении мужчин и женщин по клиническим и демографическим факторам был обнаружен ряд различий. В группе генотипирования мужчины были младше женщин (t=9,74; p=0,000), имели меньшую длительность заболевания (t=4,80; p=0,000) и меньшую выраженность позитивного синдрома (t=3,20; p=0,001). В группе метилирования мужчины характеризовались большей выраженностью депрессивного синдрома (t=4,03; p=0,000) и синдрома возбуждения (t=2,40; p=0,022), а также снижением ВБ (t=2,36; p=0,024). Следует также отметить, что группы генотипирования и метилирования существенно различались по возрасту и выраженности разных синдромов (см. табл. 1), что объясняется отбором в группу метилирования более молодых пациентов, которые были способны заполнить батарею нейропсихологических тестов.

Частота генотипов по полиморфному сайту rs7341475 составила: GG — 377 человек (0,68), GA — 161 (0,29), AA — 18 (0,3), при частоте минорного аллеля A равной 0,18. Распределение генотипов соответствовало закону Харди—Вайнберга (X²=0,03, p>0,05), а также данным, полученным ранее для русской популяции Сибири [24].

GLM-анализ выявил значимый эффект взаимодействия пол—генотип на синдромы PANSS (F=2,70; p=0,020). Дальнейший унивариантный анализ показал, что этот эффект был значим для позитивного синдрома и синдрома возбуждения (табл. 2).

Для показателей метилирования было получено 5 главных компонент с собственными значениями >1 (табл. 3).

В результате проведенного исследования установлена значимая ассоциация между полиморфным сайтом rs7341475 в гене рилина и выраженностью позитивной симптоматики с протективным эффектом генотипа GG у мужчин. Наши данные перекликаются с результатами J. Wedenoja и соавт. [7], показавшими индивидуальное и аддитивное влияние ряда однонуклеотидных полиморфизмов в гене рилина на позитивный синдром. Гендерно-специфичный эффект RELN также был ожидаемым. Первоначально было показано, что генотип GG повышает риск заболевания шизофренией только у женщин [3]. Помимо шизофрении, связанный с полом эффект гена рилина найден также для риска развития биполярного расстройства [25] и болезни Альцгеймера [26]. Исследования, проведенные на мышах, показали, что выключение одного из генов рилина (гетерозиготность по гену рилина) влечет разные последствия для самцов и самок как на уровне биологических процессов, так и на уровне поведения, что может объясняться действием половых гормонов [27—29]. Наконец, при исследовании связи полиморфного сайта rs7341475 с симптоматикой больных шизофренией Y. Liu и соавт. [4] обнаружили номинально значимые ассоциации аллеля риска (G) с более высоким уровнем нарушений по фактору «детская социабельность» у мужчин и по фактору «галлюцинации» у женщин.

Полученные G. Ovadia и соавт. [10] результаты изучения влияния полиморфизма RELN на экспрессию гена и содержание различных изоформ рилина позволяют предположить, что генотип GG может иметь протективный эффект на проявления шизофрении у мужчин. В цитируемой работе, в отсутствие влияния rs7341475 на экспрессию гена, был обнаружен эффект взаимодействия генотипа и пола на содержание в префронтальной коре мозга изоформы рилина, характеризующейся пропуском микроэкзона длиной 6 п.н. В мозге женщин с генотипом риска по сайту rs7341475 (GG) содержание этой изоформы, характерной для ненейрональных тканей, было повышено с 14,6% при других генотипах до 16,4%. У мужчин наблюдалась противоположная тенденция: снижение с 22,6% при генотипах AA или GA до 15,8% при генотипе GG.

В настоящей работе не было выявлено ассоциации полиморфизма rs7341475 ни с когнитивным синдромом PANSS, ни с объективным показателем когнитивного функционирования — В.Б. Данные о связи гена рилина с когнициями вообще неоднозначны. Так, H. Tost и соавт. [30] не обнаружили влияния rs7341475 на активность мозга при выполнении задачи на вербальную рабочую память, а также на строение серого и белого вещества префронтальной коры и гиппокампа у лиц из общей популяции. В то же время в исследовании L. Greenbaum и соавт. [31] rs7341475 был ассоциирован с особенностями сенсорной фильтрации у здоровых. Следует отметить, что в большинстве работ, показавших ассоциации когниций с геном рилина, использовали другие полиморфные участки в этом гене [7—9, 32].

Таким образом, имеющиеся данные позволяют предположить, что направление влияния полиморфизма rs7341475 гена рилина на этиопатогенез шизофрении может зависеть от пола и конкретного эндофенотипа болезни. Следует обратить внимание также на роль этнической принадлежности. Так, последний метаанализ показал, что минорный аллель, А имеет протективный эффект в отношении риска развития заболевания только у европеоидов [6]. При этом в популяции русских из Сибирского региона не было найдено значимой ассоциации между rs7341475 и шизофренией [24]. А при изучении русских и татар Волжского региона ассоциация была выявлена только у татар. Причем частота аллеля G у больных параноидной шизофренией была снижена относительно контроля [5].

Второй результат нашей работы — обнаружение связи между уровнем метилирования 5’-области гена RELN и его промотора с нарушением В.Б. Ранее на большей выборке при изучении общего уровня когнитивного функционирования у больных шизофренией и здоровых мы обнаружили связь когнитивного снижения с метилированием одного из центральных участков промотора гена рилина, содержащего сайты связывания транскрипционных факторов [23]. В настоящей работе мы использовали лишь один из признаков когнитивного функционирования — ВБ, и выявили его корреляцию с общим паттерном метилирования: повышением доли метилирования 5’-области гена и снижением доли метилирования удаленных от сайта инициации транскрипции участков промотора. Интересно отметить, что при исследовании аутопсийных образцов мозга больных аутизмом и здоровых постпубертатного возраста C. Lintas и соавт. [17] обнаружили, что для последних характерен более высокий уровень метилирования CpG, расположенных вблизи сайта инициации транскрипции (от –222 до +1 п.н.) RELN, в то время как для больных — удаленных CpG (от –458 до –223 п.н.). Более того, самый дальний из изученных этими авторами участков (от –458 до –364 п.н.) был метилирован только при аутизме, а регион начала транскрипции (от –131 до +1 п.н.) — только у здоровых. На этом основании можно предположить, что подобный паттерн метилирования гена рилина (высокий у сайта инициации транскрипции и низкий в дистальной области промотора) отражает нормальные закономерности развития нервной системы и способствует большей сохранности когнитивных процессов, лежащих в основе выполнения задачи на В.Б. Следует подчеркнуть, что нарушения семантической ВБ являются одним из первых когнитивных симптомов шизофрении и, более того, они могут иметь отношение к развитию заболевания у лиц из группы высокого риска [33]. Это позволяет связать нарушения семантической ВБ при шизофрении с особенностями развития нервной системы, несмотря на то что данные о сопряженности этого признака со структурными аномалиями мозга, выявляемыми на ранних этапах шизофрении, неоднозначны [34—36].

Таким образом, проведенное исследование показало наличие у пациентов с расстройствами шизофренического спектра ассоциации полиморфного сайта rs7341475 в гене RELN c позитивным синдромом по PANSS. Гомозиготность по распространенному аллелю, которая, как показано ранее, увеличивает риск развития шизофрении у женщин, оказывает протективный эффект на выраженность позитивной симптоматики у мужчин. В небольшой группе более молодых пациентов найдена связь между семантической ВБ и паттерном метилирования 5’-области и промотора RELN. В целом результаты согласуются с представлениями о гендерно-специфичной роли рилина в патогенезе шизофрении. Дальнейшее изучение функциональных последствий полиморфизма rs7341475 и особенностей метилирования RELN в процессе нейроразвития может пролить свет на механизмы формирования позитивных и когнитивных симптомов шизофрении.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16−15−00056).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

https://doi.org/10.1016/j.schres.2015.11.008

*e-mail: m.alfimova@gmail.com