Нарушение функционирования головного мозга происходит вследствие развивающегося ишемического повреждения, в результате которого прекращается доставка к нему кровью кислорода и глюкозы, что приводит к нарушению мозгового кровоснабжения и последующему повреждению мозговой ткани [1]. В нейронах мозговой ткани, подвергшейся некрозу, вследствие ишемического повреждения происходит нарушение цикла Кеннеди, и, как следствие, развивается окисление мембранных фосфолипидов (ФЛ) до образования фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина и сфингомиелина. Мембранные Ф.Л. нейронов, входящие в состав липидных доменов, выполняют структурные и физиологические функции, связанные с деятельностью ферментов, находящихся в составе мембран, а также играют определенную роль в реакциях связывания рецептора с различными соединениями, регулирующими перемещение ионов. Изменение процесса липолиза способствует активации протеинкиназы С, сфингомиелиназы, повышению микровязкости мембран, приводящим к выходу внутриклеточного кальция и к образованию церамида и активных форм кислорода (АФК). АФК способствуют модификации белков, ферментов, рецепторных комплексов, ионных каналов, а также активируют перекисное окисление липидов, ведущее к повреждению фосфолипидного бислоя мембран [2—4]. Аналогичные процессы происходят и в мембранах митохондрий в результате активации фосфолипазы D, сопровождающейся снижением кардиолипина, что ведет к нарушению функции фермента цитохромоксидазы и в дальнейшем к нарушению функции дыхательной цепи [5].

Следует отметить, что сфингомиелиновый цикл (СФМ-цикл) связан с окислительным стрессом, что также ведет к накоплению церамида и гибели нервных клеток. Он является распространенной сигнальной системой, включающей деградацию сфингомиелина сфингомиелиназой с образованием церамида, который в свою очередь при участии церамидазы превращается в сфингозин. Продукты гидролиза (церамид и сфингозин) являются важными компонентами мембран клеток ЦНС и участвуют в развитии, жизнедеятельности и гибели нервных клеток [6].

церамид не просто рядовое звено в процессе клеточного сигналинга, приводящего к клеточной гибели, он является одним из регуляторов баланса между программируемой клеточной гибелью и пролиферацией клеток [7]. Изменения, происходящие во внутриклеточных сигнальных путях под влиянием церамида, оказывают влияние на окислительно-восстановительные реакции, протекающие в цитоплазме, что обусловливает нормальное течение процессов перекисного окисления липидов [8]. Тем самым церамид способствует развитию митохондриальной дисфункции и активации окислительного стресса. Нарушение функционирования электрон-транспортной цепи приводит к быстрой потере АТФ и утечке ионов через клеточную мембрану, что способствует развитию деполяризации мембраны и высвобождению глутамата и допамина [9, 10]. Высвобождение глутамата активирует фосфолипазу [2, 11] и гидролиз ФЛ фосфолипазой А₂ с высвобождением арахидоновой кислоты, в ходе окисления которой циклооксигеназой образуются гидропероксиды и пероксильные радикалы [12]. Развитие этих процессов ведет к деструкции нейрональных мембран, необратимым нарушениям ионного гомеостаза и в конечном итоге к гибели нейронов. Таким образом, существующая в живых клетках связь между окислительной системой и СФМ-циклом вносит существенный вклад в развитие ишемического повреждения и в дальнейшем его патобиохимического финала — апоптоза.

Применение нейропротективных препаратов вызывает снижение развития острого повреждения нейрональной ткани и способствует восстановлению функций головного мозга [13, 14].

В предыдущем исследовании [15] нами было оценено изменение антиоксидантного статуса больных с хронической цереброваскулярной болезнью при применении 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцината (нейрокс), а также его комбинации с цитиколином (нейпилепт). Было выявлено усиление нейропротективного и антиоксидантного эффектов в комплексном применении нейрокса и нейпилепта в отличие от группы больных, получающих только нейрокс, а также увеличение количества восстановленных SH-групп после лечения нейроксом в сравнении с комплексным применением нейрокса и нейпилепта [16]. Полученные результаты свидетельствовали об эффективности комплексного применения этих нейропротективных препаратов, что обусловлено увеличением антиоксидантного терапевтического потенциала за счет сложения механизмов их действия.

Тем не менее, несмотря на всестороннее изучение механизмов хронической цереброваскулярной патологии, целесообразность лечения нейропротективными препаратами определена недостаточно. Цель настоящего исследования — проведение сравнения эффективности влияния комбинации препаратов 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцината и цитиколина с монотерапией этими препаратами на изменение фосфолипидного состава плазмы крови больных с хронической ишемией головного мозга.

В исследование были включены 40 больных (18 мужчин и 22 женщины) в возрасте от 54 до 72 лет с хронической цереброваскулярной болезнью, госпитализированные в неврологическое отделение ГБ № 56 Москвы в стадии декомпенсации на фоне гипертонического криза и/или нарушения сердечного ритма. В исследование не включались пациенты с сахарным диабетом 1-го и 2-го типов; перенесшие инсульт (по данным магнитно-резонансной томографии); имеющие степень снижения когнитивных функций до уровня деменции; с острыми или обострившимися хроническими воспалительными заболеваниями; онкологическим анамнезом.

После обследования и верификации диагноза по МКБ-10 (I67.8), подписания информированного согласия больные методом случайной выборки были распределены на три группы в зависимости от схемы лечения.

В 1-ю группу вошли 14 пациентов, которые в дополнение к базовой схеме лечения, включавшей индивидуально подобранную этиотропную терапию гипотензивными, антиаритмическими, антиагрегантными, антикоагулятными препаратами, получали лечение этилметилгидроксипиридина сукцинатом (нейрокс, «Сотекс», Россия) по 500 мг (5,0 мл) ежедневно, внутривенно на 200,0 мл физиологического раствора в течение 14 дней. Во 2-ю группу включили 13 пациентов, в дополнение к базовой терапии получающих цитиколин (нейпилепт, «Сотекс», Россия) по 1000 мг (4,0 мл) ежедневно, внутривенно струйно, в течение 14 дней. В 3-ю группу вошли 13 пациентов, которые в дополнение к базовой терапии получали комбинацию этих препаратов в той же дозе.

Группы пациентов не различались по возрасту, гендерному составу и частоте выявленной сопутствующей патологии внутренних органов.

Для оценки эффективности лечения использовалась клиническая шкала оценки неврологического статуса А.И. Федина, краткая шкала оценки психического статуса (MMSE). В ходе исследования из полученной плазмы крови пациентов получали экстракт липидов и определяли качественный и количественный состав Ф.Л. Для выделения липидов были использованы следующие реагенты: 0,05% муравьиная кислота, метиловый спирт, хлороформ, 1 М хлорид натрия («Химмед», Россия; «Sigma-Aldrich», США).

Для построения калибровочного графика и определения липидного фосфора методом Васьковского использовали дигидрофосфат калия, соляную кислоту (36%), молибдат натрия, солянокислый гидразин, серную кислоту («Sigma-Aldrich», США).

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках с алюминиевой подложкой, силикагель Silica Gel 60 F254 («Merck», Германия) в системах: хлороформ—метанол—аммиак (65:25:5) и хлороформ—метанол—вода (65:25:4). Для проявления пятен использовали фосфорномолибденовую кислоту.

Определение липидного фосфора осуществляли с использованием метода Бартлетта [16], модифицированного В.E. Васьковским [18] и В.И. Светашевым [17]. Метод Васьковского основан на взаимодействии неорганического фосфора (KH₂PO₄) с Na₂MoO₄·2H₂O в присутствии NH₂NH₂·HCl с образованием фосфорномолибденового комплекса, хорошо растворимого в кислой среде и имеющего синюю окраску. Экстракцию липидов из клеток крови осуществляли путем добавления в образцы растворителей хлороформ—метанол (1:1) и последующего центрифугирования. Для уменьшения потерь к смеси растворителей хлороформ—метанол добавили муравьиную кислоту в соотношении 2:1:0,5 соответственно. Для удаления нелипидных примесей использовали хлорид натрия—хлороформ—метанол в соотношении 3:10:5. В ходе экстракции было получено около 60% липидов, что соответствует данным литературы [19].

Для построения калибровочного графика использовали стандартный раствор дигидрофосфата калия (KH₂PO₄). Для этого подготавливали 2 реагента. Один (раствор А) представлял смесь концентрированной соляной кислоты, воды, молибдата натрия (Na₂MoO₄·2H₂O) и солянокислого гидразина (NH₂NH₂·HCl). Полученную смесь растворов нагревали на кипящей водяной бане с последующим добавлением серной кислоты и воды. Непосредственно перед определением фосфора готовили второй реагент (раствор Б). Для этого к отобранной аликвоте раствора, А добавляли воду и серную кислоту.

Измерение оптической плотности при длине волны 815 нм производили на спектрофотометре UV-1700 PharmaSpec («Shimadzu», Япония). Количество Ф.Л. рассчитывали по формулам:

x=D/0,15736,

где x — количество фосфора, 0,15736 — постоянная, рассчитанная по калибровочному графику:

y=x∙800/31,

где y — количество ФЛ.

Полученные данные усреднили и построили калибровочную кривую в координатах оптическая плотность—концентрация фосфора.

Определение качественного состава ФЛ методом ТСХ в системах хлороформ—метанол—вода (65:25:4) и хлороформ—метанол—аммиак (65:25:5). Для наибольшего расхождения пятен сначала проводили ТСХ в аммиачной системе, затем после просушки переносили пластинку в водную систему. Для проявления пластинки использовали фосфорномолибденовую кислоту. Для сравнения использовали стандарты фосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин, сфингомиелин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин. Для построения калибровочного графика готовили стандартный раствор фосфатидилхолина с концентрацией 10 мг/мл. Для определения количественного состава ФЛ в плазме крови использовали программу Sorbfil TLC, с помощью которой определяли площадь пика и рассчитывали массу фосфатидилхолина. По полученным значениям построили калибровочный график для расчета концентраций классов ФЛ в экстракте липидов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica («StatSoft Corporation», США). Для анализа достоверности различий использовали непараметрический критерий Вилкоксона для двух связанных групп. Выбор критерия обусловлен наличием связанных групп, а именно до и после лечения. Данные представлены в виде медианы и интерквартильного размаха (Ме [LQ; OQ]). Достоверными принимали различия при p<0,05 [20].

В ходе проведенного лечения у больных всех групп было отмечено снижение основных жалоб и общее улучшение состояния. Субъективные положительные изменения были подтверждены при оценке объективного неврологического статуса пациентов по адаптированной шкале А.И. Федина. В 1-й группе было отмечено достоверное снижение тяжести клинического синдрома от 53 [60,8; 45,2] до 38 [42,26; 33,8] баллов (р<0,05); во 2-й — от 54 [60,5; 47,5] до 34 [41,1; 26,9] баллов (р<0,05), в 3-й — от 54 [61,0; 45,0] до 32 [40,0; 27,2] баллов (р<0,05). Достоверных межгрупповых различий по динамике неврологического статуса в группах не выявили. Улучшение когнитивных функций по шкале MMSE наблюдалось также во всех группах: в 1-й группе — от 24,6 [25,1; 24,3] до 26,4 [27,2; 25,6] балла, во 2-й — от 25,1 [25,4; 24,8] до 27,4 [27,5; 27,3] балла (р<0,05) и в 3-й — от 26,1 [26,7; 26,4] до 28,2 [28,5; 28,3] балла (р<0,05).

При сравнении трех схем лечения были обнаружены изменения среднего количества липидов в клетках крови пациентов. Так, в группе больных, получавших нейрокс, среднее количество ФЛ до и после лечения составляло 3,8 [3,3; 5,3] и 4,7 [3,2; 5,7] мкг соответственно, при лечении нейпилептом — 4,0 [3,5; 4,6] и 4,8 [4,5; 5,2] мкг соответственно, а в случае комбинированного применения нейрокса и нейпилепта — 4,1 [5,1; 7,2] и 5,1 [4,7; 5,4] мкг соответственно (р<0,05) (табл. 1).

В плазме крови пациентов 1-й группы, получавших нейрокс, в количестве общих липидов и ФЛ до и после лечения практически не регистрировалось достоверных изменений. У пациентов 2-й группы, получавших нейпилепт, при измерении общих липидов и ФЛ до и после лечения регистрировалось увеличение общей массы ФЛ клеток крови. У больных 3-й группы, получавших комбинированное лечение нейроксом и нейпилептом, при измерении общих липидов и ФЛ до и после лечения регистрировалось достоверное увеличение общей массы ФЛ клеток крови.

При определении качественного состава ФЛ у больных 1-й группы до и после лечения препаратом нейрокс не удалось обнаружить значительных различий в составе ФЛ плазмы крови (табл. 2).

Полученные данные позволяют утверждать, что нейрокс слабо способствует модификации фосфолипидного состава клеток крови, его применение незначительно способствовало изменению микровязкости липидного компонента мембран клеток крови за счет изменения соотношения насыщенных ФЛ (сфингомиелин) и ненасыщенных (фосфатидилсерин) в отличие от групп, где применялся нейпилепт, или в случае комбинированного применения нейрокса и нейпилепта (см. табл. 2).

При применении нейрокса в монотерапии не было зарегистрировано достоверного увеличения количества фосфатидилхолина, что, возможно, связано с небольшой статистической выборкой пациентов. Тем не менее применение нейрокса приводило к небольшому увеличению насыщенных ФЛ, таких как фосфатидилсерин, и снижению ненасыщенных (сфингомиелин), что свидетельствовало об увеличении текучести клеточных мембран.

Как известно, при увеличении текучести происходит изменение подвижности мембранных белков, увеличение активности рецепторного аппарата на поверхности мембраны, а также увеличение транспорта веществ внутрь, через мембрану. Известно, что фосфатидилсерин является предпочтительным липидом для Nа⁺-, К⁺-АТФазы [21]. Добавление в схему лечения хронической цереброваскулярной патологии комбинации нейрокса и нейпилепта продемонстрировало синергизм нейропротективного действия, а также, возвращаясь к исследованию, проведенному ранее [15], и антиоксидантного потенциала этих препаратов, когда наблюдалось достоверное увеличение активности фермента супероксиддисмутазы после проведенной комплексной терапии препаратами, указывающее на усиление антиоксидантного эффекта путем активации системы глутатиона, в отличие от применения только этилметилгидроксипиридина сукцината, что связано с различными точками приложения препаратов.

Было зарегистрировано достоверное повышение фосфатидилхолина, а также незначительное изменение количества фосфатидилинозитола, сфингомиелина и фосфатидилсерина, что также, возможно, связано со статистической выборкой пациентов. Таким образом, комплексная терапия с применением 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцината (нейрокс) и цитиколина (нейпилепт) демонстрирует изменение фосфолипидного спектра нейтрофилов, связанное с увеличением содержания фосфатидилхолина на 10% и снижением фосфатидилинозитола на 4%, сфингомиелина и фосфатидилсерина — на 3%. Увеличение мембранного фосфатидилхолина и снижение сфингомиелина способствует понижению активности фосфолипазы А₂ и накоплению церамида. Вследствие этого происходит стабилизация мембраны, что приводит к увеличению активности супероксиддисмутазы и к усилению связывания с ее субстратами [22] в отличие от монотерапии нейроксом. Помимо этого, восстановление фосфатидилхолина в биомембранах также способствует аккумуляции на мембранной поверхности клеток такого антиоксиданта, как α-токоферол, приводящего к уменьшению генерации гидропероксидов жирных кислот и соответствующих пероксильных радикалов [23].

Следует заметить, что липидный состав плазматических мембран влияет на процессы активации нейтрофилов. Поскольку, лиганд, связывающийся с внеклеточной стороной рецептора и осуществляющий последующую передачу информации через мембрану в цитоплазму, сильно зависит от состава липидной мембраны и ее текучести [24, 25]. Кроме того, изменение микровязкости клеточных мембран способно оказывать действие на клеточный рецепторный аппарат, что сопровождается перестройкой сети мембранных белков, приводящей к повышению подвижности ФЛ, и тем самым влиянием на процессы межклеточной кооперации [26, 27].

Таким образом, зарегистрированные изменения количества фракций фосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфатидилэтаноламина, сфингомиелина в клетках крови пациентов во 2-й и 3-й группах, при лечении нейпилептом и при комбинированном применении нейрокса и нейпилепта, по всей вероятности, указывают на некоторое изменение микровязкости клеточных мембран, что, возможно, будет способствовать изменению функциональной активности липидзависимых мембранолокализованных ферментов цикла Кребса, дыхательной цепи митохондрий, транспортных АТФаз.

Подводя итоги, можно утверждать, что результаты, полученные в ходе настоящего исследования, указывают на целесообразность использования комбинации этилметилгидроксипиридина сукцината и цитиколина при нейропротективной терапии пациентов с хронической ишемией головного мозга. Это согласуется с многочисленными проведенными экспериментальными и клиническими исследованиями, указывающими на значительную терапевтическую эффективность комплексного применения нескольких антиоксидантов с разными механизмами действия [15].

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: e.solovieva@mail.ru