Активность тромбоцитарной глутаматдегидрогеназы у больных с эндогенными психозами

В современной литературе [1—4] активно обсуждается участие глутаматергической системы в развитии эндогенных психозов. В мозге больных шизофренией по сравнению с психически здоровыми лицами выявлены изменения концентрации глутамата, активности и концентрации его рецепторов и переносчиков, а также описаны психотомиметические эффекты сильных антагонистов глутаматных рецепторов NMDA-типа; на этих фактах была основана «глутаматергическая» гипотеза патогенеза шизофрении, предполагающая снижение активности глутаматзависимого проведения нервных импульсов в мозге больных главным образом из-за недостаточной активности рецепторов NMDA-типа [5—8]. Проведение глутаматного нейромедиаторного сигнала зависит не только от количества и активности рецепторов и переносчиков глутамата, но и от интенсивности работы ферментов, метаболизирующих этот нейромедиатор. Концентрация глутамата в синапсах определяется равновесием между его транспортом, связыванием специфическими рецепторами и метаболизмом ферментов, и она может изменяться вследствие их нарушения. В результате аутопсийных исследований мозга человека был выявлен ряд особенностей метаболизма глутамата при шизофрении в сравнении с психически здоровыми. Эти особенности заключаются в изменении концентрации и клеточной локализации ключевых ферментов метаболизма глутамата — глутаминсинтетазы, белка, подобного глутаминсинтетазе, изоферментов глутаматдегидрогеназы (ГДГ) и изменении регуляторных связей, контролирующих соотношение этих ферментов [9, 10]. Нейрохимические исследования мозга направлены на выяснение патогенеза шизофрении, но важен также поиск таких биохимических изменений в периферической крови больных, которые помогли бы правильно подобрать антипсихотическую терапию и прогнозировать ее эффективность [11]. В этом случае особого внимания заслуживают тромбоциты крови, в которых найден ряд компонентов глутаматной системы — рецепторы и переносчики глутамата (глутаматзависимые ионные каналы) [12, 13], а также некоторые ферменты метаболизма глутамата [14].

Один из ключевых ферментов метаболизма глутамата — ГДГ (КФ 1.4.1.3), которая катализирует обратимое окислительное дезаминирование L-глутамата с образованием α-кетоглутарата, используя в качестве коферментов NAD/NADP:

L-глутамат+NAD (P)+H2O↔α-кетоглутарат+NH4++ NAD (P)H.

В мозге человека этот фермент представлен тремя изоформами (ГДГ I, ГДГ II и ГДГ III), которые различаются локализацией и силой связи с мембранами [15].

В экстрактах тромбоцитов человека удалось обнаружить два легко растворимых изофермента ГДГ I и ГДГ II [16, 17], а количество иммунореактивной ассоциированной с мембраной изоформы ГДГ III оказалось ниже порога обнаружения методом ECL-иммуноблоттинга [17]. Эти изоферменты были выявлены благодаря использованию антител к ГДГ мозга человека. В тромбоцитах присутствие ГДГ было обнаружено не только методом иммуноблоттинга, но и зарегистрирована ее ферментативная активность [14].

Цель настоящей работы — оценка уровня ферментативной активности ГДГ в тромбоцитах больных с эндогенными психозами: с диагнозами шизофрении и шизоаффективного расстройства по сравнению с лицами без психической патологии (контроль) и выявление возможной связи клинического состояния больных и активности тромбоцитарной ГДГ.

Обследовали 69 больных (все — мужчины) с эндогенными психозами, которые были госпитализированы в Научный центр психического здоровья (НЦПЗ) в состоянии обострения заболевания с психотической симптоматикой.

У 48 была диагностирована приступообразно-прогредиентная форма шизофрении по МКБ-10: F20.00 у 15 больных, F20.01 — у 21, F20.02 — у 5, F20.09 — у 7; 21 пациенту был поставлен диагноз шизоаффективного расстройства: F25 — у 3 больных, F25.1 — у 3, F25.2 — у 5 и F25.0 — у 10.

С первым психотическим приступом (ПП) были госпитализированы 34 пациента, c повторными приступами заболевания (ППЗ) — 35.

Распределение пациентов по возрасту в обследованных подгруппах приведено в табл. 1.

Больные обследовались традиционным психопатологическим методом с использованием шкалы позитивных и негативных симптомов PANSS c определением суммы баллов: общей (PANSStot) и по подшкалам — позитивной (PANSSpos), негативной (PANSSneg) и общей психопатологической симптоматики (PANSSpsy). Психометрическая оценка больных осуществлялась дважды: до начала лечения и по окончании курса терапии. При госпитализации до начала курса терапии у каждого больного оценка по PANSStot составляла не менее 60 баллов.

Курс антипсихотической терапии проводили в течение 1 мес или более продолжительное время — до улучшения состояния. Применяли рисперидон, клозапин, оланзапин, зуклопентиксол, галоперидол, перфеназин.

Контрольную группу составили 34 мужчины без психической патологии в возрасте 18—59 (Me 39 (33,5; 47) лет.

Критериями исключения из исследования являлись органические заболевания ЦНС, острые и хронические соматические заболевания.

Взятие образцов крови для исследования активности ГДГ в контрольной группе проводилось однократно, а у больных — дважды: до начала курса терапии и после его окончания.

Взятие образцов крови из локтевой вены у пациентов производилось в вакутейнеры с антикоагулянтом — 0,105 М-цитратным буфером с глюкозой (рН 5,7). Каждый образец крови обрабатывался индивидуально в течение 2 ч после забора крови. Выделение тромбоцитов из крови проводилось методом, описанным ранее [16, 17]. Осадок тромбоцитов ресуспендировался в 0,05 М Tris-HCl буфере (pH 7,5) с 50% глицерина и хранился при –20 °С. Непосредственно перед определением активности ГДГ к пробе тромбоцитов добавлялся 50 мМ K-фосфатный буфер (pH 7,4), содержащий додецил-β-D-мальтозид до его конечной концентрации 1%; проводился лизис 10 мин при температуре 25 °C, затем образцы центрифугировались при 10 000 об/мин в течение 10 мин при 4 °C (центрифуга Eppendorf, Германия). Полученный супернатант разбавлялся в 10 раз в 50 мМ K-фосфатном буфере (рН 7,4). Активность ГДГ определялась спектрофотометрическим методом [18] с модификациями. Объем пробы, добавляемой к 400 мкл реакционной смеси, составлял 125 мкл. Состав реакционной смеси: 0,1 мМ NADH, 0,1 М NH4Cl, 10 мМ α-кетоглутарата, 1 мМ ADP, 2,6 мМ ЭДТА в 0,01 М Tris-HCl буфере (pH 8,0). В основе измерения скорости реакции, в данном случае направленной влево, лежит убыль поглощения NADH, регистрируемая методом спектрофотометрии, при 340 нм в течение 3 мин. Для расчета ферментативной активности было принято значение коэффициента молярной экстинции NADH 6,22·10–3 л·моль–1·cм–1, и в таблицах приведена удельная активность ГДГ в расчете на 1 мг белка.

Концентрация белка определялась спектрофотометрическим методом Лоури с использованием набора реагентов Bio-Rad DC Protein Assay (США) в соответствии с протоколом и бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich) в качестве белкового стандарта для калибровки.

Для статистического анализа применялся модуль «непараметрический анализ» программы Statistica 6.0 («StatSoft»). Для оценки достоверности различий, изменений параметров и связей между ними использовались U-тест Манна—Уитни, критерий Краскела—Уоллиса, метод парных сравнений Вилкоксона, метод ранговых корреляций (с вычислением r — коэффициента корреляции Спирмена). Различия и корреляции считали достоверными при p<0,05.

В настоящей работе удельная активность тромбоцитарной ГДГ во всех без исключения образцах находилась в рабочем диапазоне метода определения активности ГДГ. Это позволило внести данные об активности ГДГ в базу данных, сформированную на основе клинических обследований больных и содержащую также информацию о возрасте в контрольной группе, и сравнить между собой обследованные группы.

Контрольная и группа больных достоверно различались по возрасту (U-тест Манна—Уитни, p=0,000002). Однако ни в одной из этих групп не было выявлено достоверной корреляции между уровнем активности ГДГ и возрастом (ранговые корреляции Спирмена, р>0,05), что позволило провести сравнение активности ГДГ между группами контроля и больных в целом.

Было обнаружено, что активность ГДГ в группе больных до лечения была достоверно ниже, чем в контрольной группе (U-тест Манна—Уитни, р<0,001). В результате проведенного курса антипсихотического лечения активность ГДГ хотя и повысилась, но не достоверно (критерий Вилкоксона, p=0,58), и осталась достоверно ниже, чем в контрольной группе (U-тест Манна—Уитни, p<0,05).

Вся группа больных (69 человек) до лечения по уровню активности ГДГ была разделена на 3 непересекающихся подгруппы: с высокими, средними и низкими ее показателями. Между этими подгруппами было проведено сравнение по клиническим параметрам (суммы баллов PANSStot, PANSSneg, PANSSpos, PANSSpsy). Как показали тест Краскела—Уоллиса и медианный тест, подгруппы достоверно различались по суммам баллов PANSSneg до лечения (p<0,05). Важно также, что между этими подгруппами при использовании тех же тестов обнаружены достоверные различия и в баллах PANSS после лечения (PANSStot, PANSSneg, p<0,05).

Полученные результаты дали основание предположить, что уровень активности ГДГ может быть связан с клиническим состоянием больных и иметь прогностическое значение в отношении эффективности антипсихотической терапии.

В группе больных с эндогенными психозами до лечения методом оценки ранговых корреляций (вычисление коэффициентов Спирмена) были выявлены хотя и слабые, но достоверные отрицательные корреляционные связи между клиническим состоянием — баллами PANSStot и PANSSpsy и активностью ГДГ (r= –0,24, p<0,05 и r= –0,23, p<0,04 соответственно), т. е. чем тяжелее клиническое состояние, оцененное по PANSStot и PANSSpsy, тем ниже активность ГДГ у больного. После лечения корреляций между активностью ГДГ и оценками по PANSS обнаружено не было.

В рамках настоящего исследования рассматривались также диагностические подгруппы пациентов — больные с диагнозом шизофрении (48 человек) и шизоаффективное расстройство (21). В табл. 2 представлены данные об активности ГДГ в контрольной группе и в этих подгруппах пациентов.

Как и в общей группе больных, у больных шизофренией активность ГДГ была ниже, чем в контрольной группе, как до, так и после лечения (U-тест Манна—Уитни, р<0,003 и р<0,015 соответственно). Однако, у больных шизоаффективным расстройством отличие от контрольной группы наблюдалось только после лечения (U-тест Манна—Уитни, р<0,05). Критерий парных сравнений Вилкоксона не показал достоверных изменений в результате лечения больных обеих подгрупп.

По U-тесту Манна—Уитни не было обнаружено достоверных различий в активности ГДГ между подгруппами больных шизофренией и шизоаффективным расстройством ни до, ни после лечения, однако, согласно критерию Краскела—Уоллиса, достоверные различия в активности ГДГ до лечения между тремя группами обследованных (больные шизофренией, шизоаффективным расстройством и контрольная группа) обнаруживались: H=8,67, p=0,013. Различия между этими группами по активности ГДГ сохранялись и после лечения: H=7,49, p=0,024.

Различия между подгруппами больных были выявлены и при оценке корреляционных зависимостей между балльными оценками по PANSS и активностью ГДГ. Так, у больных с диагнозом шизоаффективного расстройства (n=21) до лечения была обнаружена достоверная отрицательная связь PANSSneg и активности ГДГ (r= –0,58, р<0,015), причем в этой подгруппе у больных с ПП (19 человек) коэффициент корреляции активности ГДГ и PANSSneg был еще выше (r= –0,61, р<0,009).

Для подгруппы больных шизофренией подобных связей выявлено не было. По критерию Краскела—Уоллиса не было выявлено достоверных различий в активности ГДГ до начала лечения между подгруппами больных шизофренией с диагнозами, соответствующими разным рубрикам МКБ-10. После лечения в подгруппах больных шизофренией и шизоаффективными расстройствами не было выявлено корреляции баллов по PANSS с активностью ГДГ. В то же время было отмечено, что в подгруппе больных шизоаффектвным расстройством с ПП (19 пациентов) была выявлена корреляционная связь активности тромбоцитарной ГДГ, определенной до лечения, с оценкой PANSStot после лечения (r= –0,38 p<0,04). Что же касается подгруппы больных шизофренией (как с ПП, так и с (ППЗ), то корреляционных связей активности тромбоцитарной ГДГ, определенной до лечения, с оценкой по PANSS после лечения не наблюдалось.

Поскольку в подгруппе пациентов с шизоаффективным расстройством с ПП обнаружилась связь активности ГДГ до лечения с суммой баллов по PANSS после лечения, которая могла иметь прогностическую ценность, в дальнейшем общая группа больных была разделена еще на две подгруппы — больные с ПП (34) и с ППЗ (35). Данные об активности ГДГ в этих подгруппах суммированы в табл. 3.

По критерию Краскела—Уоллиса были выявлены достоверные различия в активности ГДГ до лечения между группами больных с ПП, ППЗ и контрольной группой H=9,61, p=0,01. Различия между группами в активности ГДГ сохранялись и после лечения: H=8,63, p=0,01. Как и в общей группе больных, у больных с ПП активность ГДГ была ниже, чем в контрольной группе, как до, так и после лечения (U-тест Манна—Уитни, р<0,004 и р<0,006 соответственно). То же самое наблюдалось и у больных с ППЗ (р<0,002 и р<0,005).

Различия между подгруппами пациентов с ПП и ППЗ были выявлены и при анализе корреляционной зависимости между оценками по PANSS и активностью ГДГ. У больных с ПП до лечения были обнаружены достоверные отрицательные связи сумм баллов по PANSS и активности ГДГ: PANSStot (r=–0,44, р<0,008), PANSSneg (r= –0,48, р<0,003), PANSSpsy (r= –0,37, р<0,03). В подгруппе больных с ППЗ таких связей обнаружено не было. После лечения в обеих подгруппах не было выявлено достоверных корреляций активности ГДГ и баллов по PANSS.

В то же время важно отметить, что в подгруппе больных с ПП (как и в случае подгруппы с шизоаффективным расстройством с ПП) были выявлены негативные корреляционные связи активности ГДГ, определенной до лечения, с баллами по PANSS после лечения: PANSStot (r= –0,39 p<0,04), PANSSneg (r= –0,39 p<0,04) и PANSSpsy (r= –0,37 p<0,04), тогда как у больных с ППЗ таких связей выявлено не было. Таким образом, чем выше активность ГДГ в тромбоцитах больных с ПП до лечения, тем ниже оценки по PANSStot, PANSSneg и PANSSpsy после лечения.

Как указывалось в начале статьи, ранее нами [11, 16, 17] в экстрактах тромбоцитов человека были обнаружены два изофермента — ГДГ I и ГДГ II, причем экстракция проводилась детергентом — додецилсульфатом натрия, образцы обрабатывались кипячением, согласно стандартному протоколу для метода оценки — ECL-иммуноблоттинга с использованием иммунозондов — антител к ГДГ I и ГДГ II мозга человека. При оценке количества ГДГ иммуноблоттингом учитывалась сумма изоформ ГДГ I и ГДГ II. Этим же методом были исследованы тромбоциты 60 больных шизофренией с ППЗ в стадии обострения и 60 добровольцев без психической патологии, и количество ГДГ в тромбоцитах больных до лечения, оцененное методом иммуноблоттинга, достоверно не отличалось от уровня в контрольной группе [11].

При оценке ферментативной активности тромбоцитарной ГДГ в настоящей работе использован более мягкий способ экстракции детергентом — лаурилмальтозидом (n-додецил-β-D-мальтозид), позволяющи сохранить ферментативную активность. В этом случае в контрольной группе определялась более высокая активность ГДГ, чем у больных. Очевидно, додецилсульфат Na и додецилмальтозид по-разному экстрагируют изоферменты ГДГ из тромбоцитов, способствуя различной диссоциации ее изоформ, в частности из тромбоцитарных митохондрий.

Нужно отметить, что метод определения ферментативной активности менее трудоемкий и дорогой по сравнению с ECL-иммуноблоттингом, и для проведения клинических исследований ему следует отдать предпочтение.

В результате проведенного исследования обнаружено, что активность тромбоцитарной ГДГ у больных с эндогенными психозами (шизофрения, шизоаффективные расстройства) в состоянии обострения — как в общей группе, так и в подгруппах больных с ПП и с ППЗ — достоверно ниже, чем в контрольной группе.

Наиболее значимые результаты были получены при обследовании больных с ПП. У них до лечения была обнаружена достоверная отрицательная корреляция активности ГДГ и баллов PANSStot, PANSSneg, PANSSpsy. В этой же подгруппе больных, и, в частности, у пациентов с ПП с диагнозом шизоаффективного расстройства были выявлены связи, которые могут иметь прогностическое значение: корреляции активности ГДГ до лечения с баллами по PANSStot, PANSSneg и PANSSpsy после лечения. Таким образом, чем выше активность ГДГ в тромбоцитах больных с ПП, тем благоприятнее клиническая картина до и после лечения: ниже баллы по PANSStot, PANSSneg и PANSSpsy.

Сказанное выше говорит о том, что исходные значения активности тромбоцитарной ГДГ могут иметь ценность для прогноза эффективности антипсихотической фармакотерапии у пациентов с ПП эндогенного психоза.