Ультраструктурные изменения лимфоцитов у больных шизофренией при лечении оланзапином

Оланзапин является атипичным антипсихотическим средством, способным блокировать серотониновые (5-НТ2) и дофаминовые (D2) рецепторы [1, 2], а также влиять на иммунную систему. Было установлено [3], что через 8 нед терапии у больных отмечается достоверное повышение продукции интерлейкинов 1β (IL-1β). Кроме того, было показано [4], что лечение в течение 3 мес приводит к повышению уровня CD8 и снижению иммунорегуляторного индекса CD4/CD8. Однако остается неясным, вызывает ли лечение больных шизофренией оланзапином ультраструктурные изменения в основных клеточных элементах иммунной системы — лимфоцитах.

В проведенном авторами ранее исследовании [5] было установлено, что у больных шизофренией в процессе лечения оланзапином имеет место нарушение обмена тромбоцитарного серотонина. При этом нарушения серотонинового метаболизма в тромбоцитах сопряжены с их ультраструктурными изменениями. В предыдущих работах [6, 7] было также обнаружено, что у больных хронической шизофренией до лечения понижено процентное содержание малых лимфоцитов и повышено содержание больших, а также больших активированных лимфоцитов и лимфобластов по сравнению со здоровыми, а активированные лимфоциты отличаются сниженной объемной фракцией митохондрий.

Настоящая работа является продолжением предыдущих исследований. Ее целью является морфометрическое исследование указанных выше субпопуляций лимфоцитов периферической крови больных хронической шизофренией в процессе лечения оланзапином.

До лечения были обследованы 59 больных хронической приступообразно-прогредиентной шизофренией (по МКБ-10 рубрики F20.02, F20.22). Их полная характеристика была дана в предыдущей публикации [7]. В контрольную группу вошли 31 соматически и психически здоровых лиц.

Больных лечили оланзапином (зипрексa) фирмы «Eli Lilly» (США): 56 пациентов в течение 8 нед и 49 — 28 нед. Начальная доза составляла 10 мг 1 раз в день. Затем дозу препарата изменяли в зависимости от тяжести состояния и переносимости терапии в диапазоне от 5 до 20 мг в сутки. Кровь для исследования у этих больных брали до лечения, через 8 и 28 нед терапии.

Изучали препараты клеток периферической крови, приготовленные для трансмиссионной электронной микроскопии. Венозную кровь с гепарином брали у пациентов в стерильную коническую пробирку и выдерживали под наклоном в течение 60 мин. Затем отбирали верхний слой лейкоцитов и центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин, отбрасывали плазму, а осадок клеток заливали фиксатором — 2,5% раствором глутаральдегида в 0,1 М фосфатном буфере (ФБ) (рН 7,2—7,4), промывали в этом буфере, после чего дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия в 0,1 М буферном растворе в течение 60 мин. Далее осадок клеток отмывали в буфере и заливали 4% агаром в 0,1 М ФБ, выдерживали при 50 °C 30 мин, охлаждали, извлекали застывший агар с осадком клеток, нарезали на кусочки с последующим осуществлением стандартной процедуры обезвоживания и заливки в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB (Швеция), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе Filips EM-210 (Нидерланды). Полученный электронно-микроскопический препарат содержал в достаточном количестве все клетки крови: лимфоциты, эритроциты, гранулоциты, моноциты, тромбоциты, а также макромолекулярные компоненты плазмы крови, находящиеся между клетками.

На ультратонких срезах препарата клеток крови каждого пациента исследовали 100 лимфоцитов и подсчитывали процентное содержание малых узкоцитоплазменных (7—10 мкм), больших широкоцитоплазменных (12—15 мкм) и среди них больших активированных широкоцитоплазменных лимфоцитов (содержащих 10 и более митохондрий) как часть этой субпопуляции лимфоцитов и лимфобластов. Для оценки ультраструктурных параметров в каждой субпопуляции лимфоцитов оценивали площадь клетки, ядра и цитоплазмы и объемную фракцию (долю в %) гетерохроматина, митохондрий, лизосом и вакуолей на негативах при увеличении 16 000 и с помощью наложенных на них тестовых сеток [8].

Статистический анализ проводили, используя программу Statistica 6.0. Групповые различия оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Различия между группами больных до лечения и леченных через 8 и 28 нед оценивали с помощью метода дисперсионного анализа с повторными измерениями (repeated measures ANOVA) c последующим апостериорным сравнением групп.

При качественном исследовании ультраструктуры лимфоцитов при лечении оланзапином не было существенных изменений по сравнению с лимфоцитами больных до лечения. Однако в различных субпопуляциях лимфоцитов обращали на себя внимание нередко встречавшиеся скопления электронно-плотных гранул небольшого размера, известных как первичные лизосомы (рис. 1).

Морфометрическое исследование показало, что лечение оланзапином у больных хронической шизофренией влияет как на процентное соотношение различных субпопуляций лимфоцитов, так и на их ультраструктурные особенности. Так, процентное содержание малых лимфоцитов до лечения было ниже контроля (на 24,4%, p<0,001). После 8 нед лечения этот показатель достоверно повысился (на 15,2%, p<0,001), но оставался ниже контроля (на 12,8%, p<0,005). После 28 нед лечения показатель оставался выше показателя до лечения на 11,5% (p<0,02), но ниже контроля (на 15,6%, p<0,001) (рис. 2).

Лечение оланзапином также влияло на морфометрические показатели ультраструктуры малых лимфоцитов. Площадь клеток увеличилась после 8 нед лечения на 8% (p<0,05), а после 28 нед лечения на 5,7% (p<0,05) по сравнению с показателями до лечения. По отношению к контрольной группе этот показатель был соответственно выше на 9% (p<0,05) и 6,8% (p<0,05). Площадь цитоплазмы клеток по сравнению с показателем до лечения после 8 нед терапии увеличилась на 12% (p<0,05), после 28 нед — на 9,8% (p<0,001); относительно контроля этот показатель был больше соответственно на 11% (p<0,05) и 8,8% (p<0,05). Площадь ядра клеток в процессе лечения достоверно не изменялась, однако после 8 нед терапии стала больше контроля на 8% (p<0,05) (табл. 1). Других изменений ультраструктуры малых лимфоцитов при лечении отмечено не было, за исключением объемной фракции лизосом: этот параметр был ниже контроля (статистически незначимо), но после 28 нед терапии он стал выше показателя до лечения и показателя после 8 нед терапии соответственно на 64% (p<0,05) и 40,5% (p<0,05) (табл. 1, рис. 3).

Было также установлено, что терапия оланзапином влияет на показатели больших лимфоцитов. До лечения процент больших лимфоцитов был на 29,5% выше контроля (p<0,001). После 8 нед лечения этот показатель понизился на 12% (p<0,002), а после 28 нед — на 9% (p<0,05), оставаясь однако выше контроля (p<0,05) (см. рис. 2).

Что касается ультраструктуры больших лимфоцитов, то до лечения их площадь была больше контроля на 9,5% (p<0,05), а после лечения (через 8 и 28 нед) этот показатель повысился, но статистически незначимо, и при этом также оставался выше контроля (p<0,05). Площадь цитоплазмы до лечения была также больше контроля (p<0,05) и, повышаясь в процессе лечения, оставалась больше контроля (p<0,05). Площадь ядра в процессе лечения не изменялась и оставалась больше контроля (p<0,05). Лечение не влияло на объемную фракцию гетерохроматина: она оставалась ниже контроля (p<0,05). Объемная фракция митохондрий у больных до лечения была ниже контроля (p<0,05) и не изменялась в процессе лечения. При этом объемная фракция лизосом по сравнению с показателем до лечения после 8 нед лечения повысилась на 17% (p<0,05) (см. табл. 2, рис. 3).

Изучавшаяся терапия не влияла на процентное содержание больших активированных лимфоцитов (см. рис. 2). Площадь больших активированных лимфоцитов до лечения была на 9,5% больше контроля (p<0,05). После лечения (через 8 и 28 нед) этот показатель увеличивался, оставаясь выше контроля (p<0,05). Площадь цитоплазмы этих клеток до лечения была на 9% больше контроля (p<0,05). После лечения она увеличивалась и оставалась больше контроля (p<0,05). Площадь ядра клеток также до лечения была на 10% больше контроля (p<0,05) и оставалась больше, не изменяясь после лечения. Объемная фракция гетерохроматина ядра клеток до лечения была ниже контроля на 10,3% (p<0,05), оставаясь на том же уровне в процессе лечения. Объемная фракция митохондрий до лечения была ниже контроля на 10,8% (p<0,05) и оставалась на этом уровне в процессе лечения. Объемная фракция лизосом до лечения не отличалась от контроля, однако после 8 нед лечения она повысилась на 17% (p<0,05), а после 28 нед понизилась до уровня, не отличающегося от контрольного. Объемная фракция вакуолей не отличалась от контроля и в процессе лечения незначимо снижалась (см. табл. 3, рис. 3).

Лечение оланзапином не влияло на сравнительно высокий процент лимфобластов. Их уровень до лечения был на 151,7% (p<0,001) выше контрольного. В процессе лечения происходило статистически незначимое снижение этого показателя, но он оставался также выше контроля (p<0,001) (см. рис. 2). Ультраструктурные параметры лимфобластов в процессе лечения не менялись (см. табл. 4, рис. 3).

Проведенное исследование показало, что лечение оланзапином больных хронической шизофренией влияет как на процентное соотношение различных субпопуляций лимфоцитов, так и на их ультраструктуру. До лечения у больных отмечалось снижение процента малых лимфоцитов и повышение процента больших, в том числе больших активированных лимфоцитов и лимфобластов, что свидетельствует о функциональной активации как лимфоцитов, так и лимфобластов. Лечение оланзапином вызывает противоположные изменения: повышение доли малых и понижение процента больших лимфоцитов, но не влияет на процент больших активированных лимфоцитов и лимфобластов. Важно отметить, что нормализации долей малых и больших лимфоцитов под влиянием лечения оланзапином не происходит.

С иммунологических позиций наибольший интерес представляют малые лимфоциты, имеющие ядро с плотно упакованным хроматином и небольшой ободок протоплазмы, содержащей рибосомы, лизосомы и эндоплазматический ретикулум. Малые лимфоциты относят к ключевым клеткам иммунологической системы, они являются антигенвосприимчивыми клетками, клетками-носителями иммунологической памяти, эффекторными клетками при реакциях гиперчувствительности замедленного типа, они также продуцируют антитела. Повышение процента этой субпопуляции лимфоцитов при лечении оланзапином указывает на важную роль пропорции малых лимфоцитов в механизме действия оланзапина. Результаты морфометрического исследования ультраструктурных параметров лимфоцитов больных шизофренией показывают, что размеры малых лимфоцитов увеличиваются в процессе лечения, также увеличивается объемная фракция лизосом, что является показателем активации их метаболизма.

Что касается больших лимфоцитов, то при лечении повышаются размеры клеток, цитоплазмы и увеличивается объемная фракция лизосом, однако при этом снижается объемная фракция митохондрий (после 8 нед терапии). Объемная фракция лизосом в больших активированных лимфоцитах при лечении также повышалась. Ультраструктурные морфометрические показатели лимфобластов при этом не изменялись.

Обращает на себя внимание повышение объемной фракции лизосом в трех популяциях лимфоцитов в процессе лечения оланзапином — в малых, больших и больших активированных лимфоцитах. Напомним, что лизосомы активно участвуют в метаболизме лимфоцитов, они осуществляют процесс катаболизма белков и молекул различных клеточных органелл, в частности защищая их от разных патогенов, в том числе в клетках иммунной системы [9]. Известно также, что лизосомы участвуют в механизмах действия антипсихотических препаратов [10]. Так, длительное (6 нед) введение экспериментальным животным галоперидола вызывало повышение числа лизосом в нейронах стриатума [11], что согласуется с результатами нашего исследования, свидетельствующими о повышении объемной фракции лизосом в различных субпопуляциях лимфоцитов.

Таким образом, получены результаты, которые свидетельствуют о влиянии лечения оланзапином на морфофункциональное состояние лимфоцитов больных шизофренией с тенденцией к нормализации в пропорциях субпопуляций лимфоцитов, однако не достигающих контрольных уровней. Аккумуляция лизосом в разных субпопуляциях лимфоцитов может быть одним из механизмов фармакологического действия оланзапина. Поскольку известно, что лечение оланзапином влияет на иммунную систему [2, 3], можно предположить, что морфофункциональная активация лимфоцитов у больных шизофренией под влиянием лечения оланзапином направлена на продукцию соответствующих лимфокинов для развития защитных иммунологических процессов.

Конфликт интересов отсутствует.