Функционирование головного мозга зависит от непрерывной доставки к нему кислорода и глюкозы, поэтому нарушение его кровоснабжения приводит к повреждению мозговой ткани [1]. Ишемическое повреждение является результатом каскада клеточных и молекулярных событий, связанных с нарушением цикла Кеннеди в нейронах, в ходе которого происходит окисление мембранных фосфолипидов до фосфатидилхолина. Последующие нарушение липолиза, поступление Ca²⁺ в цитозоль, активация протеинкиназы С и перекисного окисления липидов (ПОЛ) являются следствием ишемии [2—4]. Активные формы кислорода приводят к повреждению фосфолипидного бислоя мембран, вызывают модификацию белков, ферментов, рецепторных комплексов, ионных каналов [3].

Свободнорадикальное окисление в норме является частью адаптационного процесса, направленного на поддержание клеточного гомеостаза, в ходе которого осуществляются регуляция проницаемости мембран, рецепции нейромедиаторов, ферментативного катализа, однако, при гипоксии мозга именно окислительный стресс является ключевым звеном патологического каскада [3—5].

Массивное накопление в цитоплазме ишемизированных клеток Na⁺, Ca²⁺ и АДФ приводит к чрезмерному образованию кислородных радикалов в митохондриях и нарушению функционирования в них электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) [4]. Это ведет к развитию отека и разрушению органелл, потере целостности мембраны и некротической гибели клеток [2].

Развивающаяся энергетическая недостаточность приводит к быстрой потере АТФ и неконтролируемой утечке ионов через клеточную биомембрану. В результате развивается деполяризация мембраны и высвобождение нейротрансмиттеров — глутамата и дофамина [5, 6]. Избыточная стимуляция рецепторов глутамата приводит к активации фосфолипаз [2, 7]с последующим гидролизом фосфолипидов фосфолипазой А₂ и высвобождением арахидоновой кислоты [8], в результате чего образуются гидропероксиды и пероксильные радикалы (рис. 1). Финалом этих процессов является апоптотическая или некротическая гибель клеток [9].

Исследования на моделях инсульта показали, что применение препаратов с нейропротективным действием способствует снижению тяжести повреждения мозговой ткани и улучшению функционального исхода даже при введении их через несколько часов после развития острой ишемии [10,11].

Широко обсуждаются нейропротективные, в том числе антиоксидантные, свойства 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцината (ЭМГПС) и цитиколина при острой и хронической ишемии головного мозга (ХИМ) [12—14]. ЭМГПС является производным пиридина и представляет собой комбинацию двух молекул эмоксипина и янтарной кислоты [12, 15—17]. Имея структурное сходство с пиридоксином, облегчает внутриклеточное проникновение янтарной кислоты, способствуя восстановлению энергопродуцирующей функции митохондрий путем восстановления функционирования цикла Кребса и синтеза АТФ (рис. 2). В результате антиоксидантного эффекта пиридина снижается образование супероксид-анион-радикала (O₂^–), образующегося при преобразовании молекулы кислорода в O₂^– электронами, высвобождающимися из комплексов I и/или III ЭТЦ митохондрий [12]. Снижение образования O₂^– происходит при прямом перехвате ЭМГПС, а также при активации супероксиддисмутазы (СОД). При этом не происходит взаимодействия O₂^– с монооксидом азота (NO), результатом которого является образование нерадикального, но цитотоксичного пероксинитрита.

Пероксинитрит, повреждая мембраны митохондрий, ведет к развитию митохондриальной дисфункции, при которой увеличивается синтез O₂^–, что замыкает порочный круг повреждения. В дальнейшем пероксинитрит разрушается, образуя радикал гидроксила (НO) [12]. Показано, что ЭМГПС, подавляя процессы ПОЛ в клеточных мембранах, повышает резистентность липопротеиновых комплексов [18]. Антиоксидантные свойства ЭМГПС обусловлены не только прямым перехватом активных форм кислорода (АФК) и активацией СОД, но и хелатированием металлов переменной валентности (см. рис. 2).

В отличие от таких природных или синтетических ингибиторов свободнорадикальных реакций, как α-токоферол, каротиноиды, флавоноиды, пробукол и др., представляющих собой гидрофобные соединения и взаимодействующих со свободными радикалами в гидрофобной зоне биомембран, действие ЭМГПС осуществляется преимущественно в водной фазе [19]. Установлено, что он обладает антиокислительными и мембранопротекторными свойствами [12]. ЭМГПС способен снижать вязкость биомембран, увеличивать ее текучесть и восстанавливать конформацию мембранных белков, повышая липид-белковое соотношение и оказывая стабилизирущее действие на биомембраны [12, 14, 17]. В ходе этих изменений восстанавливается работа ионных насосов, нормализуется электрохимический потенциал мембран, восстанавливается активность мембранно-связанных ферментов (см. рис. 1). Торможение активации внутриклеточной сигнальной системы (снижение внутриклеточного каскада активации прокаспаз-1, 2, 3, 6, 8 и уровня экспрессии каспазы-3) предотвращет развитие апоптоза (рис. 1). Восстанавление работы цикла Кребса и трансмембранного транспорта ионов, ЭМГПС предотвращает выход во внеклеточное пространство глутамата и развитие эксайтотоксичности.

Цитиколин представляет собой экзогенную форму цитидин-5’-дифосфохолина (ЦДФ-холин) — важнейшего интермедиата в образовании фосфатидилхолина (см. рис. 2) [20]. Основу ЦДФ-холина составляют рибоза, пирофосфат, цитозин и холин. Цитидин, являясь компонентом РНК в цитоплазме, претерпевает превращение в цитидинтрифосфат. Холин под действием холинкиназы фосфорилируется до фосфорилилхолина, который в дальнейшем трансформируется в цитихолин. Далеее цитихолин, взаимодействуя с диацилглицерином, в присутствии холин-фосфотрансферазы преобразуется в фосфатидилхолин [21, 22]. Снижая, но не подавляя активность фосфолипазы А₂, цитихолин восстанавливает содержание арахидоновой кислоты фосфатидилхолина, что способствует стабилизации мембран. Таким образом, цитиколин, осуществляет репарационные процессы в биомембранах. Стабилизация мембраны приводит к увеличению скорости связывания СОД с субстратами и повышению ее активности [22].

Способствуя аккумуляции на мембране клетки главного неферментного компонента антиоксидантной системы — α-токоферола, цитиколин приводит к снижению образования гидропероксидов жирных кислот и соответствующих пероксильных радикалов, участвующих в генерации окислительно-модифицированных фосфолипидов (oxPL) [23]. oxPL повреждают структуру ионных каналов, способствуя неконтролируемому входу в клетки Са²⁺ и Na⁺, активации NO-синтазы, образованию АФК и стимуляции внутриклеточной сигнальной системы. Активация последней и ингибирование протеасом провоцируют развитие клеточной смерти [21, 24]. Кроме того, окислительно-модифицированные фосфолипиды вызывают поверхностную экспрессию молекул адгезии ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина на поверхности эндотелиальных клеток, адгезию нейтрофилов, агрегацию тромбоцитов, способствуя развитию воспаления.

Блокируя образование oxPL путем снижения активации фосфолипазы А₂ и восстановления активности митохондральной АТФазы, мембраной Na⁺/K⁺ — АТФазы, цитиколин реализует антиоксидантные свойства. Высвобождающийся из цитихолина холин способен метаболизироваться до глутатиона (GSH), который является одним из основных эндогенных антиоксидантных компонентов защиты в головном мозге, осуществляет удаление перекиси водорода и липидных пероксидов и предотвращает инактивацию глутатионредуктазы (GSSG) [25].

ЭМГПС и цитиколин реализуют свои эффекты на разных уровнях ишемического каскада [25]. Кроме того, протекание реакции триметилирования азотсодержащих соединений холином происходит в присутствии витаминов группы В, в том числе и В6, структурным аналогом которого является ЭМГПС [26], что позволяет думать о взаимодополняющем действии указанных препаратов.

В литературе отсутствует анализ эффективности комбинированного применения нейропротективных средств, действующих как в липидной, так и в водной фазах, в частности ЭМГПС и цитиколина. Целесообразность такой комбинации обусловлена различными точками приложения препаратов.

Цель исследования — изучение антиоксидантного статуса у больных с ХИМ на фоне применения ЭМГПС (нейрокс) и его комбинации с цитиколином (нейпилепт).

В исследование включены 40 больных, 18 мужчин и 22 женщины в возрасте от 54 до 72 лет. У этих больных была диаогностирована ХИМ в стадии декомпенсации на фоне гипертонического криза и/или нарушения сердечного ритма. Все они были госпитализированы в неврологическое отделение Городской больницы 56 Москвы.

Основными этиологическими факторами ХИМ у больных были артериальная гипертония — у 26% больных, атеросклероз — у 22%, сочетание артериальной гипертонии и атеросклероза — у 44%, мерцательная аритмия — у 8%. В исследование не включались пациенты с сахарным диабетом 1-го и 2-го типов, перенесшие инсульт, имеющие степень снижения когнитивных функций до уровня деменции, с острыми или хроническими воспалительными заболеваниями в стадии обострения, онкологическими заболеваниями.

После подписания информированного согласия, обследования и верификации диагноза, больные методом случайной выборки были распределены на две группы в зависимости от схемы лечения. В 1-ю группу, состоящую из 20 больных, в дополнение к базовой схеме лечения с индивидуально подобранной этиотропной терапией антигипертензивными, антиаритмическими, антиагрегантными, антикоагулятными препаратами, был включен ЭМГПС (нейрокс, «сотекс» Россия) по 500 мг ежедневно внутривенно на 200,0 мл физиологического раствора в течение 14 дней. 2-я группа — 20 больных в дополнение к базовой терапии получала комбинацию нейрокса (в той же дозе) и нейпилепта (цитиколин, «сотекс», Россия) по 1000 мг (4,0 мл) ежедневно, внутривенно струйно в течение 14 дней. Группы не различались по возрасту, гендерному составу и частоте выявленной сопутствующей патологии внутренних органов

Для оценки эффективности лечения использовалась шкала оценки неврологического статуса А.И. Федина, краткая шкала оценки психического статуса (MMSE). Исследовались активность СОД, антиокислительная устойчивость плазмы (АОУП), содержание тиоловых (SH) групп для определения количества глутатиона в плазме.

Активность СОД определяли при помощи стандартного набора. За единицу измерения принимали количество фермента, необходимого для проявления 50% дисмутации супероксидного радикала. Активность СОД стандартизировли с использованием цитохрома С и ксантиноксидазы.

АОУП является интегральным критерием оценки функционирования антиоксидантной системы (представлена такими ключевыми ферментами, как СОД, каталаза, глутатионпероксидаза). Для исследования АОУП применяли водорастворимое азотосодержащее соединение [27], которое претерпевает термоиндуцированную деградацию с образованием пероксильных радикалов. Перехват данных радикалов антиоксидантами отражается на степени тушения хемилюминесценции (ХЛ). Измерение АОУП проводили при комнатной температуре на хемилюминометре SMARTLUM 1200 («Interoptika-S», Россия) при постоянном перемешивании образца. Стандартный образец содержал 10 мМ обратный буфер (рН 10,0), 10 мкМ люминола, 100 мкл плазмы разбавленной в 100 раз, 10 мкМ водорастворимого азоинициатора 2,2’-азобис (2-метилпропионамидин) дигидрохлорида. Объем пробы составлял 1000 мкл. Реакцию запускали с добавлением через диспенсер 10 мкМ ААРН. Измеряли интеграл спектра Х.Л. Степень тушения ХЛ рассчитывали как отношение значения интеграла ХЛ в присутствии плазмы к величине интеграла ХЛ в контроле (∫Хл образца/∫Хл контроля). Длительность измерения составляла 10 мин.

SH-группы играют важную роль в мембраностабилизации, обеспечивая транспорт холина в клетки. Окисление SH-групп приводит к нарушению свойств многих белков, важных для функционирования клетки [28, 29]. Концентрация SH-групп отражает концентрацию восстановленного глутатиона — одной из важнейших молекул, содержащих SH-группы, и составляющей большую часть низкомолекулярных тиолов в клетках мозга. Помимо антиоксидантной защиты глутатион опосредует клеточную пролиферацию и апоптоз [30]. Содержание SH-групп определяли спектрофотометрическим методом, измеряя оптическую плотность при длине волны 412 нм [31, 32].

Статистическую обработку результатов проводили при помощи пакета прикладных программ Statistica 6.0, США. Для анализа достоверности различий использовали непараметрический критерий Вилкоксона для двух связанных групп. Достоверными принимали различия при p<0,05.

На фоне проведенного лечения у больных обеих групп отмечено уменьшение жалоб и улучшение общего состояния. Субъективные положительные изменения подтверждались результатами объективной оценки неврологического статуса пациентов по шкале А.И. Федина. В 1-й группе отмечено достоверное снижение выраженности симптоматики с Ме=53 [LQ=60,8; OQ=45,2] до Ме=38 [LQ=42,26; OQ=33,8] баллов (р<0,05); во 2-й группе с Ме=54 [LQ=60,5; OQ=47,5] до Ме=34 [LQ=41,1; OQ=26,9] баллов (р<0,05). Достоверных межгрупповых различий по динамике неврологического статуса не выявлено. Улучшение когнитивных функций по шкале MMSE наблюдалось как в 1-й (от Ме=24,7 [LQ=25,1; OQ=24,3] до Ме=26,4 [LQ=27,2; OQ=25,6]), так во 2-й группах (от Ме=25,1 [LQ=25,4; OQ=24,8] до Ме=27,4 [LQ=27,5; OQ=27,3]; р<0,05).

В обеих группах обнаружено повышение активности СОД на фоне проводимой терапии, но различия по сравнению с исходным уровнем имели место только во 2-й группе (рис. 3).

Исходное количество общих SH-групп в плазме крови не различалось в обеих группах и носило достоверные отличия по сравнению с контролем по критерию Краскелла—Уоллиса (p<0,05) (рис. 4). Данный факт позволяет утверждать, что группы пациентов были подобраны корректно, так как в них количество восстановленных SH-групп достоверно не отличалось и превышало контрольный показатель. После лечения у пациентов 1-й группы обнаружено достоверное увеличение количества восстановленных SH-групп (критерий Вилкоксона, p<0,05), что свидетельствует о влиянии препарата не только на активность СОД, но и другого важного антиоксидантного фермента — глутатионпероксидазы, нивелирующего процессы свободнорадикального окисления. Добавление в схему лечения нейпилепта показало его положительный эффект. Мембраностабилизирующий эффект цитиколина проявляется не только увеличением содержания наиболее распространенной фосфолипидной молекулы клеточной мембраны фосфатидилхолина, но и восстановлением структурных белков, рецепторов и ферментов на ее поверхности, в частности γ-глютамил-транспептидазы, обеспечивающей транспорт антиоксиданта глутатиона из плазмы внутрь клетки [30]. Перехват свободных радикалов глутатионом осуществляется за счет наличия в его составе тиоловых SH-групп. Следовательно, повышение поступления глутатиона из плазмы внутрь клетки будет сопровождаться изменением соотношения тиоловых групп в клетке и плазме, что и было обнаружено у пациентов 2-й группы. У 50% пациентов 2-й группы, наблюдалось уменьшение абсолютных значений измеряемой величины в плазме (рис. 5), у остальных больных этой группы количество SH-групп в плазме оставалось без изменений.

Таким образом, комбинированная терапия — нейрокс и нейпилепт — демонстрирует антиоксидантное действие двух препаратов. Со стороны нейрокса — увеличение активности СОД и глутатионпероксидазы, со стороны нейпилепта — восстановление структуры поврежденных мембран и увеличение уровня внутриклеточного глутатиона вследствие репаративных процессов.

О согласованности антиоксидантного действия двух препаратов свидетельствуют результаты измерения интегрального критерия оценки функционирования антиоксидантной системы организма АОУП (см. рис. 5). Во 2-й группе при измерении АОУП регистрировалось достоверное снижение интенсивности ХЛ после лечения по сравнению с 1-й группой, которое выражалось в уменьшении значений светосуммы и степени тушения ХЛ.

Результаты комбинированного применения нейрокса и нейпилепта в лечении больных с ХИМ показали синергизм нейропротективного (антиоксидантного) потенциала и целесообразность их совместного применения. В плазме больных после комбинированного лечения наблюдалось достоверное увеличение активности СОД, в отличие от изолированного применения нейрокса. Измерение антиокислительной устойчивости плазмы методом показало достоверное снижение степени тушения ХЛ при комбинированном лечении, указывающее на усиление антиоксидантного эффекта путем активации глутатионовой антиоксидантной системы.

Измерение восстановленных SH-групп у больных, получавших нейрокс, показало достоверное увеличение их количества. При применении комбинированной терапии были получены данные, указывающие на увеличение мембранопротективного действия комплекса препаратов.

Полученные результаты связаны с различными точками приложения данных препаратов при ишемии. В ходе комбинированного лечения антиоксидантный потенциал комбинации нейпилепта и нейрокса увеличивается за счет усиления синтеза глутатиона и глутатионредуктазы и повышения активности СОД (вклад нейпилепта и нейрокса) [33], что выражается в достоверном снижении интенсивности ХЛ, в отличие от монотерапии нейроксом.

В заключении важно отметить, что поиск оптимального антиоксидантного средства, несмотря на более чем тридцатилетнюю историю изучения роли свободнорадикальных процессов в патогенезе различных заболеваний, продолжается. Результаты экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о большей терапевтической эффективности комплексного применения нескольких антиоксидантов с различными механизмами действия.

Принимая во внимание существующие представления о патогенезе ХИМ, с одной стороны, и требования доказательной медицины к лекарственным препаратам, с другой, перед практическим врачом стоит серьезная задача обоснования выбора и использования лекарственных средств, поскольку в зарубежной литературе и в рекомендациях по лечению неврологических заболеваний отношение к нейропротективной терапии неоднозначное. Хотя проведенные ранее исследования эффективности нейропротективных стратегий продемонстрировали противоречивые результаты, мнение экспертов склоняется в пользу продолжения испытаний, признавая в конечном итоге перспективность и целесообразность такого поиска [34].

Решение проблемы выбора и использования лекарственных средств видится с позиций осмысления результатов научных исследований и собственного клинического опыта. Результаты представленного исследования указывают на целесообразность использования изученных препаратов у больных с ХИМ. Дальнейшее изучение влияния этих соединений на параметры антиоксидантного статуса клетки при ишемическом повреждении (изменение концентрации глутатиона, α-токоферола, активности глутатионредуктазы), а также сравнение их мембранопротективного потенциала перспективно.