Известно, что тромбоциты активно используются как модельная система для исследования метаболизма нейромедиаторов, особенно серотонина в мозге больных шизофренией [1-4]. Было установлено, что состояние метаболических процессов, в частности серотонинового, сопряжено с ультраструктурными изменениями тромбоцитов. Так, в исследовании А.И. Киктенко и соавт. [5] связь активации тромбоцитов с биохимическими показателями состояния серотониновой системы была показана методом сканирующей электронной микроскопии. О.С. Брусов и соавт. [6] выявили нарушения обмена тромбоцитарного серотонина (ТС) у больных шизофренией в процессе лечения оланзапином.

Оланзапин является атипичным антипсихотиком, блокирующим в большей степени серотониновые (5-НТ2), чем дофаминовые (D2) рецепторы [7]. В работе П.Д. Бонарцева и соавт. [8] было показано, что у больных шизофренией до лечения оланзапином было повышено содержание функционально активированных - вакуолизированных тромбоцитов (ВТ) по сравнению с контрольной группой без психической патологии. При этом процентное содержание ВТ коррелировало с содержанием ТС не только у больных до лечения, но и при 8-недельном лечении оланзапином. При депрессии у больных до лечения также была выявлена вакуолизация тромбоцитов [9]. Однако остается неясным, как влияет оланзапин на ультраструктуру тромбоцитов, в частности содержание в них гранул и вакуолей, которое как и образование псевдоподий, отражают функциональное состояние этих клеток.

Плотные гранулы в тромбоцитах содержат серотонин, ионы кальция, АДФ, АТФ, гистамин и норадреналин [10]. Во время активации тромбоциты освобождают содержимое своих гранул в открытую каналикулярную систему (ОКС), состоящую из канальцев и вакуолей, через которую оно выделяется в плазму крови. При активации тромбоцита численная плотность гранул, содержащих серотонин, снижается, а вакуоли ОКС расширяются и повышается их численная плотность [10] (рис. 1).

Цель исследования - изучение влияния лечения больных шизофренией оланзапином на ультраструктуру гранулярных тромбоцитов (ГТ) и ВТ с оценкой содержания в них гранул и вакуолей, а также установление связи между ультраструктурой тромбоцитов, содержанием в них ТС и эффективностью терапии.

Обследовали 49 больных хронической (приступо­образно-прогредиентная) шизофренией (МКБ-10: F 20.02, F 20.22). Их полная характеристика была дана в предыдущей публикации [8].

В контрольную группу вошел 31 соматически и психически здоровый.

Больных лечили антипсихотическим препаратом оланзапином (зипрекса). Кровь для исследования брали до лечения, через 8 и 28 нед терапии. Критерием позитивного ответа на лечение в течение 8 нед приема оланзапина служило 20% снижение общего числа баллов по шкале позитивных и негативных симптомов шизофрении по общей шкале PANSS. Соответственно этому критерию все больные были разделены на позитивно ответивших на лечение (респондеры) и резистентных к лечению пациентов (нонреспондеры). Респондеров было 38 (66,6%), нонрес­пондеров -19 (33,3%).

Популяцию тромбоцитов исследовали в контроле, у больных до лечения и затем повторно - через 8 и 28 нед лечения оланзапином.

Препарат клеток периферической крови для трансмиссионной электронной микроскопии готовили следующим образом: венозную кровь с гепарином брали у пациентов в стерильную коническую пробирку и выдерживали под наклоном в течение 60 мин. Затем отбирали верхний слой лейкоцитов и центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин, удаляли плазму, а осадок клеток заливали фиксатором - 2,5% раствором глутаральдегида в 0,1 М фосфатном буфере (ФБ) (рН 7,2-7,4), промывали в этом буфере, после чего дофиксировали в 1% растворе четырех­окиси осмия в 0,1 М буферном растворе в течение 60 мин. Далее осадок клеток отмывали в буфере и заливали 4% агаром в 0,1М ФБ, выдерживали при 50 °С 30 мин, охлаждали, извлекали застывший агар с осадком клеток, нарезали на кусочки с последующим осуществлением стандартной процедуры обезвоживания и заливки в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы получали на ультратоме ЛКБ (Швеция), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе Филипс EM-210 (Нидерланды). Полученный электронно-микроскопический препарат содержал в достаточном количестве все клетки крови: лимфоциты, эритроциты, гранулоциты, моноциты, тромбоциты, а также макромолекулярные компоненты плазмы крови, находящиеся между клетками.

Для морфометрических измерений получали по семь электронно-микроскопических фотографий ГТ и ВТ от каждого обследованного. С помощью стереологических тест-сеток [11] были измерены площадь тромбоцитов, объемная фракция (Vv) гранул и вакуолей в ГТ и ВТ. Эти показатели выражались в %. Подсчитывали также число псевдоподий (выросты цитоплазмы), гранул и вакуолей в ГТ и ВТ.

Кровь для определения ТС брали из локтевой вены утром натощак в пластмассовые флаконы, содержащие стандартный цитратный антикоагулянт (1:10 - соотношение объема антикоагулянта к объему крови) до начала лечения, через 8 и 28 нед после лечения оланзапином. Содержание ТС определяли микрофлуорометрическим методом на спектрофлуориметре Хитачи-850 при волне возбуждения, равной 335 нм, и волне испускания, равной 350 нм. Детали определения и расчета содержания ТС описаны в нашей предыдущей работе [12]. Подсчет тромбоцитов в плазме, обогащенной тромбоцитами, осуществляли с помощью фазоконтрастирования поля зрения на микроскопе AXIO Imager M1 (Германия).

Статистический анализ проводили, используя статистическую программу Statistica, версия 7 («Statsoft Inc.», США). Групповые различия у больных до лечения с контролем - с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Различия между группами до лечения и леченных в течение 8 и 28 нед оценивали с помощью метода дисперсионного анализа с повторными измерениями c последующим апостериорным сравнением групп (post hoc Duncan тест). Для исследования статистической значимости связей между содержанием ТС и объемными фракциями вакуолей или гранул в цитоплазме (ВТ) использовали ранговые корреляции по Спирмену R и &khgr;²-тест.

Для исследования морфометрических параметров субпопуляций тромбоцитов как предикторов времени наступления позитивного результата лечения больных (время, когда снижение PANSS total становится больше 20% (Hazard point) использовали пропорциональную регрессию Кокса (Proportional hazard Cox regression) в модуле Statistica, версия 7 «Анализ времени событий» (Survival Analysis).

Статистический анализ показал, что по всем морфометрическим показателям эти субпопуляции тромбоцитов у больных не отличаются от контроля. Однако применение метода дисперсионного анализа с повторными изменениями и последующим апостериорным сравнением позволило установить некоторые особенности реакции ГТ и ВТ в связи с лечением.

Начнем с ГТ: их общая площадь, число и Vv гранул в процессе лечения не менялись. Что касается вакуолей, то их Vv до лечения составляла 3,41±0,96, после 8 нед лечения - 3,09±0,90 и после 28 нед - 3,70±1,10, т.е. имело место достоверное повышение этого показателя после 28 нед лечения по сравнению с 8 нед (+16%, F (2,96)=3,14; р<0,01). Число вакуолей в ГТ у больных до лечения было 5,06±1,66, после 8 нед - 4,45±1,45 и после 28 нед - 5,53±1,95 и повышалось у больных после 28 нед лечения по сравнению с больными после 8 нед (+24%; р<0,01). Число псевдоподий в ГТ больных до лечения было 2,98±0,8, после 8 нед - 3,06±0,84 и после 28 нед - 2,65±0,80. Таким образом, по этому показателю также выявлено (F (2,96)=4,7) снижение у больных после 28 нед лечения по сравнению с больными до лечения (–11%; р<0,05) и у леченных в течение 28 нед по сравнению с леченными в течение 8 нед (–13%; р<0,01).

Статистически значимые различия в связи с лечением были выявлены также при изучении ВТ больных шизо­френией. Vv гранул до лечения была 7,66±2,28, после 8 нед - 6,94±1,61 и после 28 нед - 6,69±1,57. Этот показатель был на 13% ниже у больных при 28-недельном лечении по сравнению с больными до лечения (F (2,96)=5,6; р<0,05) (рис. 2).

В крови больных хронической шизофренией содержание ТС у больных до лечения было достоверно (p=0,024) снижено относительно контроля: 4,66±3,11 и 6,1±1,5 нмоль/10⁹ соответственно.

После 8 нед лечения у больных уровень ТС повышался. Так, содержание ТC после 8 нед лечения у больных (n=53) достоверно возросло с 4,66±3,11 до 5,79±2,2 нмоль/10⁹ тромбоцитов (p=0,034). При этом содержание ТС после 8 нед лечения (острый период) уже достоверно не отличалось от нормальных значений (p=0,7).

Апостериорное групповое сравнение показало, что содержание ТС у больных в поддерживающий период лечения между 8 и 28 нед лечения достоверно не изменялось (6,77±3,96 и 5,79±2,2 нмоль/10⁹ тромбоцитов, после 8 и 28 нед лечения; p=0,22) и не отличалось от нормальных значений (р=0,38).

Была исследована корреляционная связь между показателями объемных фракций вакуолей (Vv) в цитоплазме ВТ, Vv гранул в цитоплазме ВТ, а также числа гранул в цитоплазме ВТ и ТС в инициальный период исследования (до лечения), через 8 и 28 нед лечения. Статистический анализ показал наличие только одной достоверной корреляции по Спирмену между Vv вакуолей в ВТ и ТС до лечения (r=0,26; p=0,04). Также было показано наличие положительной корреляции связи между повышениями этих показателей через 8 нед лечения (r=0,27; p=0,016).

На втором этапе для оценки достоверности связи между выявленными корреляциями нами был использован критерий оценки силы связи - &khgr;²-тест. Для этого пациенты в контрольных точках до лечения, дихотомически были разбиты на группы с высокими и низкими значениями параметров (относительно медианного значения в группе) Vv вакуолей в ВТ и ТС. Затем была сформирована кросстабуляционная таблица, по которой с помощью &khgr;²-теста определялась достоверность связи между сравниваемыми группами больных. Анализ таблицы показал что величина &khgr;²-теста равна 6,2; p=0,013.

При использовании пропорциональной регрессии Кокса были выявлены два достоверных предиктора (Pr) времени наступления позитивного эффекта лечения: 1) Рr1 - число вакуолей в ВТ, 2) Pr2 - Vv вакуолей в ВТ. Для предиктора Pr1 регрессионный коэффициент бета оказался равен 0,20 (t-value=3,79, p<0,05), т.е. выявлен как достоверный предиктор. Для предиктора Pr2 регрессионный коэффициент бета =0,17 (t-value=2,81, p<0,05), т.е. также выявлен как достоверный предиктор. Константа регрессии была равна –2,25 (t-value= –2,0, p=0,05). Значение &khgr;² как тест на качество модели (Chi-square goodness-of-fit) был равен 18,69 (p<0,00009). Таким образом, качество модели свидетельствует о правильности выявления предикторов терапии. Два полученных достоверных предиктора имеют позитивную связь с временем наступления позитивного ответа пациентов на лечение: чем больше значения параметров, тем больше времени требуется для возникновения позитивного клинического ответа на лечение больных оланзапином.

Предыдущее исследование, проведенное П.Д. Бонарцевым и соавт. [8], показало, что длительное лечение олан­запином связано со снижением процента ВТ, повышенного у больных шизофренией до лечения. Процент ВТ позволил оценить уровень активации тромбоцитов в целом. В настоящем исследовании были показаны изменения ультраструктуры отдельных субпопуляций ГТ и ВТ при лечении оланзапином на той же выборке и в тех же условиях. Такие оцениваемые параметры, как площадь тромбоцита и количество псевдоподий (выросты цитоплазмы), отражают активацию этих клеток. В проведенном исследовании было установлено, что, несмотря на отсутствие отличий от контроля (здоровые) в средних значениях площади тромбоцита, числа псевдоподий, Vv и числа гранул и вакуолей в ГТ и ВТ у больных шизофренией до лечения, была выявлена динамика ультраструктурных показателей ГТ и ВТ в процессе лечения оланзапином.

Известно, что при активации тромбоцита численная плотность гранул, содержащих серотонин, снижается, а вакуоли ОКС расширяются и повышается их численная плотность [10]. В нашем исследовании мы показали достоверное снижение числа и Vv гранул только в ВТ, но не в ГТ через 28 нед лечения по сравнению с больными до лечения. При этом число гранул в ВТ снижалось на 16% уже при 8 нед лечения и оставалось сниженным на 16% через 28 нед лечения. Vv гранул в ВТ снижалась на 13% к 28 нед лечения по сравнению с больными до лечения. Что касается вакуолей, то их Vv и число были повышены в ГТ через 28 нед лечения по сравнению с 8 нед, а в ВТ достоверно повышалась их Vv (на 13%) через 28 нед лечения по отношению к больным до лечения. При этом важно, что увеличение содержания вакуолей в тромбоците свидетельствует о более активном процессе секреции содержимого гранул [10]. И это наблюдается как у менее активированных ГТ, так и у более активированных ВТ. Следовательно, процесс повышенной вакуолизации - секреции тромбоцитов больных хронической шизофренией не останавливается в процессе лечения оланзапином. В связи с этим представляют интерес данные о Vv вакуолей ВТ у респондеров и нонреспондеров до лечения - у последних она выше на 11%.

Что касается других показателей активации тромбоцитов, то следует обратить внимание также на псевдоподии. Несмотря на то что площадь тромбоцитов не менялась, количество псевдоподий достоверно снижалось в ГТ на 11% при лечении в течение 28 нед по сравнению с 8 нед и на 13% в ВТ в конце лечения по сравнению с 8 нед и с больными до лечения.

Таким образом, полученные данные отражают снижение активации ГТ и ВТ при лечении оланзапином, что согласуется с данными предыдущей работы о снижении доли ВТ к 28-й неделе лечения [8], а также представления о том, что при активации тромбоцита численная плотность гранул, содержащих серотонин, снижается, а вакуоли ОКС расширяются и повышается их численная плотность [10]. Однако при этом в ГТ увеличиваются число и Vv вакуолей. В ВТ число и Vv гранул уменьшаются и соответственно увеличивается Vv вакуолей. С другой стороны, в нашей предыдущей работе [8] показано, что доля ВТ у больных до лечения оланзапином была на 157% выше контроля и в процессе лечения она снижалась до контрольного уровня. Была также установлена отрицательная корреляционная связь между содержанием ВТ и ТС. Можно предположить, что оланзапин избирательно снижает содержание ВТ в популяции тромбоцитов, например путем снижения их резистентности [13] и при этом не влияет на процесс вакуолизации ГТ и ВТ.

Гранулы и вакуоли, которые оценивались в нашей работе, естественно, не могут полностью характеризовать цитоплазму тромбоцита, и не исключено, что имеются и другие признаки функционального состояния этих клеток, которые требуют изучения. Возможно, они позволят объяснить некоторые различия в изменении числа псевдоподий и вакуолей, являющихся признаками активации.

Статистический анализ показал наличие одной достоверной корреляции по Спирмену - между Vv вакуолей в ВТ и ТС до лечения. Было также показано наличие положительной корреляции связи между повышениями этих показателей через 8 нед лечения. Отсутствие связи между параметрами после 8 нед лечения связано, по-видимому, с нормализацией изучаемых показателей после окончания лечения.

В настоящей работе впервые установлена достоверная позитивная связь числа и Vv вакуолей в ВТ с временем наступления позитивного ответа пациентов на лечение: чем больше значение этого показателя, тем больше времени требуется для возникновения позитивного клинического ответа на лечение больных оланзапином. Эти результаты согласуются с данными предыдущих исследований О.С. Брусова и соавт. [6, 14] о том, что содержание ТС связано как с клиническими симптомами шизофрении, так и резистентностью к терапии у больных шизофренией при лечении оланзапином. Они также указывают на важную роль структурной перестройки тромбоцитов в предикции терапевтической эффективности при лечении больных шизофренией.