Черное вещество (substantia nigra, SN) - главный дофаминергический центр головного мозга, поражающийся при таком распространенном нейродегенеративном заболевании, как болезнь Паркинсона (БП), причины которого и соответственно способы лечения интенсивно исследуются [1, 2]. Помимо обилия дофамина, SN выделяется среди других нервных центров высокой концентрацией железа (одна из самых высоких в головном мозге) [12]. Ионы железа, являясь в организме незаменимыми участниками катализа окислительно-восстановительных реакций и биоэнергетических процессов, в нервной системе участвуют в транспорте кислорода, переносе электронов в дыхательной цепи, образовании миелина, синтезе моно­аминов (будучи кофакторами тирозин- и триптофангидроксилазы) [16].

При нейродегенеративных заболеваниях (БП, болезнь Альцгеймера - БА, боковой амиотрофический склероз и др.) отмечено увеличение концентрации железа в отдельных структурах головного мозга [8, 15], в частности в SN при БП. Однако неизвестно, является ли этот феномен сопутствующим патологическому процессу или предшествует развитию заболевания, играя каузальную роль. Несмотря на многочисленные исследования ионов железа в SN в норме и при патологических процессах, остается неясным, в каких клетках и внутриклеточных структурах концентрируется в SN не связанное с гемом железо. Существует определенная неясность и в вопросе о форме существования негемового железа в тканях после фиксации [13]. Не исключено, что при фиксации мозга в водной среде может происходить потеря части слабо связанного с белками железа, однако до настоящего времени неизвестно, влияет ли этот процесс на результаты гистохимического выявления железа в субклеточных структурах.

Цель работы - микроанатомическое изучение распределения не связанного с гемом железа (Fe III) в SN головного мозга человека с использованием современного варианта гистохимического метода Перлса и особых условий подготовки материала, обеспечивающих сохранность железа в тканях.

В работе был использован аутопсийный материал головного мозга человека - 7 мужчин в возрасте 27-58 лет без неврологических и психических заболеваний. Для устранения возможного негативного влияния фиксации на сохранность водорастворимых комплексов железа материал фиксировали в обезвоживающем фиксаторе, цинк-этанол-фор­маль­дегиде [3], в течение 24 ч. После этого материал проводили через 96% и абсолютный этанол и заливали в парафин по общепринятой методике. На санном микротоме Leica SM2000 («Leica», Германия) готовили последовательные срезы толщиной 5 мкм, которые наклеивали по два на каждое предметное стекло. Выявление железа осуществляли при помощи реакции Перлса. Перед постановкой реакции один из срезов на каждом предметном стекле обрабатывали 3% раствором перекиси водорода в течение 10 мин при комнатной температуре. Для повышения чувствительности реакции применяли метод усиления диаминобензидином (DAB) [13]. Рабочий раствор DAB готовили, используя реагенты из набора Reveal Polyvalent HPR DAB Detection System («Spring Bioscience», США). Анализ и фотосъемку препаратов выполняли, используя микроскоп Leica DM750 и фотокамеру ICC50 («Leica», Германия).

По программе настоящего исследования было получено положительное заключение этического комитета Научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН.

На всех изученных препаратах в области SN отчетливо определялась положительная реакция на железо. Кроме SN, реакция на железо на всех изученных срезах была обнаружена в красном ядре - Nucleus ruber (NR), которое анатомически тесно связано с SN (рис. 1).

Сравнение интенсивности и характера распределения продукта гистохимической реакции на соседних срезах (один из которых был обработан перекисью водорода) показало, что во всех изученных случаях, кроме одного (мужчина 43 лет), непродолжительное влияние перекиси водорода приводило к увеличению интенсивности гистохимической реакции (см. рис. 1).

Сопоставление интенсивности реакции в SN и NR показало, что интенсивность реакции в этих структурах совпадала в 3 случаях, в 1 - более интенсивно было окрашено NR, а в оставшихся - SN. Не было обнаружено различия в интенсивности реакции в зависимости от возраста. У лиц более молодого возраста (27 и 28 лет) в SN определялось неравномерное распределение окраски - между яркоокрашенными слоями четко выделялся более светлый участок (рис. 2), в котором располагались группы нейромеланинсодержащих нейронов компактной части SN.

Изучение препаратов под большим увеличением микроскопа показало, что продукт гистохимической реакции в области SN распределен неодинаково. Существуют области относительно равномерной окраски нейропиля без четкой приуроченности к отдельным клеткам. Однако по ходу кровеносных сосудов часто отмечается усиление реакции с формированием зон повышенного содержания железа, распространяющихся периваскулярно на 30-50 мкм. Некоторые из них представляют собой крупные периваскулярные скопления железа (по-видимому, отложения гемосидерина в периваскулярных макрофагах).

В отдельных препаратах распределение окраски в компактной части SN носило «пятнистый» характер. Это было связано с локализацией железа в нервных и глиальных клетках и вокруг них. Было обнаружено, что в части нейромеланинсодержащих нейронов железо локализуется преимущественно в ядре и ядрышке. Причем в 3 случаях (мужчины 27, 43 и 48 лет) в области ядра крупных нейронов реакция была столь интенсивной, что делала неразличимым ядрышко. В других случаях яркоокрашенное ядрышко отчетливо контурировалось на фоне неокрашенного хроматина ядра (рис. 3).

Проведенное исследование выявило наличие большого количества негемового железа в SN и прилежащем к нему NR. Обе структуры мозга играют важную роль в регуляции движения [11], а количество железа, как было показано ранее, увеличивается при нейродегенеративных заболеваниях [15]. Предполагается, что нарушение гомеостаза железа в ЦНС ведет к окислительному стрессу, образованию высокореактивных свободных радикалов, нарушению целостности клеточных мембран и, в конечном итоге, дегенерации нервных клеток [17]. Именно этот процесс, по-видимому, лежит в основе нейродегенерации, наблюдающейся при БП, БА, боковом амиотрофическом склерозе и некоторых других заболеваниях [8].

При визуализации негемового железа в SN было выявлено его неравномерное распределение: оно было обнаружено, как в нейропиле, так и внутри нервных и глиальных клеток. Следует заметить, что данные литературы по вопросу о локализации железа в SN неоднозначны. Одни исследователи описали наличие железа в глиальных и нервных клетках SN крысы [18], а в нейронах SN здоровых и страдающих БП людей особенно интенсивная гистохимическая реакция отмечалась в нейромеланине [6]. В то же время другие авторы [9] отмечали интенсивную гистохимическую окраску на железо в пучках волокон ретикулярной, но не компактной зоны SN, а выпадение преципитата в пигментированных нейронах компактной части расценивалось (учитывая крупногранулярный характер осадка) как интенсификация эндогенного пигмента. Наконец, по другим данным, продукт гистохимической реакции на железо в SN был выявлен преимущественно в олигодендроцитах и небольшом числе непигментированных нервных клеток мозга человека и крысы [5, 19], а железо в меланинсодержащих нейронах SN было обнаружено только у людей, страдающих БА [7]. Очевидно, что причины имеющихся расхождений результатов кроются в различии использованных модификаций одного и того же метода и требуют дополнительного анализа. Вероятно, выявление железа в ядре и ядрышке нейронов SN мозга человека оказалось возможным благодаря использованию особых условий подготовки материала, обеспечивающих сохранность железа в тканях.

Важно отметить, что использование другого способа определения металлов в биологических образцах - рентгеноспектрального микрозондового анализа - доказало наличие железа в нейромеланинсодержащих нейронах SN [10], что подтверждает достоверность полученных нами данных.

В ходе проведенной работы было обнаружено наличие значительного количества ионов железа в ядре и ядрышке нервных клеток. Присутствие железа в ядрышке нервных клеток человека продемонстрировано впервые, ранее его наличие было обнаружено только в ядрышке растительных клеток [14]. Возможно, что наблюдавшееся нами в ядре нейронов железо является составной частью какого-либо железосодержащего белка. Маловероятно, что это - ферритин, который, хотя и был обнаружен в ядрах эмбриональных нейронов и эпителиоцитов роговицы [4], но выявляется редко и в минимальном количестве в нейронах SN, включая и нейромеланинсодержащие нейроны [19]. По-видимому, это некий другой белок, возможно, ассоциированный с белками ядрышка.

Большой интерес с методической точки зрения представляет обнаруженное усиление гистохимической реакции после обработки препарата перекисью водорода. Вероятнее всего, этот феномен связан с переходом имеющегося в ткани двухвалентного железа в трехвалентное под действием пероксида водорода (реакция Фентона): Fe²⁺+H2O2⇒Fe³⁺+OH+OH [13, 17].

В результате этой реакции увеличивается общее количество негемового железа, способного прореагировать при постановке реакции Перлса.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о значительной вариабельности в микроанатомическом и субклеточном распределении железа в SN головного мозга человека, которая лишь отчасти может объясняться возрастными изменениями. Использованные в настоящей работе методические подходы позволили установить неизвестные ранее факты, что свидетельствует о перспективности их применения в дальнейших исследованиях, в том числе касающихся патогенеза нейродегенеративных заболеваний.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект 12-04-31857).