Пространственная организация олигодендроцитов и пирамидных нейронов в передней лимбической коре в норме и при шизофрении (новые возможности компьютерной морфометрии)

Объективный анализ морфологических изменений, наблюдающихся в коре головного мозга человека при психических заболеваниях, возможен только на основе количественных морфометрических исследований гистологических срезов. Ранее, используя морфометрический стереологический метод оптического диссектора, мы выявили [2, 6, 7] снижение численной плотности олигодендроцитов в префронтальной коре при шизофрении. Не меньший интерес представляет выявление возможных изменений в упорядоченности пространственной организации нейронов и глиальных клеток в коре головного мозга. Такие изменения, касающиеся олигодендроцитов, были обнаружены в белом веществе поля 9 префронтальной коры у больных шизофренией [5].

Ручной морфометрический анализ - чрезвычайно трудоемкий и времязатратный процесс, предъявляющий высокие требования к квалификации исследователя. Данные недостатки обычно являются причиной небольшого объема выборки анализируемых изображений препаратов и приводят к низкой достоверности результатов. Автоматизация анализа микроскопических изображений гистологических срезов не только позволяет устранить указанные недостатки ручного метода, но и открывает новые возможности для анализа сложных морфометрических параметров, расчет которых вручную не представляется возможным [3]. Ранее нами [1, 4] на основе подходов, разработанных в Московском государственном техническом университете им. Н.Э. Баумана [3, 4], был предложен алгоритм автоматической сегментации микроскопических изображений олигодендроцитов и пирамидных нейронов на гистологических срезах.

Цель исследования - применение алгоритма автоматической сегментации микроскопических изображений для получения количественных характеристик взаимного расположения пирамидных нейронов и олигодендроцитов в двухмерном пространстве коры головного мозга в норме и при шизофрении.

Морфометрическое гистологическое исследование было проведено на коллекции аутопсийного мозга лаборатории клинической нейроморфологии Научного центра психического здоровья РАМН. Выборку составляли 5 случаев шизофрении и 5 контрольных (без психической патологии).

Для исследования брали тканевые блоки из поля 24 левого полушария головного мозга, которые фиксировали в 10% формалине и заливали в парафин с последующим изготовлением срезов толщиной 20 мкм по общепринятым методам. Из каждого блока методом систематического случайного отбора брали 10 срезов. Срезы окрашивали крезиловым фиолетовым по методу Ниссля и исследовали в световом микроскопе Axio Imager M1 («Carl Zeiss», Германия), оснащенном цветной цифровой камерой высокого разрешения AxioCam MRc5. Цифровые микроскопические изображения поля 24 в слое III регистрировали при увеличении объектива ×20 (размер изображения 0,27×0,27 мкм²). Для каждого из 5 контрольных случаев и случаев шизофрении регистрировали 10 изображений. Таким образом, общее число изображений, подлежащих анализу, было равно 100.

Основными этапами ранее разработанного алгоритма сегментации микроскопических изображений гистологических срезов коры головного мозга являются следующие: 1) переход к полутоновому изображению (для этого используется канал H цветового пространства HSV); 2) автоматическая пороговая бинаризация данного изображения для его разделения на области интереса и фона; 3) сегментация областей интереса на пирамидные нейроны и олигодендроциты с использованием кластеризации по методу k-средних (для этого используется информация об интенсивностях пикселей в цветовых каналах R и G пространства RGB, S пространства HSV, S канала HSI и L пространства Lab).

Результатом автоматической сегментации изображений для решения задачи анализа пространственного расположения олигодендроцитов и пирамидных нейронов являются координаты каждой клетки в плоскости изображения. Пример результата сегментации приведен на рис. 1.

Для анализа численной плотности и пространственного распределения тел олигодендроцитов и пирамидных нейронов в III слое коры (поле 24) по результатам автоматической сегментации изображений проводился расчет следующих четырех количественных характеристик: 1-я - численной плотности олигодендроцитов (число клеток в единице площади); 2-я - численной плотности пирамидных нейронов; 3-я - минимального, среднего и максимального расстояния между парами олигодендроцит - ближайший к нему пирамидный нейрон; 4-я - среднего и максимального расстояния между парами пирамидный нейрон - ближайший к нему олигодендроцит.

Для количественного описания пространственной организации олигодендроцитов и нейронов (в виде кластеров) использовали триангуляцию Делоне, которую проводили, используя в качестве вершин треугольников координаты центров олигодендроцитов (рис. 2, а) или пирамидных нейронов (рис. 2, б).

В случае равномерного расположения клеток на плоскости площади треугольников Делоне различаются незначительно, если же они группируются в кластеры, на изображении наблюдаются треугольники, существенно различающиеся по площади.

Для количественного описания кластеризации клеток на изображении дополнительно рассчитывали еще две характеристики: 5-я - коэффициент вариации площадей треугольников Делоне для олигоцитов; 6-я - коэффициент вариации площадей треугольников Делоне для пирамидных нейронов.

1-я и 2-я из приведенных выше характеристик показывают количество клеток в единице площади, не учитывая их взаимное расположение; характеристики 3-я и 4-я дают информацию о степени близости двух различных типов анализируемых клеток: олигодендроцитов и пирамидных нейронов; характеристики 5-я и 6-я позволяют описать взаимное расположение олигодендроцитов и взаимное расположение нейронов.

Статистический анализ проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Поскольку полученные выборки характеристик не подчинялись закону нормального распределения, для сравнения двух независимых групп применяли критерий Манна-Уитни.

Результаты расчета количественных характеристик и их статистического анализа представлены в таблице.

Было выявлено статистически значимое увеличение численной плотности олигодендроцитов (+10%) и снижение пирамидных нейронов (–12%) при шизофрении. Кроме того, при шизофрении были выявлены следующие статистически значимые изменения взаимного расположения олигодендроцитов и пирамидных нейронов: снижение (–20%) минимального расстояния между олигодендроцитом и ближайшим нейроном и снижение среднего и максимального расстояний (–10 и –9% соответственно) между нейронами и ближайшими к ним олигодендроцитами.

Об изменении пространственного распределения олигодендроцитов и пирамидных нейронов в двухмерном пространстве коры головного мозга свидетельствуют также результаты триангуляции Делоне. Статистически значимое снижение коэффициента вариации площадей тре­угольников Делоне для олигодендроцитов при шизофрении свидетельствует о меньшей степени пространственной кластеризации данных клеток по сравнению с контролем. Подобных изменений в расположении пирамидных нейронов выявлено не было.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что применение метода компьютерной морфометрии для исследования пространственного расположения олигодендроцитов и пирамидных нейронов на микроскопических изображениях гистологических срезов позволяет получить количественные характеристики взаимного расположения данных клеток в двухмерном пространстве коры головного мозга. Использованные в данной работе количественные цитоархитектонические показатели, рассчитываемые по результатам автоматического анализа изображений, позволили охарактеризовать особенности расположения пирамидных нейронов и олигодендроцитов в двухмерном пространстве коры головного мозга в норме и при шизо­френии. Это свидетельствует о перспективности использования компьютерной морфометрии для изучения цитоархитектоники коры головного мозга в норме и патологии.