Ворсанова С.Г.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва; Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва; Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Юров И.Ю.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва; Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва; Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Воинова В.Ю.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва; Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва; Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Куринная О.С.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва; Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва; Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Зеленова М.А.

ФГБУ "Научный центр психического здоровья РАМН", Москва; ФГБУ "Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России", Москва; Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Демидова И.А.

ФГБУ "Научный центр психического здоровья РАМН", Москва; ФГБУ "Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России", Москва; Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Улас Е.В.

ФГБУ "Научный центр психического здоровья РАМН", Москва; ФГБУ "Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России", Москва; Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Юров Ю.Б.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва; Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва; Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Микроделеционные формы синдрома Ретта, выявленные методом молекулярного кариотипирования на ДНК-микро­матрицах (array CGH) у девочек без мутаций в гене MECP2

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2013;113(10): 63-68

Просмотров : 12

Загрузок :

Как цитировать

Ворсанова С. Г., Юров И. Ю., Воинова В. Ю., Куринная О. С., Зеленова М. А., Демидова И. А., Улас Е. В., Юров Ю. Б. Микроделеционные формы синдрома Ретта, выявленные методом молекулярного кариотипирования на ДНК-микро­матрицах (array CGH) у девочек без мутаций в гене MECP2. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2013;113(10):63-68.

Авторы:

Ворсанова С.Г.

Научный центр психического здоровья РАМН, Москва; Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава РФ, Москва; Московский городской психолого-педагогический университет, Москва

Все авторы (8)

Синдром Ретта (СР) относится к редким наследственным (RTT; OMIM 312750) орфанным заболеваниям нервной системы, частота которого составляет от 1:10 000 до 1:15 000. СР - Х-сцепленное заболевание, связанное с нарушением развития ЦНС. Оно чаще встречается у девочек, проявляясь в виде тяжелой умственной отсталости, аутизма, а также эпилепсии [4, 5, 7, 8]. В настоящее время этот синдром рассматривается как самый распространенный и социально значимый. Этиология заболевания связана с мутациями в гене MЕCP2, расположенном на длинном плече хромосомы X в участке Xq28 и кодирующем метил-CpG-связывающий белок 2 (methyl-CpG-binding protein 2, MеCP2) [21, 23]. Этот белок играет ключевую роль в эпигенетической регуляции активности генов ЦНС. Мутации гена МЕСР2 выявляются у большинства (до 90%) индивидуумов c клиническими признаками «классической» формы СР и 55-60% индивидуумов с атипичной клинической картиной СР [3, 6, 8, 9, 20-22, 24, 25, 27].

В литературе [13-15, 17] описано большое число случаев заболевания, при которых наблюдается отсутствие мутаций гена МЕСР2, несмотря на полное соответствие диагностическим критериям СР. СР является, по видимому, генетически гетерогенным синдромом. Помимо гена MECP2 мутации в других генах выявлены у индивидуумов с атипичными формами СР. Среди них мутации в гене FOXG1 (forkhead box protein G1), картированного в участке 14q12, специфические функции которого еще не определены. Предполагается, что этот ген может играть значимую роль в процессе развития мозга и регуляции активности гена МЕСP2 [12, 13, 15, 27].

У девочек с клинической картиной, сходной с СР, и ранней манифестацией судорог выявлены мутации гена CDKL5 (cycline-dependent kinase-like 5), участок 11p13, кодирующего одноименный ядерный белок, который экспрессируется в клетках ЦНС и предположительно участвует в тех же внутриклеточных процессах, что и MECP2. Мутации гена CDKL5 находят у 28% девочек с ранним появлением (в возрасте до 6 мес) инфантильных спазмов [21, 27]. Помимо этого эпигенетические изменения, наблюдаемые при СР и проявляющиеся в виде специфического характера репликации ДНК хромосомы Х, свидетельствуют о наличии патогенетического механизма, характерного для этого заболевания [4, 22, 23, 25, 26]. С другой стороны, при многих моногенных синдромах обнаруживают вариации числа копий последовательностей ДНК (делеции/дупликации), затрагивающие ген целиком, в связи с чем их невозможно обнаружить только с использованием молекулярно-генетических методов для выявления внутригенных мутаций [4, 9, 16, 26]. Более того, в литературе [17] описано несколько случаев субмикроскопических делеций в участке Xq28, затрагивающих ген МЕСР2, у детей с фенотипическими проявлениями классической и атипичной форм CР.

Ранее было проведено [1, 10, 11, 17] молекулярно-цитогенетическое исследование девочек с клиническими проявлениями СР, исследованных ранее с использованием прямого секвенирования кодирующей области, но без мутаций в гене МЕСР2.

Целью настоящего исследования был поиск новых структурных микроаномалий и вариаций числа копий ДНК-генома, которые этиологически и патогенетически могут быть связаны с СР, при использовании технологии молекулярного кариотипирования.

Материал и методы

Обследовали 12 девочек с СР, у которых не было обнаружено мутаций гена MECP2, но при этом клинические проявления у больных соответствовали критериям классической либо атипичной формы рассматриваемого синдрома [1].

Для молекулярного кариотипирования (полногеномное сканирование) была использована серийная сравнительная геномная гибридизация на ДНК-микрочипах (array CGH) [10, 11], содержащих 135 тыс. олигонуклеотидных проб, позволяющих сканировать геном с разрешением 20 тыс. пн и менее. Оценка патогенности обнаруженных вариаций генома проводилась с использованием оригинальной биоинформатической технологии [11]. Для выявления субмикроскопических изменений последовательности ДНК менее 100 000 пн был специально разработан алгоритм обработки данных соотношения интенсивности гибридизационных сигналов проб донора и пациента [11].

Результаты и обсуждение

Приводим краткие сведения о всех 12 пациентах.

Пациент 1. У девочки в возрасте 5 лет наблюдались микробрахицефалия, множественные микроаномалии (выступающая увеличенная нижняя челюсть, большой рот), симптоматическая эпилепсия с конца 1-го года жизни, разнообразные стереотипные движения и сохранные целенаправленные движения рук. Клинический диагноз был сформулирован как атипичная форма СР с ранним началом судорог.

Методом array CGH были обнаружены соматический мозаицизм по делеции в критическом участке микроделеционных синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана (15q11.2), делеция двух экзонов (2-й и 3-й) гена CDKL5 (размер: 18 463 пн), а также делеция в участке 11p13, имеющая отрицательный эффект на функционирование головного мозга в пре- и постнатальном периодах (см. таблицу).

Молекулярный кариотип: arr Хр22.13 (18,519,70318,538,165)×1,11p13(35,140,755-35,377,738)× 1,15q11.2(18,422,770-21,062,213)×3. Таким образом, данный случай был классифицирован как «атипичная форма СР», связанная с интрагенной делецией CDKL5 и мозаичной делецией 15q11.2. Примечательно, что подобные клинические проявления характерны как для синдрома Ангельмана [3, 4, 6], так и атипичной формы СР, связанной с мутациями в гене CDKL5 [21, 27].

Пациент 2. При исследовании 17-летней девушки с клиническим диагнозом «классическая форма СР», у которой методом секвенирования не были выявлены мутации в гене МЕСР2, была обнаружена делеция в участке Xq28, затрагивающая данный ген, а также дупликация двух генов в участке 15q14, ассоциированных с сердечно-сосудистыми нарушениями. Согласно полученным данным, диагноз СР был подтвержден с помощью молекулярного кариотипирования, несмотря на негативные результаты молекулярно-генетического анализа. Молекулярный кариотип: arr Xq28(153,213,483-153,312,854)×1, 15q14(35,024,484-35,127,005)×3. Примечательно, что молекулярно-цитогенетический анализ особенности репликации хромосомы Х (эпигенетический фактор), характерной для СР [22-25], был выявлен нами в данном случае.

Пациент 3. Анализ методом array CGH девочки 6 лет со стертой формой заболевания выявил также делецию в участке Xq28, затрагивающую ген МЕСР2, подтвердив ранее опровергнутый молекулярно-генетическими методами клинический диагноз. Молекулярный кариотип: arr Xq28(153,213,483-153,312,854)×1,11p14.3(22,418,835- 22,683,172)×3. Таким образом, основываясь на данных о пациентах 2 и 3, можно сделать вывод о том, что существуют рекуррентные делеции в данном локусе хромосомы Х, приводящие к СР. В этом случае также была выявлена дупликация гена FANCF, являющаяся фактором риска для возникновения онкологических заболеваний [4, 5].

Пациент 4. Методом array CGH у девочки 7 лет с классической формой СР вариаций числа копий последовательностей ДНК с явным патологическим значением выявлено не было. Молекулярный кариотип: arr (1-22,X)×2. В данном случае нельзя исключать наличие таких необычных мутаций в гене MECP2, как интронные вариации последовательности ДНК или нарушения альтернативного сплайсинга.

Пациент 5. С помощью молекулярного кариотипирования у девочки 8 лет с тяжелой формой СР была обнаружена делеция в участке 3q27.1 (размер 248602 пн), затронувшая 13 генов, среди которых 7 (HTR3D, HTR3C, HTR3E, EIF2B5, DVL3, AP2M1 и ABCC5) связаны с регуляцией различных молекулярных и клеточных процессов в тканях головного мозга. Молекулярный кариотип: arr 3q27.1(183,686,359-183,935,555)×1. Необходимо отметить, что эта делеция обнаружена впервые.

Пациент 6. У ребенка 8 лет с СР-подобным фенотипом методом array CGH была обнаружена делеция 3р13, приведшая к потере 2-5 экзонов (в зависимости от изоформы) гена FOXP1, мутации которого связаны с умственной отсталостью, нарушениями речи и аутизмом. Молекулярный кариотип: arr 3p13(71,263,742-71,553,902)×1, 6q22.31(121,681,786-122,026,938)×3. Похожие случаи (делеции меньшего размера) были ранее описаны в литературе [15, 21], однако СР-подобный фенотип при данных формах вариации генома не отмечался. Важно отметить, что в данном случае клиническая картина СР была менее явной, чем у ранее описанных детей. У девочки также была выявлена дупликация участка 6q22.31 (7 генов), имеющая отрицательный эффект на функционирование головного мозга в пре- и постнатальном периодах.

Пациент 7. При СР-подобном фенотипе у 3-летней девочки метод array CGH позволил выявить дупликацию в хромосомном локусе 1q21.1-1q21.2. Молекулярный кариотип arr 1q21.1q21.2(145,933,030-148,105,148)×3. Делеции и дупликации в этом хромосомном участке являются причиной различных форм нарушения психики и врожденных пороков развития у детей [18]. Тем не менее СР-подобный фенотип при них ранее не отмечался. Следовательно, данный случай является впервые описанной дупликацией 1q21.1-q21.2 c клиническими проявлениями СР и множественными микроаномалиями развития. Важно отметить, что подобные случаи выявляются только с помощью технологии array CGH.

Пациент 8. У девочки 10 лет с тяжелой формой СР вариаций числа копий последовательностей ДНК с явным патологическим значением выявлено не было. Молекулярный кариотип arr (1-22,X)×2. В данном случае (как и в случае 4) нельзя исключать наличие таких необычных мутаций в гене MECP2, как интронные вариации последовательности ДНК или нарушения альтернативного сплайсинга.

Пациент 9. Анализ методом array CGH девочки 4 лет со стертой формой заболевания выявил делецию в участке Xq28, затрагивающую ген МЕСР2, также подтвердив ранее опровергнутый молекулярно-генетическими методами клинический диагноз, как в случаях 2 и 3. Молекулярный кариотип arr Xq28(153,213,483-153,312,854)×1, 2q13(112,710,248-112,924,604)×4. В данном случае была выявлена также трипликация (наличие трех копий последовательностей ДНК) участка 2q13, затрагивающая 3 гена, которые играют значительную роль в регуляции критических внутриклеточных процессов.

Пациент 10. У девочки 9 лет с классической формой СР вариаций числа копий последовательностей ДНК с явным патологическим значением выявлено не было. Молекулярный кариотип arr (1-22,X)×2. В данном случае (как и в случаях 4 и 8) нельзя исключать наличие таких необычных мутаций в гене MECP2, как интронные вариации последовательности ДНК или нарушения альтернативного сплайсинга, требующих дополнительных молекулярно-генетических и биоинформатических исследований.

Пациент 11. Исследование девочки 8 лет, у которой наблюдался СР с поздним регрессом, так же как и в случаях 2, 3 и 9, выявило делецию в участке Xq28, затрагивающую ген МЕСР2. Молекулярный кариотип arr Xq28(153,213,483-153,312,854)×1,22q11.21(21,204,161-21,372,741)×3. В данном случае также была выявлена дупликация в участке 22q11.21, затронувшая 9 генов, 6 из которых вовлечены в 18 геномных сетей внутриклеточных процессов регуляции гомеостаза.

Пациент 12. У девочки 8 лет с классической формой СР подтвердился ранее опровергнутый молекулярно-генетическими методами клинический диагноз, как в случаях 2, 3, 9 и 11, поскольку была выявлена делеция в участке Xq28, затрагивающая ген МЕСР2. Молекулярный кариотип был следующим: arr Xq28(153,213,483-153,312,854)×1.

Дополнительные данные по каждому случаю представлены в таблице.

Полученные данные свидетельствует о том, что девочки со стертыми или атипичными проявлениями болезни имели микроделеции в участке q28 хромосомы Х, захватывающие в основном целиком ген MECP2, а также прилегающие к нему последовательности ДНК за границами этого гена. В ходе проведенного молекулярно-цитогенетического исследования были подтверждены пять ранее опровергнутых молекулярно-генетическими методами клинических диагнозов СР у девочек с геномными делециями в участке Xq28. При этом у девочек с полными делециями гена MECP2 отмечались менее выраженные нарушения внимания, понимания обращенной речи, предметно-игровой деятельности, ходьбы, преодоления препятствий, целенаправленных движений рук; относительно легкое течение эпилепсии. Таким образом, можно сделать вывод, что у девочек с клиническим диагнозом СР и геномными делециями в участке Xq28 наблюдается особый подтип заболевания, проявляющийся в виде клинически более легких форм течения болезни по сравнению с классическим вариантом. В 1 случае атипичная форма СР была ассоциирована с геномными аномалиями, затрагивающими ген CDKL5 и критический участок микроделеционных синдромов Прадера-Вилли и Ангельмана (15q11.2). В 3 других случаях обнаружены клинически значимые вариации генома, которые были впервые ассоциированы с СР-подобными клиническими проявлениями. В нашем исследовании также впервые получены данные о том, что вариации числа копий последовательностей ДНК генома (CNV) в участках 3p13, 3q27.1 и 1q21.1-1q21.2 могут быть связаны с СР-подобными клиническими проявлениями.

Как отмечалось выше, методы прямого секвенирования гена MECP2 позволяют выявить точковые мутации у примерно 80-90% больных с классической картиной и до 60% больных с атипичной картиной СР [6, 8, 9, 21, 25, 27]. Молекулярные причины болезни остаются неизвестными у 10-20% больных с классическими и до 40% - атипичными формами СР. Исследования с применением метода MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) оказались эффективными для выявления внутригенных делеций гена MECP2 как при классической, так и атипичной формах СР у девочек без мутаций гена MECP2 [14, 20]. Оказалось, что от 10 до 20% больных без точковых мутаций гена (MECP2-негативные) имеют внутригенные делеции [14, 19, 20]. Таким образом в дополнение к точковым мутациям выявление внутригенных делеций гена MECP2 методом MLPA имеет важное значение в молекулярной диагностике и изучении этиологии СР.

Анализ литературы свидетельствует об отсутствии экспериментальных данных относительно анализа вариаций генома (CNV) и поиска микроделеционных форм заболевания при СР без мутаций гена МЕСР2. Исключением является работа по анализу CNV у девочек с мутациями гена МЕСР2, показавшая возможное наличие в геноме ряда генов-модификаторов, мутации в которых могут влиять на фенотип при СР [20]. Это свидетельствует в пользу того, что некоторые вариации генома, захватывающие локусы, вовлеченные в метаболические цепочки с участием гена MECP2, могут играть решающую роль в патогенезе СР.

В проведенной нами работе впервые с использованием технологии молекулярного кариотипирования (array CGH) показано, что геномные (хромосомные) микроделеции, охватывающие участок хромосомы Х в области гена MECP2 (участок Xq28) и приводящие к полной делеции гена, также этиологически и патогенетически могут быть связаны с СР. Кроме того, использование технологии молекулярного кариотипирования позволило нам выявить другие ранее не известные локусы, вовлеченные в этиологию умственной отсталости и аутизма у девочек с СР-подобным фенотипом. Важно отметить, что без использования технологии молекулярного кариотипирования и оригинального биоинформатического метода оценки патогенности геномных перестроек представленные в данной работе случаи были бы отнесены к идиопатическим формам умственной отсталости и аутистических расстройств. Таким образом, негативный результат молекулярно-генетического анализа мутаций гена MECP2 у девочек с клиническими проявлениями СР (умственная отсталость различной степени тяжести, расстройства аутистического спектра и эпилепсия) не являются исключающим диагностическим критерием для клинического диагноза СР. Для исключения ошибок при лабораторной диагностике такого клинически и генетически гетерогенного заболевания, как СР, необходимо комплексное использование различных молекулярно-генетических и постгеномных технологий, включая молекулярное кариотипирование (array CGH). Необходимо также отметить, что молекулярно-цитогенетические исследования с использованием полногеномного сканирования и биоинформатических (постгеномные) технологий позволяют проводить эффективную диагностику редких форм моногенных заболеваний, связанных с микроаномалиями генома, у больных с нервными и психическими заболеваниями неясной этиологии.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации (МД-4401.2013.7) и Российской ассоциации синдрома Ретта.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail