Динеины — белки, вовлеченные во многие биологические процессы, такие как внутриклеточный транспорт молекул, регуляция митотического цикла, миграция клеток, развитие и функционирование нервной системы. Семейство динеинов состоит из двух классов — аксонемных и цитоплазматических динеинов, каждый из которых состоит из нескольких полипептидных цепей. Цитоплазматический динеин в связанном состоянии с динактином, карго-адаптерными и другими белками образует комплекс, способный к осуществлению транспортных и регуляторных функций [1, 2]. Субъединицы цитоплазматического динеинового комплекса подразделяются по молекулярной массе на тяжелые, промежуточные и легкие цепи. Ядро комплекса образовано двумя связанными тяжелыми цепями — полипептидными продуктами гена DYNC1H1.

Ген DYNC1H1 картирован на хромосоме 14q32.31, его продуктом является полипептид молекулярной массой 530 кДа, состоящий из 4646 аминокислот. Структуру тяжелой цепи динеина составляют хвостовой домен (аминокислоты 1—1373 и 4222—4646), включающий домен димеризации на N-конце, линкерный домен (аминокислоты 1374—1867) и моторный домен, включающий АТФазные (аминокислоты 1868—3168 и 3553—4221) и стеблевой или домен, связывающий микротрубочки (аминокислоты 3169—3552) на C-конце [3]. Тяжелая цепь динеина является высококонсервативным белком, экспрессирующимся практически во всех клетках эукариот и в составе комплекса выполняющим функции генов «домашнего хозяйства».

Протяженность последовательности гена в более чем 90 т.п.о., относительно большое количество экзонов и интронов обусловливают высокую вероятность возникновения мутаций. Варианты в гене DYNC1H1 описаны в спектре психических, неврологических и нервно-мышечных заболеваний. По данным OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), варианты в гене ассоциированы с такими патологиями, как болезнь Шарко—Мари—Тута (OMIM#614228), кортикальная дисплазия с пороками развития головного мозга (Cortical dysplasia, complex, with other brain malformations-13, OMIM#614563), спинальная мышечная атрофия с поражением нижних конечностей (Spinal muscular atrophy, lower extremity-predominant, OMIM#158600), аутосомно-доминантная умственная отсталость, тип 13 (OMIM#614563) [4], пороки развития коры головного мозга [5], эпилептические энцефалопатии [6]. На мышиных моделях было показано, что гомозиготные варианты DYNC1H1 могут быть причиной эмбриональной гибели и ассоциированы с аномалиями внутриклеточных органелл — лизосом, аппарата Гольджи, эндосом [7].

В данном клиническом случае описывается de novo вариант гена DYNC1H1 у пациента, имеющего фенотипические проявления в виде умственной отсталости, задержки психоречевого и моторного развития, эпилепсии, пахигирии височных и лобных долей, полимикрогирии затылочных долей, гипоплазии мозолистого тела, полидактилии левой стопы и врожденной катаракты.

Клиническое наблюдение

Пациентка — девочка 14 лет. Семья пробанда обратилась в Генетическую клинику НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ в связи с жалобами на отсутствие самостоятельного движения и психоречевого развития, моторные стереотипии, аутоагрессию и эпилептические приступы. Из анамнеза известно, что девочка от первой беременности, развивавшейся на фоне ОРВИ в 9 нед и маловодия. На 32-й неделе гестации при УЗИ был обнаружен врожденный порок развития — полидактилия левой стопы.

При рождении была выявлена преаксиальная полидактилия левой стопы с выраженной сандалевидной щелью (рис. 1, а). До 4 мес развивалась соответственно возрасту. С 4 мес появились судороги в виде серийных тонических сгибательных инфантильных спазмов после пробуждения, родители стали отмечать наличие косоглазия и изменение цвета зрачка на белый. С момента возникновения неврологической симптоматики был отмечен регресс психомоторного развития. В 10 мес девочке была оперирована двусторонняя катаракта. Самостоятельно сидеть начала в 12 мес, ходить — в 4 года с поддержкой. Судорожные приступы исчезли самостоятельно в 1 год и 3 мес без терапии, после чего возобновились в возрасте 10 лет в виде замирания с вегетативными проявлениями (бледность и гиперемия кожных покровов), длительностью 20—30 с и частотой до 2 раз в месяц. После перенесенной инфекции COVID-19 в возрасте 12 лет частота приступов увеличилась до 10 в день с появлением тонического компонента в виде сокращения мышц верхних конечностей и головы. В дебюте приступов отмечались отечность лица, правого глаза, кратковременная головная боль.

Рис. 1. Клиническое и инструментальное обследование пациента.

а — полидактилия левой стопы. б — МРТ головного мозга, T1 сагиттальная проекция (1 — агенезия мозолистого тела). в — МРТ головного мозга, аксиальный срез T2 (1 — пахигирия височных и лобных долей, 2 — полимикрогирия затылочных долей). г — МРТ головного мозга, аксиальный срез FLAIR. (1 — пахигирия височных долей, 2 — полимикрогирия затылочных долей).

На момент осмотра в возрасте 14 лет судорожные приступы прекратились, отмечаются выраженное нарушение моторного развития (отсутствие самостоятельной ходьбы, стереотипии), а также нарушение психического развития (отсутствие навыков самообслуживания, частичное понимание обращенной речи, словарный запас в несколько простых слов, аутоагрессия).

Клинико-генеалогический анализ не выявил наследственной отягощенности по моногенным заболеваниям. Результаты элекроэнцефалограммы (ЭЭГ) в возрасте 10 и 13 лет: эпилептиформной активности, эпилептических приступов и их ЭЭГ-паттернов не зарегистрировано. МРТ головного мозга была проведена в возрасте 9 мес: отмечались признаки гипотрофии вещества головного мозга и стволовых структур, атрофии мозолистого тела с признаками викарного (неокклюзионного) расширения внутренних и наружных базальных ликворных пространств, а также недоразвития базальных ядер и внутренней капсулы с обеих сторон, пахигирии височных долей и полимикрогирии затылочных долей (рис. 1, б—г). Были обнаружены ретроцеребеллярная киста с признаками минимальной деформации стока синусов, а также признаки внутричерепной ликворной гипертензии.

На основании клинических и параклинических данных был выставлен диагноз: умственная отсталость (F81). Алалия сенсомоторная (F80.2). Эпилепсия генетическая фокальная (G40. 0), фокальные моторные тонические приступы, приступы с вегетативными симптомами. Фармакорезистентность. Гипоплазия мозолистого тела (Q04.0).

Пациентке было проведено определение кариотипа стандартным цитогенетическим методом. Кариотипирование проводилось на культуре лимфоцитов периферической крови. Культуру выращивали на среде в течение 72 ч, после обрабатывали колхицином, гипотоническим раствором и фиксировали. Из культивированных клеток готовили препараты на стекле и окрашивали красителем Гимзы. Заключение: кариотип пробанда 46,XX, матери 46,XX, отца 46,XY, видимых структурных хромосомных перестроек не обнаружено.

На следующем этапе была проведена матричная сравнительная геномная гибридизация (aCGH). Образец выделенной из лимфоцитов периферической крови геномной ДНК проанализирован с использованием чипа SurePrint G3 Human CGH 8×60K («Agilent», США). Сканирование проводили на сканере ДНК-микрочипов высокого разрешения SureScan Microarray Scanner («Agilent») с последующей оценкой и интерпретацией данных при помощи программного обеспечения Agilent Cytogenomics (V.5.3.0.14) на сборке генома GRCh37, hg19 (https://www.ensembl.org/, по состоянию на 2023 г.). Данные о CNV были проанализированы с использованием биоинформатического программного обеспечения Alissa («Agilent») на основании данных Clinvar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/, по состоянию на 2023 г.), Decipher (https://decipher.sanger.ac.uk/, по состоянию на 2023 г.), Database of Genomic Variants (https://dgv.tcag.ca/dgv/app/home, по состоянию на 2023 г.), GeneCards (https://www.genecards.org/, по состоянию на 2023 г.) и OMIM (https://www.omim.org/, по состоянию на 2023 г.). По результатам проведенного aCGH-исследования несбалансированных патогенных микроструктурных хромосомных перестроек выявлено не было.

В связи с отсутствием выявления этиологического фактора при цитогенетическом и молекулярно-цитогенетическом исследованиях, пробанду и родителям было выполнено полноэкзомное секвенирование (WES). WES было выполнено на приборе NextSeq 2000, Illumina (США). Геномную ДНК фрагментировали в среднем до размера 101 пары нуклеотидов (п.н.) и лигировали адаптеры Illumina (США). Полученные библиотеки идексировали с помощью ПЦР. Часть библиотек эквимолярно смешивали и нарабатывали с помощью праймеров (Illumina, США). Обогащенные библиотеки секвенировали в соответствии с протоколом производителя. Прочитанные последовательности были преобразованы в формат FASTQ и картированы на эталонный геномом человека GRCh38 (hg38). Патогенность вариантов интерпретировали в соответствии с рекомендациями по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) [8]. Найденные варианты были визуализированы и проверены с помощью Integrative Genomics Viewer. Полученные варианты были оценены на основании данных научной литературы и баз данных, включая PubMed, OMIM, HGMD, ClinVar, а также исследованы с помощью дополнительных инструментов in silico (MutationTaster, PolyPhen-2). В результате у пробанда был обнаружен вариант нуклеотидной замены c.4868G>A (p.Arg1623Gln) гена DYNC1H1.

Подтверждающая диагностика была выполнена методом секвенирования по Сэнгеру. Для этого были подобраны следующие праймеры: DYNC1H1-ex23 forward 5’-AGCGGTTTCAGAGGTATGGC-3’ и DYNC1H1-ex23 revers 5’-GCTGCCTTGGAGGGTAGATG-3’. Секвенирование проводили с использованием набора BrilliantDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Nimagen B.V., Нидерланды) на генетическом анализаторе Hitachi 3500xL (Applied Biosystems, США). В результате был подтвержден вариант DYNC1H1:c.4868G>A у пробанда в гетерозиготном состоянии при его отсутствии у родителей — вариант de novo (рис. 2 на цв. вклейке).

Рис. 2. Результат секвенирования по Сэнгеру семьи.

Стрелкой указано местоположение варианта гена DYNC1H1.

Обсуждение

Повышенная восприимчивость гена тяжелой цепи динеина к миссенс-мутациям (Z-оценка вероятности непереносимости миссенс-мутаций 10.97 согласно базе gnomAD), широкий спектр функций белка обусловливают сложность интерпретации результатов соответствия фенотипических проявлений с молекулярно-генетическими изменениями. Так, идентифицировано более сотни ассоциаций вариантов гена с различными патологиями. Связь патогенных вариантов гена и заболеваний нервно-психического спектра может объясняться его повышенной экспрессией в клетках нейроэктодермального происхождения, согласно данным Human Integrated Protein Expression Database (HIPED), и основополагающей роли динеинового комплекса в аксональном транспорте и межнейрональном сообщении, миграции нейронов, а также регуляции митотического цикла [9, 10].

Фенотипические проявления поражений отдельных органов и систем описывались в обзорах и клинических статьях [11, 12] и в некоторых случаях коррелировали с местоположением варианта в гене. Так, в исследовании [2] в 2020 г. на основе анализа данных литературы и собственных результатов авторами был проведен сравнительный обзор фенотипов. Было отмечено, что варианты, связанные с умственной отсталостью и пороками развития коры головного мозга, более чем в ¹/₂ случаев располагаются в моторном домене. Варианты, связанные с нервно-мышечными заболеваниями, в большинстве случаев располагались в хвостовом домене, а смешанный фенотип, включающий поражение нервно-мышечной системы и умственную отсталость и/или аномалии на МРТ головного мозга, был связан с вариантами в хвостовом или линкерном домене. Среди других описанных фенотипических особенностей были катаракта, в ¹/₂ случаев ассоциированная с вариантами в моторном домене, эпилепсия, чаще наблюдаемая у пациентов с вариантами в стеблевом домене, и полидактилия, описанная у 2 пациентов, у 1 из которых был обнаружен вариант другого гена — DCTN1 c.497C>G (p.S166C) (GRCh37/hg19) [13].

В обзоре клинико-фенотипических корреляций при DYNC1H1-связанных расстройствах [14] авторы пришли к подобным выводам: варианты в хвостовом домене (53AA–1867AA), преимущественно в домене димеризации (300AA–1140AA) чаще встречались при нервно-мышечных заболеваниях (преимущественно со снижением силы нижних конечностей), в то время как умственная отсталость и поведенческие нарушения регистрировались в основном в моторном, а также в линкерном и начальном хвостовом доменах. Варианты, обнаруженные при фенотипических проявлениях в виде судорог и аномалиях МРТ головного мозга, локализовались в моторном домене. В исследовании геномного профилирования при нейрональных динеинопатиях [15] авторами была установлена схожая корреляция генотипа и фенотипа.

При исследовании корреляций вариантов гена с эпилепсией [16] авторы указали, что варианты DYNC1H1 чаще локализованы в моторном домене, особенно часто — в стеблевом, и отметили сходные генофенотипические корреляции при анализе данных литературы.

Очевидно, что варианты в определенных доменах демонстрируют схожие фенотипы, хоть и не лишены клинической вариабельности. В связи с множественностью фенотипических проявлений вариантов гена некоторыми авторами [14, 15] была предложена классификация патологий, основанная на клинико-синдромальном подходе: 1) нервно-мышечные расстройства, связанные с DYNC1H1 (DYNC1H1-Related Neuromuscular Disorder, DYNC1H1-NMD), 2) расстройства развития нервной системы, связанные с DYNC1H1 (DYNC1H1-Related Neurodevelopmental Disorder, DYNC1H1-NDD). Учитывая топологию вышеизложенных вариантов, их распределение можно представить следующим образом: варианты, ассоциированные с нервно-мышечными расстройствами, в большинстве случаев локализуются в домене димеризации, а варианты, ассоциированные с поражениями ЦНС, — в моторном, линкерном и начальном хвостовом доменах.

Обнаруженный нами вариант нуклеотидной замены c.4868G>A (p.Arg1623Gln) гена DYNC1H1 впервые был упомянут в исследовании распространенности и архитектуры мутаций de novo при нарушениях развития в 2017 г. [17]. Фенотип пациента включал поражение ЦНС в виде глобальной задержки развития, судорог, дисплазии мозолистого тела. Прочие клинические проявления были описаны в виде челюстно-лицевых аномалий, нарушений координации, мышечной гипотонии тела при гипертонусе конечностей, множественных контрактур суставов, дисплазии вертлужной впадины, микроцефалии и катаракты.

Данный вариант был также описан в исследовании генетических дефектов, ассоциированных с лиссэнцефалией, в 2018 г. [18]. В приведенных в работе данных различные варианты DYNC1H1 составили 3% от исследуемой когорты, а сам вариант c.4868G>A был обнаружен у пациента женского пола возрастом 9 мес. Вариант возник de novo и был ассоциирован с клиникой легкой степени задержки умственного развития, пахигирии с преобладанием переднего градиента, контролируемой эпилепсии в раннем детском возрасте (4 мес) и врожденной катаракты.

В нашем случае у пациентки клиническая картина включает поражения ЦНС в виде умственной отсталости и фокальной эпилепсии с вегетативными симптомами; нервно-мышечной системы в виде задержки моторного развития; аномалии развития в виде пахигирии височных и лобных долей, полимикрогирии затылочных долей, агенезии мозжечка по данным МРТ головного мозга, левосторонней полидактилии стопы; врожденной катаракты. Данный фенотип частично совпадает с описанными ранее, но дополняется левосторонней полидактилией стопы и особенностями МРТ головного мозга. По-видимому, такие фенотипические различия могут объясняться сложной и далеко не полностью раскрытой ролью белкового комплекса в развитии систем организма, а также измененным вследствие мутации трансляционным продуктом гена.

Так, замена аргинина на глутамин в 1623-й позиции линкерного домена приводит к изменению положительного заряда аминокислоты на нейтральный. Такая замена хоть и не изменяет полярности, но нарушает ковалентные, ионные и вандерваальсовы взаимодействия между аминокислотами, следствием чего может быть изменение пространственной структуры и функциональных свойств полипептида. Косвенно это подтверждает анализ in silico в MutationTaster — изменения в белке при данном варианте определяются как патогенные с большой долей вероятности.

Заключение

В описанном нами клиническом случае был выявлен вариант c.4868G>A (p.Arg1623Gln) гена DYNC1H1 впервые в российской популяции. Вариант не зарегистрирован в базах данных Genome Aggregation Database (gnomAD), 1000 genomes и RuSeq (unified Russian genetic variant database from the Genetico laboratory, SerbaLab, and Saint-Petersburg’s municipal hospital №40 accumulating data of 1500 patients). Согласно данным Clinvar, обнаруженный вариант классифицируется как патогенный.

Случай нашего пациента выявил ранее не описанные фенотипические проявления — левостороннюю полидактилию стопы и некоторые особенности МРТ головного мозга. В отсутствие других патогенетически значимых вариантов по данным WES, ранее описанным случаям данной нуклеотидной замены, предсказанием патогенности in silico, а также возникновением замены de novo, можно предполагать, что идентифицированный вариант гена DYNC1H1 является молекулярно-генетической причиной развития патологического фенотипа у пациента. Расширение спектра фенотипических проявлений данного варианта может помочь в диагностике патологий, связанных с геном DYNC1H1.

Информированное согласие. Родителями пациента было подписано информированное согласие на участие в исследовании.

Informed Consent. The family signed an informed consent to participate in the study.

Исследование одобрено Биоэтическим комитетом НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ от 28.02.2023 №15.

The study was approved by the local bioethical committee of 28.02.2023 №15.

Исследование выполнено с использованием оборудования ЦКП «Медицинская геномика» Томского НИМЦ.

The study was performed using the equipment of the Medical Genomics Centre of Tomsk NRMC.

Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ №21-65-00017.

The research was supported by the Russian Science Foundation, grant No. 21-65-00017.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.