Анализ ассоциации полиморфизма генов НТR2A, BDNF и SLC6A4 с развитием параноидной формы шизофрении и суицидального поведения

В общей популяции риск развития шизофрении на протяжении жизни не превышает 1% [1]. В клинической психиатрии выделяют ряд форм этого заболевания. Наиболее часто (20,9%) встречающейся формой является параноидная шизофрения, которая характеризуется прогредиентным течением и выраженностью продуктивной симптоматики (бредовые идеи и галлюцинации) [3, 5].

В генетическом аспекте шизофрению относят к многофакторным наследственным заболеваниям, генетический анализ которых осложняется высоким уровнем полигенности, различным взаимодействием между генами и сложной регуляцией их экспрессии. Существуют различные точки зрения относительно характера их наследования, при этом большинство современных представлений о роли генетических факторов в развитии эндогенных психических заболеваний основаны на полигенной модели, которая предполагает совместный вклад большого количества полиморфных локусов с низкой пенетрантностью. Предполагается, что низкопенетрантные гены предрасположенности к эндогенным психическим заболеваниям могут обусловливать проявление того или иного наследуемого признака на нейробиологическом уровне, предрасполагающего к развитию психического заболевания в целом или его отдельных симптомов [1, 2].

Обнаружено и изучено множество генных вариаций, которые ассоциированы с эндогенными психозами, в частности с шизофренией. Следует отметить, что одни и те же полиморфные локусы могут быть сцеплены с различными функциональными элементами ЦНС, при этом наличие определенных полиморфных вариантов может приводить к нарушениям в функционировании этих систем, отражающимся на психике. Также следует отметить, что наличие определенных полиморфных вариантов не приводит к жестко детерминированным последствиям, а определяет лишь вероятность развития заболевания [2].

Цель работы — анализ полиморфизма потенциальных генов — кандидатов развития эндогенных психических заболеваний, которые могут быть вовлечены в этиологию и патогенез шизофрении. Это гены, кодирующие серотониновый рецептор типа 2А (HTR2A), нейротрофический фактор мозга (BDNF) и серотониновый транспортер (SLC6A4). Одновременное генотипирование по шести полиморфным локусам указанных генов проводили с использованием технологии биочипов [13].

В исследование были включены образцы ДНК, выделенные из крови 198 больных шизофренией (этнические русские и татары), в числе которых было 58,5% женщин, 41,5% мужчин; 50,8% были татары, 49,2% — русские. Средний возраст больных составил 26 лет (колебания от 15 до 54 лет).

Диагноз психического заболевания устанавливали по МКБ-10. Состояние больных соответствовало рубрике F20.0 — параноидная шизофрения.

В ходе проведения исследования была выделена группа больных шизофренией, состоящая из 159 пациентов, которая была разделена на две подгруппы в зависимости от наличия (30 больных) или отсутствия (129) попыток суицида.

Контрольная группа состояла из 192 здоровых (этнические русские и этнические татары), 52,8% женщин, 47,1% мужчин; 51,3% татар, 48,7% русских. Средний возраст здоровых доноров составил 36 лет (колебания от 18 до 85 лет).

Образцы крови у больных шизофренией и здоровых брались в Республиканской клинической больнице №1 Минздрава Республики Башкортостан. Весь клинический материал был собран с соблюдением процедуры информированного согласия.

ДНК из венозной крови больных шизофренией и здоровых выделяли стандартным методом фенольной экстракции [4].

Биочипы были изготовлены методом фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов полиакриламидного геля [13]^[1].

Наработку полимеразной цепной реакции продуктов (ПЦР) проводили посредством «гнездовой» мультиплексной ПЦР в два этапа. Для анализа генетической предрасположенности к шизофрении были выбраны полиморфные варианты генов-кандидатов HTR2A (rs6311 G>A, rs6313 C>T, rs6314 C>T, rs7997012 G>A), BDNF (rs6265 G>A) и SLC6A4 (rs28914832). ПЦР проводили при стандартных условиях, как описано ранее [7].

Полученные на втором этапе мультиплексной ПЦР флюоресцентно меченные образцы использовали для гибридизации на биочипе. Гибридизационная смесь общим объемом 35 мкл включала в себя 5xSSPE («Promega», США), 25% формамид («Sigma», США) и флюоресцентно меченный амплификат. Смесь 5 мин денатурировали при 95 °С, быстро (1 мин) охлаждали на льду, наносили на биочип и оставляли на 12—14 ч при 37 °С. После завершения инкубации гибридизационную камеру удаляли вместе с непрореагировавшей гибридизационной смесью, биочип отмывали в 1xSSPE («Promega», США) в течение 10 мин при комнатной температуре, высушивали и проводили регистрацию флюоресцентных сигналов. Флюоресцентный сигнал с ячеек биочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного камерой ПЗС и программным обеспечением Imageware («Биочип-ИМБ», Россия) [7].

Секвенирование образцов ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye^™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems.

Статистический анализ был проведен с использованием прикладной программы GraphPad InStat 3.05 («GraphPad Software Inc.», США). Для проверки соответствия распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди—Вайнберга использовали стандартный метод &khgr;². Для выявления ассоциации полиморфных вариантов генов с развитием заболевания применяли двусторонний точный тест Фишера, а также &khgr;²-тест с поправкой Йетса при анализе ассоциаций на малых выборках. В расчетах, приведенных в данной работе, использовали статистический параметр ОШ (отношение шансов), значение которого представляет собой отношение шансов события в одной группе к шансам события в другой группе и позволяет оценивать риск развития заболевания при определенном генотипе. Различия считали статистически значимыми при достигнутом уровне значимости р<0,05. В представленных в работе расчетах параметр ОШ указан с 95% доверительным интервалом (ДИ 95%).

Анализ сочетанных взаимодействий был проведен с применением программы MDR (Multifactor-Dimensionality Reduction, http://www.multifactordimensionalityreduction.org/), позволяющей выявить оптимальную модель сочетанного влияния полиморфизма генов на развитие заболевания [9].

Для анализа полиморфизма генов HTR2A, BDNF и SLC6A4 разработан биочип, схема которого представлена на рисунке (фрагмент а).

Биочип для анализа полиморфизма в генах — кандидатах развития шизофрении SLC6A4, HTR2A и BDNF.

Примечание. а - схема расположения олигонуклеотидных зондов. Ячейки серого цвета в двух верхних строках соответствуют олигонуклеотидам, комплементарным последовательностям «дикого типа» (мажорный вариант гена), ячейки белого цвета в двух нижних строках - последовательностям «мутантного типа» (минорный вариант гена); б - пример гибридизационной картины, полученной на биочипе для образца ДНК с генотипом SLC6A4 rs28914832 (A/A); HTR2A rs6311 (G/A), rs6313 (C/T), rs6314 (C/C), rs7997012 (G/A); BDNF rs6265 (G/A); в - диаграмма значений относительных сигналов интенсивности флюоресценции ячеек биочипа, нормированных на значение максимального сигнала в паре «дикий тип - мутация» по каждому полиморфному маркеру.

С помощью разработанного биочипа определены частоты генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов HTR2A, BDNF и SLC6A4 у больных шизофренией и здоровых доноров, представителей русского и татарского этносов (табл. 1—4).

Таблица1

]]>

Таблица2

]]>

Таблица3

]]>

Таблица4

]]>

В результате анализа ассоциации исследуемых полиморфизмов было показано, что частота Т аллеля по полиморфизму rs6314 C>T гена HTR2A в выборке больных параноидной шизофренией в 2,1 раза ниже, чем в группе здоровых доноров (ОШ=0,44, 95% ДИ=0,24—0,84, p=0,014).

Соответственно генотипы С/T и Т/T по полиморфизму rs6314 C>T гена HTR2A в выборке больных параноидной шизофренией встречаются статистически значимо реже, чем в группе здоровых индивидов (ОШ=0,45, 95% ДИ=0,23—0,87, p=0,017). Результаты свидетельствуют о протективном действии T аллеля и Т/-генотипов по полиморфизму rs6314 C>T гена HTR2A в развитии параноидной шизофрении. Статистически значимых различий по частотам генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов HTR2A (rs6311, rs6313 и rs7997012), BDNF (rs6265) и SLC6A4 (rs28914832) между группами больных шизофренией и психически здоровых доноров не было выявлено.

Также был проведен анализ сочетанных взаимодействий с использованием MDR алгоритма по локусам: HTR2A (rs6311 G>A, rs6313 C>T, rs6314 C>T, rs7997012 G>A) и BDNF (rs6265 G>A). К сочетанию, статистически значимо ассоциированному с повышенным риском развития заболевания, была отнесена комбинация генотипов гена HTR2A rs6311 G/-, rs6313 C/-, rs6314 C/C, rs7997012 G/- (ОШ=1,64, 95% ДИ=1,10—2,46, p=0,019).

Полученные данные соответствуют представлениям о том, что ген HTR2A играет важную роль в этиологии шизофрении. Имеются данные об ассоциации шизофрении с полиморфными локусами промоторной области rs6311 G>A [14] и кодирующих регионов rs6313 C>T [10] и rs6314 C>T [11] гена HTR2A. Локус rs6311 G>A находится в неравновесном генетическом сцеплении с локусом rs6313 C>T, предполагается, что именно rs6311 G>A имеет функциональное значение, поскольку способен модулировать активность гена HTR2A [10]. Кроме того, показана ассоциация полиморфизма rs7997012, расположенного в интроне гена HTR2A, с ответом на лечение циталопрамом [12].

Помимо этого, был проведен анализ ассоциации в группах больных шизофренией с попытками суицида и без таковых. Частоты A аллеля по полиморфизму rs6311 G>A (ОШ=0,43, 95% ДИ=0,22—0,83, p=0,017) и T аллеля по полиморфизму rs6313 C>T (ОШ=0,42, 95% ДИ=0,22—0,81, p=0,013) гена HTR2A были ниже у пациентов с попытками суицида, чем у пациентов без таковых. Статистический анализ также выявил различия в частотах генотипов А/- по полиморфизму rs6311 G>A (ОШ=0,33, 95% ДИ=0,15—0,76, p=0,013) и T/- по полиморфизму rs6313 C>T (ОШ=0,31, 95% ДИ=0,14—0,71, p=0,007) гена HTR2A между группами больных шизофренией с попытками суицида и без таковых. Таким образом, наличие A аллеля и генотипов А/- по полиморфизму rs6311 G>A, а также T аллеля и генотипов T/- по полиморфизму rs6313 C>T может оказывать протективное действие в формировании суицидального поведения у больных параноидной формой шизофрении. В свою очередь гомозиготные генотипы G/G по полиморфизму rs6311 G>A (ОШ=3,01, 95% ДИ=1,32—6,88, p=0,013) и С/С по полиморфизму rs6313 C>T (ОШ=3,22, 95% ДИ=1,41—7,37, p=0,008) гена HTR2A ассоциированы с формированием суицидального поведения у больных параноидной шизофренией.

Совместный анализ генотипов по двум локусам rs6311 G>A и rs6313 C>T гена HTR2A в объединенной выборке, включающей здоровых доноров и больных параноидной шизофренией, показал, что в выборках присутствуют три мажорных сочетания генотипов: GG/CC (41,2%), GA/CT (46,6%) и AA/TT (10,6%). В 2,6% случаев были обнаружены редкие сочетания генотипов GG/СT (1,3%) и AA/CT (0,3%), остальные генотипы представлены не были. Полученные данные позволяют с высокой степенью достоверности (p<0,001) считать, что минорные аллели данных полиморфизмов сцеплены в цис-конфигурации, а транс-конфигурация встречается редко. Эти данные находятся в соответствии с фактом неравновесия по сцеплению между маркерами rs6311 G>A и rs6313 C>T и согласуются с представлениями о взаимосвязи полиморфных локусов внутри гена рецептора серотонина 2А с суицидальным поведением [6, 8, 10, 15].

Сконструированный и использованный в настоящей работе биочип для анализа полиморфизма в генах — кандидатах развития шизофрении HTR2A, BDNF и SLC6A4 позволил с высокой точностью определить их аллельные варианты. Обнаружена статистически значимая ассоциация полиморфных вариантов гена HTR2A с развитием параноидной формы шизофрении и формированием суицидального поведения у больных шизофренией. Полученные результаты согласуются с многочисленными исследованиями, согласно которым изменения в гене HTR2A лежат в основе суицидального поведения и функциональных нарушений, приводящих к эндогенным психозам, в том числе параноидной шизофрении. Предполагается, что дальнейший поиск генетических маркеров, ассоциированных с развитием и течением шизофрении, позволит разработать эффективные методы диагностики и лечения заболевания.

Работа выполнена при поддержке программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК №02.740.11.0869 и №02.527.11.0006).