Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Коцюба А.Е.

Кафедра анатомии человека Владивостокского государственного медицинского университета

Черток В.М.

Кафедра анатомии человека Владивостокского государственного медицинского университета

Иммуногистохимическое исследование H2S-позитивных нейронов в некоторых структурах головного мозга человека при артериальной гипертензии

Авторы:

Коцюба А.Е., Черток В.М.

Подробнее об авторах

Просмотров: 1404

Загрузок: 262

Как цитировать:

Коцюба А.Е., Черток В.М. Иммуногистохимическое исследование H2S-позитивных нейронов в некоторых структурах головного мозга человека при артериальной гипертензии. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2012;112(1):54‑59.
Kotsiuba AE, Chertok VM. Immunohistochemical study of H. S.S. Korsakov Journal of Neurology and Psychiatry. 2012;112(1):54‑59. (In Russ.)

Рекомендуем статьи по данной теме:
Ког­ни­тив­ные на­ру­ше­ния у па­ци­ен­тов с ар­те­ри­аль­ной ги­пер­тен­зи­ей. Жур­нал нев­ро­ло­гии и пси­хи­ат­рии им. С.С. Кор­са­ко­ва. Спец­вы­пус­ки. 2024;(4-2):41-48
Ар­те­ри­аль­ная ги­пер­тен­зия у па­ци­ен­тов — учас­тни­ков бо­евых действий. Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(5):128-132
Фи­зи­чес­кие ме­то­ды кор­рек­ции ар­те­ри­аль­ной ги­пер­тен­зии: сов­ре­мен­ные пред­став­ле­ния. (Об­зор ли­те­ра­ту­ры). Воп­ро­сы ку­рор­то­ло­гии, фи­зи­оте­ра­пии и ле­чеб­ной фи­зи­чес­кой куль­ту­ры. 2024;(3):41-47
Вли­яние ме­та­бо­ли­чес­ких по­ка­за­те­лей и фак­то­ров рис­ка на сур­фак­тан­тные бел­ки SP-A и SP-D при аб­до­ми­наль­ном ожи­ре­нии. Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(7):60-66
Осо­бен­нос­ти ве­ге­та­тив­ной ре­гу­ля­ции ва­ри­абель­нос­ти рит­ма сер­дца у мо­ло­дых лиц при про­фи­лак­ти­ке сер­деч­но-со­су­дис­той па­то­ло­гии. Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(8):76-81
Су­деб­но-ме­ди­цин­ская ха­рак­те­рис­ти­ка слу­ча­ев вне­зап­ной смер­ти лиц с ме­та­бо­ли­чес­ким син­дро­мом. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(4):54-57
Су­деб­но-ме­ди­цин­ская оцен­ка ме­теоус­ло­вий в ка­чес­тве фак­то­ров рис­ка вне­зап­ной смер­ти при ги­пер­то­ни­чес­кой бо­лез­ни. Су­деб­но-ме­ди­цин­ская эк­спер­ти­за. 2024;(4):65-68
Воз­мож­нос­ти при­ме­не­ния этил­ме­тил­гид­рок­си­пи­ри­ди­на сук­ци­на­та в ком­плексной те­ра­пии ар­те­ри­аль­ной ги­пер­тен­зии. Кар­ди­оло­гия и сер­деч­но-со­су­дис­тая хи­рур­гия. 2024;(5):572-580
Меж­ду­на­род­ное мно­го­цен­тро­вое ран­до­ми­зи­ро­ван­ное двой­ное сле­пое пла­це­бо-кон­тро­ли­ру­емое ис­сле­до­ва­ние оцен­ки эф­фек­тив­нос­ти и бе­зо­пас­нос­ти пос­ле­до­ва­тель­ной те­ра­пии па­ци­ен­тов с хро­ни­чес­кой ише­ми­ей моз­га пре­па­ра­та­ми Мек­си­дол и Мек­си­дол ФОРТЕ 250 (ис­сле­до­ва­ние МЕМО): ре­зуль­та­ты су­ба­на­ли­за у па­ци­ен­тов с ар­те­ри­аль­ной ги­пер­то­ни­ей. Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(10):72-83
Ре­зо­лю­ция со­ве­та эк­спер­тов «Воз­мож­нос­ти ней­роп­ро­тек­тив­ной те­ра­пии у па­ци­ен­тов с ар­те­ри­аль­ной ги­пер­тен­зи­ей и ког­ни­тив­ны­ми на­ру­ше­ни­ями». Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2024;(11):85-93

О нейрогенной функции эндогенного сероводорода (H2S) известно немного. В мозге крысы, человека и быка были обнаружены относительно высокие концентрации сероводорода (по разным данным от 50 до 160 мкМ, в плазме крови — около 46 мкМ), что послужило основанием для предположения о его важной роли в работе нервной системы [8, 9, 23]. Высказывается мнение, что H2S — основной модулятор кальциевого гомеостаза в нейронах, активирующий поступление кальция в цитозоль через Ca2+ каналы L-типа [15]. Нарушение этого процесса сопровождается разнообразными изменениями в работе нервных клеток и прежде всего их сигнальной функции. При ряде нейродегенеративных заболеваний отмечено снижение концентрации H2S, а при болезни Дауна — его избыточный синтез в мозге [17]. Имеются косвенные доказательства участия этого газа в центральной регуляции гемодинамики [20, 21], хотя морфологические данные о наличии нервных клеток, использующих в качестве нейротрансмиттера H2S в соответствующих ядрах ствола мозга при гипертензии, нам неизвестны.

Цель работы — изучение топографии и количественного распределения H2S-позитивных нейронов (H2S-нейронов) в некоторых ядрах продолговатого мозга и моста, входящих в состав сердечно-сосудистого центра при артериальной гипертензии I—III степени.

Материал и методы

Для исследования был использован судебно-медицинский аутопсийный материал 8 практически здоровых мужчин в возрасте 18—44 лет (контрольная группа) и 19 мужчин соответствующего возраста, погибших от механических травм, не связанных с повреждением головного мозга, у которых при жизни была диагностирована артериальная гипертензия I—III степени (группы АГ-I, АГ-II и АГ-III).

Не позднее 3 ч после смерти из полости черепа извлекали головной мозг, отделяли от него мост и продолговатый мозг, которые фиксировали в течение 1 ч в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) при 4 °С.

Из образцов мозга готовили криостатные срезы толщиной 30 мкм, которые обрабатывали для иммуногистохимического выявления цистатионин-β-синтетазы (СВS) — фермента, участвующего в синтезе H2S в ЦНС [14, 25]. Для этого срезы последовательно инкубировали с 1% нормальной сывороткой лошади 1 ч при комнатной температуре мышиными моноклональными антителами против цистатион-β-синтазы (в разведении 1:1000) (Abcam, Bеликобритания) при температуре 4°С в течение 18 ч, биотинилированными антителами в разведении 1:100 (VeсtorLabs, США) 2 ч, а также с авидин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite ABC Kit, VeсtorLabs, США) 1 ч при комнатной температуре. Для выявления продуктов реакции под контролем микроскопа срезы инкубировали в субстрате для обнаружения пероксидазы (VIP Substrate Kit, VeсtorLabs, США). Затем срезы промывали, обезвоживали по стандартной методике и заключали в полистерол. Для оценки специфичности реакции проводили окрашивание срезов без первичных или вторичных антител.

Изучали ядро солитарного тракта, дорсальное ядро блуждающего нерва, ретикулярные ядра — мелко-, гигантоклеточное, центральное, околоцентральное, латеральное, мостовые ядра — оральное и каудальное, а также ядра задней группы шва — бледное, темное, крупное и мостовое. В серии из последовательных срезов один окрашивали 0,5% раствором метиленового синего, а следующий за ним обрабатывали для выявления H2S-нейронов. При изучении топографии ядер каждый из двух срезов исследовали раздельно на двух микроскопах, в окуляры которых помещали одинаковые сетки с равновеликими квадратами. Каждое ядро ориентировали по характерным признакам в сагиттальной и фронтальной плоскостях, после чего его контуры воспроизводили на экране монитора в соответствии с положением ядер относительно координат сетки.

В проекции среза каждого ядра определяли общее число нейронов и долю, приходящуюся на H2S-нейроны, а также величину среднего значения оптической плотности продукта реакции (активность реакции) в иммунопозитивных нейронах каждого ядра в соответствии с опубликованными ранее методиками [2]. Количественную обработку материалов проводили с использованием автоматизированной системы анализа изображений Allegro MC. Данные количественного анализа представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего, полученных от каждого человека при обработке не менее 12 срезов. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Значения доверительного интервала, p<0,05, считали статистически достоверными.

Результаты

Изучение образцов, взятых у контрольной группы, показало наличие H2S-нейронов в проекции ядер, между ядрами, между ядрами и проводящими путями (рис. 1, а—д). При специфической иммуноцитохимической реакции в местах локализации СВS образуется мелкозернистый осадок, который в зависимости от плотности расположения гранул маркирует нейроны, нервные проводники, отдельные капилляры в различные оттенки коричневого цвета. При проведении реакции без первичных и вторичных антител характерной структуры преципитата не образуется (рис. 1, е).

Рис. 1. Разный уровень интенсивности реакции CBS в H2S-нейронах ядер ретикулярного гигантоклеточного (а), двойного (б), солитарного тракта (в), ретикулярного каудального мостового (г), нервных волокнах и капиллярах (д) и отсутствие реакции без антител в инкубационном растворе (е) у контрольной группы.
Примечание. Иммуногистохимический метод. Ув. на фрагментах а—в, е —100, г, д —200.

Наибольшие цифры среднего показателя оптической плотности продукта реакции были установлены в двойном ядре, ретикулярных ядрах — гигантоклеточном и центральном, а также в темном ядре шва (рис. 2, А). Наименьший уровень этого показателя определялся в чувствительных ядрах (ядро одиночного пути, ретикулярные мелкоклеточное и латеральное ядра) и вегетативном — дорсальном ядре блуждающего нерва. Прослеживается определенная зависимость между содержанием СВS и величиной нейронов. Средний показатель активности реакции выше в медиальной зоне продолговатого мозга, включающей ядра с двигательными функциями (двойное ядро, ретикулярные гигантоклеточное, околоцентральное, центральное, оральное и каудальное мостовые ядра), которые содержат большое количество крупных интенсивно окрашенных клеток (см. рис. 1, а, б, г). В латеральной, чувствительной зоне, велика доля мелких нейронов с невысокой активностью СВS (см. рис. 1, в). Между тем в проекции ядер с сенсорными функциями также выявляются клетки с интенсивной реакцией, которые чаще располагаются на периферии ядер или между ними, а среди крупных нейронов двигательных ядер встречаются клетки с умеренной или низкой активностью реакции.

Рис. 2. Распределение реакции CBS в нейронах (а) и H2S-нейронов (б) в исследованных ядрах контрольной группы и лиц, страдавших АГ I—III степени.
Примечание. Ядра: I — солитарного тракта, 2 — дорсальное блуждающего нерва, ретикулярные — мелкоклеточное (3), центральное (4), околоцентральное (5), гигантоклеточное (6), латеральное (7); мостовые—оральное (8) и каудальное (9); двойное (10), а такжешва задней группы—бледное (11), темное (12), крупное (13) и мостовое (14).
За 100% принята величина соответствующих показателей у контрольной группы.

Между ядрами имеются значительные отличия в содержании H2S-нейронов (рис. 2, Б). В некоторых ядрах доля таких клеток не превышает 2—4% (дорсальное ядро блуждающего нерва, ядро одиночного пути), в других (двойное ядро, ретикулярное гигантоклеточное, каудальное, медиальное, центральное ядра) достигает 12—14%.

При АГ-I в нейронах дорсального ядра блуждающего нерва на 12,4% возрастают значения среднего показателя активности реакции СВS (см. рис. 2, а). Это происходит в основном за счет увеличения интенсивности реакции в группе клеток, расположенных на периферии его дорсальной поверхности, прилегающей к тонкому ядру. Содержание нейронов с высокой активности реакции возрастает по направлению от ростральной к каудальной части ядра. Особенно много таких клеток определяется в нем на уровне средней трети нижней оливы. Вместе с тем доля H2S-позитивных нейронов в этом ядре остается на уровне контрольных значений (см. рис. 2, б). Во многом сходные изменения количественных показателей отмечены в ядрах двойном, ретикулярном гигантоклеточном, ретикулярных оральном и каудальном мостовых и темном и крупном ядрах шва, но в отличие от вегетативного ядра в них повышение активности фермента происходит относительно равномерно в большинстве выявленных нейронов. В других ядрах существенных изменений величины исследованных показателей не установлено (см. рис. 2, а, б).

При АГ-II в большинстве ядер наблюдалось выраженное снижение (на 18—26%) среднего показателя активности реакции при весьма умеренном уменьшении (на 2—12,8%) доли H2S-нейронов (см. рис. 2, а, б). При этом сокращение количественных показателей в большей степени затрагивает ядра медиальной зоны продолговатого мозга и моста. В латеральной зоне изменения морфометрических параметров в большинстве ядер остаются на уровне контрольных значений. В ретикулярном гигантоклеточном ядре отмечается максимальное снижение (на 26%) активности и числа (на 12,8%) H2S-нейронов. В ретикулярных мелкоклеточном, центральном и оральном мостовом ядрах наблюдается выраженное уменьшение (до 14%) интенсивности реакции при умеренном сокращении (на 6—8%) числа клеток. В дорсальном ядре блуждающего нерва величина показателей хотя и снижается по сравнению с АГ-I, но остается достоверно выше контрольных значений. В других ядрах изменения величины количественных показателей минимальны (2—4%) и не выходят за рамки статистической погрешности.

При АГ-III прибавляется количество ядер, в которых установлено значимое снижение доли нейронов (см. рис. 2, а, б). В двигательных ядрах продолговатого мозга и моста сокращение количества H2S-нейронов и содержания в них фермента более выражено, чем в чувствительных (рис. 3, а, б). В ядрах одиночного пути и дорсальном блуждающего нерва величина метрических показателей остается в пределах, а в ретикулярном латеральном и мелкоклеточном опускается соответственно на 9 и 12% ниже контрольных значений. Однако во всех случаях количество клеток уменьшается в большей степени в тех частях ядра, в которых при АГ-II отмечено повышенное содержание клеток с низкой активностью реакции.

Рис. 3. Изменение активности CBS в нейронах и содержания H2S-нейронов в некоторых ядрах людей, страдавших АГ.
Примечание. а — двойное ядро при АГ-I, б — ретикулярное гигантоклеточное ядро при АГ-II.
Иммуногистохимический метод. Ув. 100.

Обсуждение

Вазорелаксирующий эффект NO и монооксида углерода хорошо известен, что позволяет им принимать непосредственное участие в регуляции артериального давления. При подавлении активности ферментов, отвечающих за синтез указанных выше газов в стенке сосудов, развивается гипертензия [5, 7, 21]. Не является исключением в этом плане и H2S: снижение уровня (или отсутствие у инбредных животных) цистатионин-γ-лиазы — фермента, участвующего в образовании сероводорода в сосудах, приводит к существенному сокращению его уровня в сыворотке крови и повышению систолического давления на 12—30 мм рт.ст. [10, 25, 26]. Однако отсутствие этого фермента не сказывается на концентрации H2S в мозге, где его синтез обеспечивает другой фермент — цистатионин-β-синтетаза [8, 13]. На этом основании исследователи заключают, что у животных, нокаутированных по цистатио­нин-γ-лиазе, возникновение гипертензии обусловлено периферическими механизмами, связанными с повышением тонуса сосудов.

О роли H2S в центральных механизмах регуляции кровотока в литературе сведения практически отсутствуют. В отличие от NO, участие которого в этих процессах подтверждается большим количеством фактов [1—3, 19], в отношении H2S приводятся лишь косвенные доказательства. Установлено, в частности, снижение концентрации тиосульфата, являющегося продуктом утилизации сероводорода в мозге, у гипертензивных животных [24]. Недавно появилось сообщение, что вовлечение H2S в центральную регуляцию кровяного давления может осуществляться посредством воздействия этой сигнальной молекулы на АТФ-зависимые К+-каналы нейронов гипоталамуса крыс [12]. Вместе с тем никто не продемонстрировал клеток, экспрессирующих CBS, ни в гипоталамусе, ни в других центрах мозга, управляющих вазомоторикой. Не было представлено материалов о топографии, количественном распределении и активности фермента в H2S-нейронах у здоровых людей и изменениях этих параметров при гипертензии, что имеет принципиальное значение для оценки функции нервного центра.

Проведенное нами исследование показало наличие морфологического субстрата, с помощью или посредством которого H2S может участвовать в реализации центральных механизмов регуляции кровотока. В проекции всех исследованных ядер продолговатого мозга и моста, имеющих отношение к так называемому бульбарному отделу сердечно-сосудистого центра, постоянно определяются клетки, обладающие разной степенью активности СВS. Интенсивная реакция, как правило, проявляется в крупных клетках двигательных ядер, часть из которых связана с преганглионарными симпатическими нейронами спинного мозга [16], мелкие и немногочисленные клетки чувствительных ядер обычно имеют невысокую активность фермента. Между ядрами, ядрами и проводящими путями определяются одиночные H2S-нейроны. Таких нейронов немного, но они занимают стратегически важные участки и, по имеющимся данным [2], обмениваются многочисленными отростками с ядрами ретикулярными, вегетативным блуждающего нерва и одиночного пути. Эти клетки по сути представляют собой интернейроны, подобно описанным в коре мозга, которые содержат разные нейротрансмиттеры и нейромодуляторы, что позволяет им выполнять интегративную функцию в отношении клеток различной нейрохимической и функциональной принадлежности [11].

Содержание H2S-нейронов в проекции изученных ядер колеблется довольно значительно — от 2 до 14%. Иммунопозитивные нейроны выявляются преимущественно в области медиального эффекторного поля и некоторых ядрах шва, где располагаются относительно равномерно. При этом содержание этих нейронов увеличивается от ростральной к каудальной части ядра, но плотных скоплений в какой-то его части они в большинстве случаев не образуют. Клетки, экспрессирующие СВS, находятся по соседству с NOергическими нейронами, хотя концентрация последних в соответствующих ядрах в 2—3 раза выше, чем H2S-нейронов [6]. Здесь же располагаются нервные клетки, включающие серотонин, норадреналин, ГАМК, глицин и некоторые другие вещества, которые участвуют во многих физиологических процессах нервной системы, включая регуляцию гемодинамики и артериального давления [2, 4]. Ключевую роль в многообразном действии этих веществ современные исследователи отводят NO, способному контролировать их содержание в мозге [9, 21]. Вместе с тем имеются сообщения [22, 23] о нейромодуляторной функции эндогенного H2S, который, так же как и NO, может регулировать в мозге уровень серотонина, нор­адреналина и некоторых других веществ. Отмечено также наличие в мозге тесного функционального взаимодействия нейронов, аккумулирующих оксид азота и сероводород [14, 25]. В отличие от NO, время полужизни которого в среднем составляет 5 с, а расстояние диффузии — 100 мкм, H2S обеспечивает развитие не столь мощного, зато долговременного возбуждения с более широкой зоной воздействия. Вероятно, это свойство сероводорода, впервые установленное в гиппокампе крысы [18], может быть использовано и в других центрах мозга, в том числе участвующих в регуляции вазомоторики. Поскольку при гипертензии как у человека, так и экспериментальных животных содержание NO-нейронов в ядрах бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра значительно сокращается [1, 3], то способность сероводорода вызывать длительное возбуждение нейронов в этом случае может оказаться необходимым элементом для стабилизации артериального давления.

При изучении морфометрических параметров, характеризующих состояние H2S-нейронов в ядрах продолговатого мозга и моста при артериальной гипертензии, нами также выявлены изменения в них вначале содержания СВS, а затем и числа иммунопозитивных клеток, выраженность которых зависит от тяжести заболевания. Одновременно установлены отличительные признаки в количественном и пространственном распределении H2S-нейронов по сравнению с NO-позитивными клетками. Прежде всего при гипертензии изменения количественных показателей со стороны H2S-нейронов наступают позднее и выражены в меньшей степени, чем NO-нейронов. Раньше других ядер отмеченные преобразования определяются в дорсальном ядре блуждающего нерва, что, по-видимому, является следствием тесной связи, существующей между этим ядром и ядром одиночного пути, в котором, как известно, большинство афферентов имеет вагусное происхождение. Однако и в других ядрах при АГ II—III степени изменения количественных показателей H2S-нейронов не столь значительны, как NO-позитивных клеток [1, 3]. В результате этого процесса происходят изменения пространственного расположения H2S- и NO-нейронов в ядре. Вероятно, изменения топографии двух типов нейронов внутри ядер отражаются как на характере связей между ядрами, так и организации работы нервного центра в целом. Изменение пространственных взаимоотношений между двумя системами сигнальных молекул на ранних стадиях болезни может привести к компенсаторному замещению недостаточности функции одной газотрансмиттерной системы другой и как следствие к стабилизации артериального давления [27, 28]. Дальнейшее сокращение активности соответствующих ферментов в NO- и H2S-нейронах, а затем и концентрации этих клеток, наблюдающееся при АГ II—III, способствует закреплению стабильной гипертонии.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям. Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (госконтракт №14.740.11.0186).

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.