Доступность оксида азота при церебральной микроангиопатии

Церебральная микроангиопатия (ЦМА), ассоциированная с возрастом и сосудистыми факторами риска, является основной причиной сосудистых когнитивных расстройств (КР), а также причиной инсультов, инвалидности и смертности [1—3].

Артериальная гипертензия (АГ) — основной сосудистый фактор риска спорадической ЦМА [4, 5]. Однако стратегия снижения риска развития деменции стандартным и агрессивным контролем АГ показала противоречивые результаты [6, 7]. Отсутствие лечения, модифицирующего течение ЦМА, обосновывает поиск «лекарственных» мишеней на основе выявленных патогенетических механизмов [2, 4]. Поскольку облигатным условием развития ЦМА является эндотелиальная дисфункция, характеризующаяся снижением биодоступности/дефицитом оксида азота (NO) [8—12], оправдана разработка способов оценки основной функциональной системы синтеза NO — L-аргинин-eNOS-NO. Поддержание баланса данной функциональной системы может стать потенциальной мишенью терапии ЦМА.

В нормальных условиях NO-синтаза (NOS) катализирует превращение аргинина, O₂ и перенос электрона никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) с образованием NO и цитруллина в присутствии тетрагидробиоптерина (BH4) и других кофакторов [9]. Снижение биодоступности/дефицит NO наиболее часто упоминается в связи со снижением активности эндотелиальной NOS (eNOS, NOS3) при эндотелиальной дисфункции. Снижение биодоступности/дефицит NO приводит к формированию вазоспастического, протромботического, воспалительного статуса сосудистой стенки, сопряженного с основными механизмами ЦМА — гипоксией/ишемией и повышенной проницаемостью гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) [9, 11, 12].

Нарушения других звеньев функциональной системы синтеза NO (относительный недостаток аргинина или BH4) приводят к уменьшению синтеза NO через увеличение несвязанной NOS и ее разобщение — сдвиг окисления на молекулярный кислород с образованием O₂- [13, 14]. Среди причин относительного недостатка аргинина — конкурентные взаимоотношения с аргиназой за NOS, ингибирование NOS аналогами аргинина, в первую очередь метиларгининами [15, 16]. Повышение уровня последних препятствует транспорту L-аргинина в эндотелиальную клетку, что приводит к развитию аргининового парадокса — зависимости клеточной продукции NO от экзогенного L-аргинина при насыщении NOS внутриклеточным L-аргинином [16, 17].

Зависимость выработки NO от экзогенного L-аргинина стала основанием для проведения исследований по использованию последнего в качестве препарата, улучшающего функции эндотелия при ряде заболеваний и старении [18—21]. Несмотря на многообещающие результаты большинства исследований, аргинин не нашел широкого применения в официальной медицине. Очевидной необходимостью является определение оптимальной целевой группы [15] на основе показателей, обосновывающих терапию L-аргинином для обеспечения биодоступности NO и предотвращения разобщения NOS.

Гипотеза о целесообразности длительного перорального приема высоких доз L-аргинина для замедления прогрессирования ЦМА и его проявлений была выдвинута более 10 лет назад [22], однако до настоящего времени не нашла развития.

В настоящем исследовании реологические свойства и деформируемость эритроцитов до и после инкубации с L-аргинином использовались для оценки доступности NO/нарушений состояния функциональной системы L-аргинин-eNOS-NO и их выявления среди пациентов с ЦМА, находившихся в условиях дефицита NO и потенциально нуждающихся в терапии L-аргинином. Выбор эритроцитов в качестве индивидуальной модели оценки был обоснован наличием в них eNOS, участвующей в синтезе, транспорте и высвобождении продуктов метаболизма NO и АТФ, активной регуляции деформируемости эритроцитов и текучести крови, контроле системной биодоступности NO и сосудистого тонуса [23—25]. Ценность полученных показателей уточнялась по их связи с выраженностью КР, макроструктурных МРТ-признаков ЦМА и проницаемостью ГЭБ по данным МРТ T1-динамического контрастирования (T1-ДК МРТ).

Цель исследования — разработать тест индивидуальной биодоступности NO на основе изменения реологических свойств эритроцитов после инкубации с донатором оксида азота и оценить роль данных нарушений в поражении мозга и развитии КР при ЦМА.

В исследование были включены 73 пациента в возрасте 46—70 лет с когнитивными и другими неврологическими жалобами, изменениями на МРТ головного мозга, соответствующими ЦМА [26] (48 (65,8%) женщин, средний возраст 60,1±6,5 года). Пациенты с гиперинтенсивностью белого вещества (ГИБВ) стадии Fazekas I включались в исследование при наличии АГ 2—3-й степени и/или 1 лакунарного инфаркта или более. Контрольную группу составили 19 добровольцев (14 (73,7%) женщин, средний возраст 56,9±6,4 года) без клинических и МРТ-признаков сосудистой и дегенеративной патологии головного мозга. Оценивались традиционные сосудистые факторы риска: АГ, гиперхолестеринемия, ожирение, сахарный диабет и курение. Тяжесть КР устанавливали на основании оценки когнитивных функций по Монреальской шкале (MoCA).

МРТ-исследование головного мозга проводилось на магнитно-резонансном томографе Siemens MAGNETOM Verio с величиной магнитной индукции 3 Тл с использованием 12-канальной головной катушки («Siemens AG», Erlangen, Германия). ГИБВ оценивалась по шкале Фазекас по T2-FLAIR (оценка 0—3) [27]. Для количественной оценки проводилась полуавтоматическая сегментация ГИБВ с использованием набора инструментов LST (https://www.applied-Statistics.de/lst.htm) для SPM12 (https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm) с последующей ручной коррекцией с помощью программы просмотра ITK-SNAP (https://itksnap.org). Полученные данные сохранялись в качестве бинарной маски с учетом того, что в последующем построены маски для визуально неизмененного белого вещества (НИБВ) для расчета показателей проницаемости ГЭБ.

Для оценки ГЭБ была выполнена T1-ДК МРТ: после двух T1 объемных интерполированных исследований задержки дыхания (T1-VIBE) (углы поворота 2 и 15°) для предконтрастных T1-карт вводился гадодиамид (Omniscan; GE Healthcare) 0,2 мл/кг (т.е. 0,1 ммоль/кг массы тела) со скоростью 3 мл/с внутривенно с помощью инъекционного насоса, а затем последовательно повторяли 3D T1-взвешенную последовательность 100 раз в течение 15 мин 33 с. Параметры сканирования: TR 8,6 мс, TE 4 мс, поле обзора 250 мм, матрица 256×230 откликов, угол переворота 15°, толщина среза 3,6 мм.

Весь массив полученных данных проходил предварительную обработку в программном обеспечении NordicNeuroLab («NordicICE», Норвегия). Она включала: автоматическую коррекцию двигательных артефактов, корегистрацию пре- и постконтрастных данных динамических серий, автоматическое выделение областей оценки содержания контрастного вещества. В качестве данных областей служили синусы твердой мозговой оболочки [28]. Для каждого пациента индивидуально задавались гематокрит, доза и релаксивность контрастного вещества. Для оценки низкой проницаемости ГЭБ при ЦМА использовалась армакокинетическая модель Patlak, включающая карты Ktrans (volume transfer coefficient/коэффициент переноса контрастного вещества через сосудистую стенку), Vp (fractional blood plasma volume/частичный объем плазмы) и AUC (area under curve/площадь под кривой динамического контрастирования), соответствующая задержке контрастного вещества в веществе головного мозга.

После получения карт параметров проницаемости дальнейшая обработка данных проводилась в SPM12 (https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm). Она включала последовательные этапы: корегистрацию каждой из карт параметров проницаемости с T1-изображениями; сегментацию T1-изображений на серое и белое вещество головного мозга с последующей коррекцией полученных изображений с учетом масок НИБВ и ГИБВ и выделением бинарных изображений скорректированного серого вещества с помощью скрипта на базе MatLab (https://matlab.ru/). Расчет показателей проницаемости проводился в программе ITK-SNAP (https://itksnap.org) в сером веществе, НИБВ и ГИБВ путем наложения соответствующих масок на индивидуальные карты проницаемости.

Реологические свойства, такие как кинетика агрегации и дезагрегации эритроцитов, а также их деформируемость, исследовали на лазерном оптическом ротационном клеточном анализаторе LORCA (Laser-assisted Optical Rotational Cell Analyzer, «Mechatronics the Netherlands», Нидерланды). В данном анализаторе реализован метод регистрации интенсивности обратного светорассеяния от образца крови, помещенного между двумя соосными стеклянными цилиндрами для создания простого сдвигового течения [29]. Вращение цилиндров обеспечивает возникновение потока в тонком слое суспензии эритроцитов образца, что вызывает разъединение агрегатов, образующихся в статических условиях. Измерение кинетики спонтанной агрегации происходит после резкой остановки вращения цилиндров. Происходит восстановление формы эритроцитов после деформации в сдвиговом потоке и их спонтанная агрегация, в которой выделяют два этапа — более быстрый этап формирования двухмерных агрегатов, «монетных столбиков», и более плавный этап формирования трехмерных агрегатов. С помощью видеокамеры снимаются показатели дифракции лазерного луча, который фиксирует деформацию, с последующим компьютерным анализом полученных данных. Математическая модель описывает эти процессы с помощью расчета таких показатели, как Ts и Tf — время первой и второй фаз агрегации, а также амплитуды агрегации (Amp), отражающей эффективный размер агрегатов, индекса агрегации (AI), характеризующего агрегационный процесс в целом, и IDmax, т.е. показателя максимально возможной деформации эритроцитов.

Следующий шаг проведения анализа — ступенчатое увеличение скорости сдвига от 0 с^–1 до ~900 с^–1. Эта процедура сопровождается дезагрегацией эритроцитов и позволяет определить скорость сдвига (γ-dis), при которой достигается полная дезагрегация и не образуются новые агрегаты. Этот показатель характеризует прочность эритроцитарных агрегатов [29, 30].

Для исследования влияния донаторов NO на характеристики агрегации, дезагрегации и деформируемости эритроциты инкубировали с L-аргинином в конечной концентрации 10 мкмоль/л (10^–6 ммоль/л) при температуре 37 °C в течение 30 мин, далее проводили повторную оценку реологических свойств.

Определение TGF-β1, FGFs, VEGF-A, в сыворотке крови проводили с использованием наборов реагентов BCM Diagnostics, HIF-1α — Cusabio, t-PA и PAI-1 — Technoclone. При всех исследованиях использовались калибраторы фирм-производителей реагентов. Контроль исполнения анализов иммуноферментным методом проводился в дублях на плашечном ридере VICTOR 2 Perken Elmer (США) с использованием лиофилизированных контрольных сывороток/плазм с низким и высоким содержанием исследуемых параметров.

Исследование одобрено локальным Этическим комитетом ФГБУ «Научного центра неврологии», протокол №12-3/16 от 14.10.16. Все испытуемые подписали форму информированного согласия на участие в исследовании.

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения IBM SPSS 23.0 (IBM SPSS Statistics, версия 23.0, «IBM Corp.», Армонк, штат Нью-Йорк, США) и R 3.4.3 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия). Данные представлены как n (%) для категориальных переменных, или как среднее±стандартное отклонение (mean±SD), или медиана [межквартильный размах (IQR)] для количественных данных. Различия между группами определяли с использованием критерия χ², t-критерия независимых выборок, одномерного дисперсионного анализа или критерия Краскела—Уоллиса. Во всех случаях использовали двусторонние статистические критерии. Нулевая гипотеза отвергалась, если p<0,05. Для оценки предсказательной способности отдельных показателей в развитии ожидаемых исходов использовали ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic) с определением порогового значения, чувствительности, специфичности и площади под кривой.

Реологические свойства эритроцитов до и после инкубации с L-аргинином показаны в табл. 1. Для большинства показателей они имели значимые различия между пациентами с ЦМА и контролем.

Таблица 1. Реологические свойства эритроцитов исходно и после инкубации с L-аргинином

Примечание. * — p<0,05; ** — p<0,005.

Значимость результирующих (после инкубации с аргинином) реологических показателей была оценена по площади под кривой, порогу с оптимальными показателями чувствительности и специфичности, отношению шансов (табл. 2).

Таблица 2. Результирующие (после инкубации с L-аргинином) реологические показатели эритроцитов

Согласно критерию Йодена, γ-dis имел пороговое значение с наибольшей суммой чувствительности и специфичности. Его пороговое значение было использовано для распределения обследуемых на две группы со значениями γ-dis <112 с^–1 и >113 с^–1. Полученные группы различались по наличию сосудистых факторов риска, выраженности когнитивного дефицита и основного МРТ-признака ЦМА — ГИБВ (табл. 3).

Таблица 3. Клиническая характеристика групп с γ-dis <112 с^–1 и >113 с^–1

Примечание. * — p<0,05; ** — p<0,005.

В группе с γ-dis выше пороговой величины (>113 с^–1) преобладали пациенты с тяжелой АГ, сахарным диабетом 2-го типа, ожирением, ГИБВ стадии 2—3 по Фазекасу большей выраженностью КР.

Группы были сравнены по показателям проницаемости ГЭБ, полученных с помощью T1-ДК МРТ (табл. 4).

Таблица 4. Проницаемость ГЭБ по T1-ДК МРТ в группах с γ-dis <112 с^–1 и >113 с^–1

Примечание. * — p<0,05.

Проницаемость ГЭБ по AUC в группе с γ-dis >113 с^–1 по сравнению с группой с γ-dis <112 с^–1 была выше в сером веществе и НИБВ.

Группы были сравнены по циркулирующим показателям повреждения сосудистой стенки, NO и его метаболитов (табл. 5). Сопоставляемые группы различались только по более высокому уровню t-PA в группе с γ-dis >113 (с^–1).

Таблица 5. Сравнение показателей повреждения сосудистой стенки, NO и его метаболитов в группах с γ-dis <112 с^–1 и >113 с^–1

Примечание. * — p<0,05.

Исследование посвящено изучению роли нарушений функциональной системы L-аргинин-eNOS-NO в развитии ЦМА на основе поиска индивидуальных показателей ее состояния. Обоснованность исследования определяется приоритетным значением в инициировании и прогрессировании ЦМА эндотелиальной дисфункции, сопряженной со снижением биодоступности NO [8—12]. Наличие показателей, свидетельствующих об индивидуальных нарушениях в системе L-аргинин-eNOS-NO со снижением биодоступности/дефицитом NO, является крайне ценным, учитывая отсутствие лечения, модифицирующего течение ЦМА [2], возможность использования донатора NO — L-аргинина в качестве терапевтического средства [31—33], в том числе у пожилых ослабленных пациентов с АГ и КР [20]. Несмотря на доказанную зависимость синтеза NO от экзогенного L-аргинина [16, 17] и его эффективность на малых выборках пациентов при патологиях с эндотелиальной дисфункцией [20, 31—33], прием L-аргинина не может быть априорным и неконтролируемым. Это обусловлено его сложным метаболизмом и непредсказуемостью последствий при применении в клинической практике [22], например потенциальной возможностью переключаться с пути eNOS на iNOS и приводить к NO-эксайтотоксичности [34]. Кроме того, отсутствие эффекта от приема L-аргинина в некоторых исследованиях также указывает на необходимость разработки показаний к его применению и поиск индивидуальных чувствительных показателей нарушения биодоступности NO.

Выбор эритроцитов в качестве модели оценки индивидуальных нарушений биодоступности/дефицита NO был предопределен наличием в них eNOS, участвующей в синтезе, транспорте и высвобождении продуктов метаболизма NO и АТФ, регуляции деформируемости эритроцитов и текучести крови, контроле системной биодоступности NO и сосудистого тонуса [23, 24, 35]. Вероятно, функциональная система L-аргинин-eNOS-NO эритроцитов является даже более уязвимой и нестабильной, чем эндотелия. Это обусловлено тем, что эритроциты являются наиболее ранней и легкодоступной мишенью для активных форм кислорода. Многократное участие эритроцитов в окислительно-восстановительном цикле при оксигенации и деоксигенации гемоглобина поддерживает их окислительное повреждение и воспалительные реакции [36]. Это сопряжено с поддержанием разобщения eNOS и дефицита NO, снижением текучести мембран с повышением ее жесткости, лежащими в основе нарушений микроциркуляции [36].

Выбор из свойств эритроцитов деформируемости, агрегации и дезагрегации для выявления лиц с дефицитом NO был обоснован высокой значимостью данных изменений свойств эритроцитов в развитии ЦМА. В эксперименте на релевантной модели ЦМА — спонтанных гипертензивных крысах, склонных к инсульту, установлено, что скопления эритроцитов в капиллярах и артериолах являются первым проявлением патологии, выраженность которой нарастает по мере старения животных [37, 38]. Именно данное патологическое событие инициирует повреждение сосудистой стенки и последующий каскад событий, составляющий морфологическую основу ЦМА, — высокую проницаемость ГЭБ, формирование микрокровоизлияний и микротромбозов, инфарктов мозга вследствие окклюзии артериол [37, 38].

Нами использованы результирующие (после инкубации с L-аргинином) реологические показатели и деформация эритроцитов для расчета площади под кривой, отношения шансов и оптимальных показателей чувствительности и специфичности. Замедление скорости дезагрегации эритроцитов (γ-dis) оказалось лучшим среди оцениваемых показателей в определении пороговых значений для патологии. Это также созвучно с описанным выше феноменом скопления эритроцитов в капиллярах и артериолах как инициирующем и поддерживающем прогрессирование ЦМА [38]. Разделение пациентов по уровню пороговых значений позволило установить связь увеличенного времени дезагрегации эритроцитов (γ-dis) с тяжестью АГ, сахарным диабетом и ожирением. Это подтверждает признанную роль АГ и сахарного диабета в нарушении микроциркуляции [36] и ЦМА [39]. Пациенты с превышением порога γ-dis эритроцитов после инкубации с L-аргинином имели значимо более низкие когнитивные показатели по шкале MoCA, большую ГИБВ и проницаемость ГЭБ в НИБВ и сером веществе, оцениваемую по AUC, соответствующей задержке контрастного вещества в паренхиме мозга. Это позволяет рассматривать превышение пороговых значений γ-dis эритроцитов после инкубации с L-аргинином эквивалентом функционального дефицита NO и указывает на эритроциты как на значимого участника патогенетических процессов при ЦМА. Установленные взаимоотношения для данного показателя могут быть объяснены с позиций феномена капиллярной дисфункции [40, 41] и сопутствующих ей нарушений функционирования нейроваскулярной единицы. Данные процессы являются причиной ухудшения перфузии, неэффективного метаболизма, нарушения целостности ГЭБ [40, 41] и объясняют выявленные связи замедленной скорости дезагрегации эритроцитов после инкубации с L-аргинином с повышенной проницаемостью ГЭБ, выраженностью ГИБВ и КР.

Дополнительно между группами с разной биодоступностью NO были проведены сопоставления по уровню циркулирующих маркеров, ассоциированных с повреждением сосудистой стенки. Мы полагали, что их профиль может свидетельствовать о дополнительных условиях, поддерживающих патологические механизмы при нарушениях биодоступности/дефиците NO. Из всех исследованных показателей только повышение t-PA в группе с γ-dis >113 (с^–1) значимо отличалось от группы с γ-dis <112 (с^–1). t-PA, наряду с его хорошо известной ролью в фибринолизе, обладает плейотропной активностью в ЦНС — нейропластичностью, эксайтотоксичностью, влиянием на проницаемость ГЭБ [42]. Ранее нами была установлена связь повышения уровня t-PA с МРТ-изменениями, связанными с высокой проницаемостью ГЭБ [43]. Однако имеются основания полагать, что совместное действие t-PA, NO и его продуктов окисления обеспечивает континуум сосудистого и церебрального повреждения, ассоциированного с нейродегенерацией и развитием смешанных сосудисто-дегенеративных форм заболевания. Так, в эксперименте на t-PA-дефицитарных мышах было установлено, что повреждения ГЭБ самого по себе недостаточно, чтобы вызвать нейродегенерацию; требуется последующее событие, опосредованное ONOO [44]. Результаты указывают, что повреждение ГЭБ, сопряженное с развитием нейродегенерации, происходит при условии, если NO и ONOO-эксайтотоксичность опосредуются t-PA [44].

Нарушения в функциональной системе L-аргинин-eNOS-NO сопряжено с нарушением дезагрегационных свойств эритроцитов, повышением проницаемости ГЭБ, развитием ГИБВ и КР. Превышение пороговых значений скорости дезагрегации эритроцитов после инкубации с L-аргинином может использоваться для оценки функционального состояния системы L-аргинин-eNOS-NO и выявления лиц с нарушением биодоступности NO. L-аргинин может стать частью терапевтической стратегии ЦМА с КР.

Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда №22-15-00183 (https://rscf.ru/project/22-15-00183).

The study was supported by the Russian Science Foundation (Grant 22-15-00183; https://rscf.ru/project/22-15-00183).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.