Церебральные сосудистые заболевания являются одной из наиболее значимых проблем современной неврологии. Основное место среди причин смертности в развитых странах мира занимают церебральные инсульты, ежегодно поражающие от 5,6 до 6,6 млн человек. Число заболевших острым нарушением мозгового кровообращения (ОНМК) по данным Комитета здравоохранения Санкт-Петербурга ежегодно колеблется от 20,1 тыс. до 22,2 тыс. случаев [1]. По данным Регионального сосудистого центра ГБУ СПб НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе число пролеченных пациентов с ОНМК составило: в 2019 г. — 1706, в 2020 г. — 2043 и в 2021 г. — 2310 человек, что свидетельствует о влиянии COVID-19 на рост количества цереброваскулярных заболеваний.

В связи с этим представляется актуальным дальнейшее изучение патогенеза ОНМК, совершенствование лабораторной диагностики и прогностических алгоритмов при данной патологии.

Цель исследования — изучение патогенетического и клинического значения факторов гипоксического повреждения мозга и медиаторов воспаления в развитии церебрального инсульта, совершенствовании диагностики с использованием лабораторных маркеров повреждения мозга и воспаления у больных в остром периоде ОНМК.

Материал и методы

Обследовано 55 больных с ишемическим инсультом (ИИ) в возрасте 74 (67; 80) лет, из них 25 женщин и 30 мужчин, находившихся на лечении в ГБУ СПб НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе; группа сравнения — 25 человек без ОНМК в возрасте 65 (62; 66,5) лет. Все пациенты обследованы в соответствии с Порядком оказания медицинской помощи больным с ОНМК МЗ РФ №928н, 2012 г.

Критерии включения: верифицированный диагноз ИИ (рубрика по МКБ-10 I63), возраст пациентов от 35 до 80 лет, получение информированного согласия пациента на включение в исследование и выполнение диагностических, исследовательских процедур.

Критерии невключения: тяжелые хронические вирусные и бактериальные инфекции, системные заболевания, хроническая алкогольная и наркотическая зависимость, венерические заболевания, беременность.

Сформированы две группы пациентов в зависимости от исхода ОНМК: 1-я группа — выписанные, 2-я группа — умершие.

Для оценки состояния пациентов использовали следующие стандартные шкалы: оценка тяжести инсульта по шкале Национальных институтов здоровья (NIHSS), индекс мобильности Ривермид (RMI), модифицированная шкала Рэнкина (mRS) для оценки степени инвалидизации и функциональной независимости пациента и индекс коморбидности (ИК) Чарлсона (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика групп пациентов по стандартным шкалам при поступлении, Me (Q1; Q3)

Примечание. * — статистическая значимость показателей между группами p<0,001; ** — статистическая значимость показателей между группами p<0,004.

Для исследования содержания биомаркеров повреждения мозга и воспаления кровь и цереброспинальную жидкость (ЦСЖ) забирали на 1, 3 и 10-е сутки ОНМК. Определяли содержание белка S100b («Fujirebio Diagnostics», Швеция), глиального фибриллярного кислого протеина (ГФКП) («BioVender», Чехия), интерлейкина-6 (ИЛ-6) в сыворотке крови и ЦСЖ; нейроспецифической енолазы (НСЕ) и кортизола в сыворотке крови (ИФА, «Вектор-Бест», Россия), С-реактивного белка (СРБ (C-Reactive Protein, Roche, Cobas c501, «RocheDiagnostics», Швейцария)), проводился клинический анализ крови (Sysmex XN1000, Япония), оценивалось содержание фибриногена (StaCompact, «StagoDiagnostica», Франция).

Протокол исследования одобрен локальным Этическим комитетом (протокол №7 от 21.10.2021).

Статистическая обработка результатов: пакет прикладных программ Statistica 6.0; были определены медиана (Me) и квартили (Q₁; Q₃), коэффициент корреляции Спирмена; прогностическая значимость показателей оценивалась с помощью ROC-анализа. При корреляционном анализе показателей с исходом заболевания выписанным пациентам присваивали 1 балл, умершим — 0 баллов. Статистическая значимость показателей определялась при p<0,05.

Результаты

Степень тяжести неврологического дефицита пациентов с ОНМК по NIHSS при поступлении была определена как легкая (1—4 балла) в 18,2% случаев, средняя (5—15 баллов) в 61,4%, тяжелая (16—20 баллов) в 11,4%, крайне тяжелая (21—42 балла) в 9%.

Динамика состояния пациентов с ИИ с различным исходом в остром периоде заболевания по шкалам NIHSS, RMI и mRS представлена в табл. 2.

Таблица 2. Динамика состояния выписанных и умерших пациентов с ИИ в остром периоде, Me (Q1; Q3)

Примечание. * — статистическая значимость показателей у выписанных и умерших пациентов p₁<0,001; ** — статистическая значимость показателей у выписанных и умерших пациентов p₁<0,05; *** — статистическая значимость между показателями в 1-е и на 3-и сутки после ИИ p₂<0,001.

Нейроспецифические маркеры

Концентрация белка S100b в сыворотке крови у всех пациентов с ИИ в 1-е сутки заболевания умеренно возрастала по сравнению с референсными значениями. Концентрация в ЦСЖ превышала концентрацию S100b в сыворотке крови: у выписанных пациентов — в 1,6 раза, у умерших — в 11 раз. К 3-м суткам наблюдения содержание S100b в крови и ЦСЖ и соотношение концентраций белка в ЦСЖ и крови многократно увеличивались у умерших пациентов (рис. 1, а, б). У выписанных пациентов к 3-м суткам отметили нормализацию содержания белка в сыворотке крови, однако к 10-м суткам возрастала концентрация S100b в ЦСЖ в 7 раз по сравнению с исходной величиной (см. рис. 1, а, б). Выявлена корреляция между тяжестью инсульта (NIHSS) и содержанием S100b в крови (r=0,651, p<0,001) и ЦСЖ (r=0,376, p<0,05). Также концентрация S100b в крови коррелировала с величиной ИК (r=0,568; p<0,01). Прогностическая значимость уровня S100b в сыворотке крови и ЦСЖ в 1-е сутки заболевания для исхода ИИ по данным ROC-анализа составила соответственно AUC=0,793, чувствительность 74%, специфичность 80% и AUC=0,800, чувствительность 75%, специфичность 80%.

Рис. 1. Содержание белка S100b у пациентов с ИИ.

а — содержание белка S100b в сыворотке крови у пациентов с ИИ; б — содержание белка S100b в ЦСЖ у пациентов с ИИ.

ГФКП является строго специфичным белком астроцитарной глии, который в норме обнаруживается только в ЦНС. В ЦСЖ содержание ГФКП у пациентов обеих групп возрастало уже в 1-е сутки; на 3-и сутки заболевания концентрация протеина увеличивалась только у больных с летальным исходом (рис. 2). Отмечена связь между содержанием ГФКП в ЦСЖ и величиной NIHSS (r=0,422, p<0,01). В сыворотке крови ГФКП был выявлен только у умерших больных на 3-и сутки после ИИ в концентрации 1,88 (1,01; 2,74) нг/мл, что является достоверным показателем нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и увеличения тяжести поражения мозговой ткани.

Рис. 2. Содержание ГФКП в ЦСЖ больных с ИИ.

НСЕ обнаруживается в клетках нейроэктодермального происхождения — нейронах центральной и периферической нервной системы [2], в связи с чем ее выявление в сыворотке крови у больных с ОНМК также может свидетельствовать о нарушении ГЭБ. Содержание НСЕ в крови у выписанных и умерших пациентов в 1-е сутки возрастало по сравнению с референсными значениями в 4,1 и 6,8 раза соответственно. Концентрация НСЕ к 3-м суткам наблюдения у пациентов с летальным исходом была выше, чем у выписанных: 14,4 (11,1; 59,2) и 11,3 (4,4; 14,1) нг/мл соответственно (p=0,009) (рис. 3).

Рис. 3. Содержание НСЕ в крови пациентов с ИИ.

Маркеры воспаления

Наличие умеренного лейкоцитоза — 9,2 (7,7; 11,3) 10⁹/л, нейтрофилеза — 7,2 (5,5; 9,1)10⁹/л и увеличение концентрации ИЛ-6 в крови пациентов в 1-е сутки ИИ отражали развитие острой воспалительной реакции в ответ на локальное ишемическое повреждение мозга. Количество нейтрофильных гранулоцитов (НГ) коррелировало с исходом заболевания (r=–0,456, p<0,01) и в большей степени возрастало у пациентов с тяжелым ИИ. У выписанных пациентов количество НГ — 4,2(3,2; 5)·10⁹/л в крови к 10-м суткам приближалось к норме — 3(2,5; 4)·10⁹/л, в то время как у умерших больных сохранялось повышенным — 7,7(6,9; 9,3)·10⁹/л. Прогностическая значимость количества НГ для исхода ИИ составила: AUC=0,830, чувствительность 88%, специфичность 78%.

Концентрация ИЛ-6 многократно возрастала как в ЦСЖ, так и в сыворотке крови умерших больных в 1-е и 3-и сутки наблюдения; в ЦСЖ и сыворотке крови выписанных пациентов уровень цитокина возрастал незначительно (рис. 4, а, б). Содержание ИЛ-6 как в сыворотке, так и в ЦСЖ коррелировало с величиной NIHSS (r=0,417, p<0,01; r=0,537, p<0,001), mRS (r=0,369, p<0,05; r=0,477, p<0,05), а также с исходом ОНМК (соответственно r=–0,408, p<0,01; r=–0,807, p<0,001).

Рис. 4. Содержание ИЛ-6 у пациентов с ИИ.

а — содержание ИЛ-6 в ЦСЖ пациентов с ИИ; б — содержание ИЛ-6 в сыворотке крови пациентов с ИИ.

Увеличение концентрации ИЛ-6 в крови было ассоциировано с продукцией и секрецией СРБ клетками печени (r=0,451, p<0,01) (рис. 5). В свою очередь концентрация СРБ в крови отражала тяжесть ОНМК по NIHSS (r=0,206, p<0,05).

Рис. 5. Содержание СРБ в крови пациентов с ИИ.

Увеличение концентрации в крови маркеров воспаления: СРБ, ИЛ-6 и фибриногена сочеталось с содержанием кортизола в сыворотке крови (r=0,549, p<0,001; r=0,423, p<0,01; r=0,450, p<0,01 соответственно). Наблюдаемая кортизолемия была ассоциирована с NIHSS (r=0,199, p<0,05), степенью инвалидизации по mRS (r=0,373, p<0,01) и исходом заболевания (r=–0,450, p<0,01).

Таким образом, развитие воспалительной реакции имело место у всех пациентов с ОНМК в 1-е сутки заболевания; у больных с NIHSS=16 баллов и более воспаление приобретало системный характер.

Обсуждение

Острая ишемия мозга обусловливает изменение функций эндотелия капилляров, клеток макроглии (астроцитов, олигодендроцитов, эпендимы), макрофагов ЦНС [3, 4] и нейронов с последующим повышением проницаемости ГЭБ в первые часы инсульта. Эти изменения сопровождаются увеличением содержания нейроспецифических белков (НСБ) и медиаторов воспаления (ИЛ-1β и ИЛ-6) в крови и ЦСЖ [5—7]. Анализ полученных нами результатов исследования клинических проявлений ИИ, нейроспецифических и воспалительных биомаркеров свидетельствовал о том, что тяжесть инсульта ассоциирована с увеличением концентрации НСБ, маркеров воспаления и кортизола на протяжении всего периода наблюдения.

Белок S100b — специфический белок астроцитов, м.м. 21кДа, состоит из двух субъединиц β или α в различных комбинациях: αα (S-100a), αβ (S-100 ab) и ββ (S-100b). В астроцитах и шванновских клетках сосредоточено 85—90% S100b, в нейронах — 10—15%, в олигодендроцитах — около 1% [8]. S100b как Ca²⁺-связывающий белок нервной ткани регулирует проницаемость ионных каналов. Гибель астроцитов по типу некроза приводит к нарушению целостности мембраны клеток в зоне пенумбры очаговых инфарктов и усилению высвобождения S100b из цитозоля во внеклеточное пространство и далее через ГЭБ — в кровь, что ведет к увеличению концентрации S100b в крови [9]. Активированные под воздействием гипоксии астроциты, обеспечивающие контакты микрососудов мозга и нейронов, усиливают секрецию и продукцию НСБ, в том числе S100b, ГФКП и НСЕ. У больных с NIHSS >16 баллов нами наблюдалось многократное увеличение концентрации белка S100b в ЦСЖ и крови на 3-и сутки после инсульта. Астроцитарный ответ на острую церебральную ишемию достигает максимума на 3—4-е сутки также и по данным M. Herrmann и соавт. [9]. В ЦСЖ выписанных пациентов концентрация S100b возрастала в 2,8 раза только на 10-е сутки, а концентрация в крови не отличалась от этого показателя у людей из группы сравнения. О связи содержания S100b в сыворотке крови и ЦСЖ с клиническими проявлениями ОНМК свидетельствует выявленная корреляция между S100b и NIHSS (соответственно r=0,800, p<0,001; r=0,727, p<0,05) и величиной ИК (r=0,669; p<0,001). Величина NIHSS также коррелировала с индексом ИК (r=0,477; p<0,01). Выявленные связи концентрации S100b в крови с величиной NIHSS и ИК отражают степень повреждения глиальных и нейрональных клеток, нарушение ГЭБ. В настоящее время S100b включают в группу маркеров «измененного своего» или маркеров клеточного повреждения (Damage Associated Molecular Pattern — DAMP), в которую также входят связанные с повреждением клеток белки теплового шока, фибронектин, фибриноген, олигосахариды гиалуроновой кислоты, распознаваемые преимущественно рецепторами фагоцитов [10, 11]. Коморбидность (см. табл. 1) позволяет предположить дисфункцию эндотелия у обследованных пациентов, которая в значительной степени определялась наличием хронической сосудистой патологии (хроническая сердечная недостаточность, гипертензия, сахарный диабет, болезни почек и др.).

ГФКП (м.м. 40—53 кДа) синтезируется астроцитами, играет ключевую роль в дифференцировке и росте астроцитов [12], энергетическом обеспечении нейронов, принимает участие в образовании ГЭБ и во взаимодействии олигодендроцитов и миелиновых оболочек [13]. Концентрации S100b и ГФКП в крови отражают размер очага гипоксического повреждения мозга [14], видимое при КТ головного мозга [9]. Очевидно, что и ГФКП также можно рассматривать как маркер клеточного повреждения — DAMP. В то же времяГФКП и S100b являются основными регуляторами и эффекторами репаративных процессов, протекающих в мозге после различного рода повреждений [14, 15], реализация которых обеспечивается активацией продукции ростовых факторов, взаимодействием олигодендроцитов, микроглиии, эндотелиальных клеток [13].

НСЕ — это нейрональный белок, составляет 1—2% от общего количества всех водорастворимых белков в головном мозге; накапливается в нейронах при их окончательной дифференцировке [2]. Несмотря на общепринятое мнение о специфичности НСЕ как нейронального маркера, имеются сообщения о присутствии этого фермента в глиальных клетках. A. Gójska-Grymajło и соавт. [16] показали в своих исследованиях, что концентрация НСЕ в крови пациентов на протяжении 9 дней ОНМК коррелирует с количеством и функциональными характеристиками стволовых клеток в крови [16]. Источники литературы указывают на повышение концентрации НСЕ при инсульте [5, 16, 17], травме нервной системы [18], доброкачественных опухолях мозга, связанное с объемом повреждения мозга и степенью неврологического дефицита. Нами наблюдалось увеличение концентрации НСЕ в крови у умерших пациентов на 3-и сутки после ОНМК, достоверно отличающееся от концентрации у выписанных пациентов. При этом достоверной корреляции с величиной NIHSS, RMI, mRS и исходом заболевания выявлено не было.

Одновременно с исследованием нейроспецифических маркеров было проанализировано формирование воспаления, его выраженность в те же сроки наблюдения и связь анализируемых параметров. Источниками ИЛ-6 в ЦСЖ являются активированные микро- и макроглиоциты и нейроны, а при нарушении ГЭБ ИЛ-6 может поступать в кровоток [19—21]. Источниками ИЛ-6 в крови могут быть активированные моноциты, тканевые макрофаги, B-лимфоциты и фибробласты [22]. Обнаружено значительное увеличение концентрации ИЛ-6 в ЦСЖ в 1-е и 3-е сутки у пациентов с летальным исходом (см. рис. 4, а), а также в крови в 1—10-е сутки (см. рис. 4, б). Это свидетельствовало как о воспалительной активации клеток нейроглии и нейронов, так и о развитии системного воспаления. Определена очень хорошая прогностическая значимость концентрации ИЛ-6 в ЦСЖ для исхода ИИ: AUC=0,893, чувствительность 93%, специфичность 67% и в крови: AUC=0,771, чувствительность 70%, специфичность 73%. В период максимальной концентрации ИЛ-6 в ЦСЖ (1—3-и сутки) нами не наблюдалось увеличения цитоза и содержания белка в этой же пробе ЦСЖ, что свидетельствовало об асептической природе воспаления в мозге.

Тем не менее у всех пациентов в 1-е сутки ОНМК наблюдался умеренный нейтрофильный гранулоцитоз. Наличие очага повреждения и тканевая гипоксия в головном мозге, активация эндотелия, выход в ЦСЖ маркеров клеточного повреждения — DAMP [10, 11], воспалительных цитокинов, и, возможно, антигенов сопутствующей бактериальной микрофлоры, в том числе патоген-ассоциированых молекулярных паттернов (Pathogen Associated Molecular Pattern — PAMP) [10], активизируют миграцию нейтрофильных гранулоцитов из костного мозга в кровь. Кортизолемия также может способствовать развитию гранулоцитоза посредством снижения адгезивных свойств НГ и, таким образом, относительному увеличению циркулирующего пула этих клеток. По нашим данным, прогностическая значимость количества НГ для исхода ИИ составила: AUC=0,830, чувствительность 88%, специфичность 78%. Таким образом, количество НГ в крови является чувствительным маркером воспалительной реакции и при ИИ.

Ранним маркером эндокринного ответа на воспаление и острую ишемию мозга является увеличение концентрации кортизола в крови. Кортизолемия одновременно отражает регулирующее влияние на уровень воспаления посредством ограничения чувствительности клеток крови и эндотелия к медиаторам воспаления. Также кортизол обратимо ингибирует продукцию воспалительных цитокинов, острофазовых белков, эйкозаноидов и др. Прогностическая значимость уровня кортизола для исхода ИИ составила: AUC=0,777, чувствительность 80%, специфичность 70%.

Концентрации ИЛ-6, СРБ, кортизола в крови ассоциированы с содержанием S100b также в крови (соответственно r=0,707, p<0,001; r=0,452, p<0,01; r=0,557, p<0,01), что может свидетельствовать о вовлечении S100b как маркера клеточного повреждения в развитие воспаления у пациентов с ИИ.

Заключение

Увеличение содержания в крови и ЦСЖ маркеров повреждения мозговой ткани и системного воспаления в ответ на ишемию мозга отражает синергию этих патологических процессов у пациентов с ОНМК, их ассоциацию с тяжестью церебрального инсульта и его исходом. Полученные данные свидетельствуют о том, что постишемическое высвобождение НСБ, увеличение содержания ИЛ-6, СРБ и кортизола позволяют дополнительно характеризовать тяжесть церебрального инсульта и реакцию организма на повреждение, прогнозировать исход заболевания.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.