Фактор роста эндотелия сосудов VEGF и металло-лигандный гомеостаз в патогенезе ишемического инсульта

Ишемический инсульт (ИИ) вызывает цепочку биохимических перестроек, приводящих к функционально-адаптационным изменениям в головном мозге [1].

Изучение многоуровневых механизмов, важных для жизни патологических процессов на молекулярном, нейрональном, системном и организменном уровнях, выявление их связи и взаимодействий являются актуальными задачами фундаментальной медицины. Выявление механизмов патогенеза дизрегуляционной патологии головного мозга необходимо для разработки нового алгоритма диагностических критериев и новой стратегии реабилитационной терапии с целью обеспечения максимальной сохранности мозговой ткани при дисциркуляторных расстройствах, а также с целью первичной и вторичной профилактики инсульта [2, 3].

Всемирной организацией по борьбе с инсультом принята концепция «время—мозг», важна каждая минута для максимального сохранения нейронов и синапсов и восстановления большинства функций головного мозга. Для этой цели необходима разработка биомаркеров самых ранних признаков неврологических нарушений и надежных критериев сохранности мозговой ткани при уже произошедшей сосудистой катастрофе [4, 5].

Цель исследования — изучение сопряженной динамики VEGF и компонентов металло-лигандного гомеостаза у больных в остром периоде ИИ.

На базе неврологического отделения Клинической больницы №123 ФМБА России было проведено комплексное исследование роли VEGF, мощного проангиогенного протеина, с ключевой ролью в регуляции ангиогенеза и микроэлементов в этиопатогенезе ИИ.

Обследованы пациенты с ИИ (n=158) в острейшем периоде, возраст от 50 до 75 лет, средний возраст — 68±0,7 года; из них 87 (55%) мужчин и 71 (45%) женщина.

У обследованных пациентов по критериям TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment) были диагностированы атеротромботический, кардиоэмболический, лакунарный патогенетические подтипы ИИ.

Критерии включения в исследование: верифицированный ишемический инсульт; возраст обследуемых 18 лет и старше. Критерии невключения в исследование: геморрагический характер инсульта, смешанный характер инсульта. Группа сравнения представлена здоровыми (n=150), возраст от 50 до 60 лет, средний возраст — 56±0,6 года; мужчин — 102 (68%), женщин — 48 (32%).

Методом иммуноферментного анализа ELISA была определена концентрация в сыворотке крови специфического белка VEGF (пг/мл). Анализ выполнялся в клинико-диагностической лаборатории Клинической больницы №123 ФМБА России на автоматическом биохимическом анализаторе «Сапфир-400», автоматическом гематологическом анализаторе Medonic MC-15, МЕК 7222, автоматическом иммуноферментном анализаторе «Лазурит», «Вектор-бест», Россия), с использованием реагентов производства «Randox» (Великобритания), «CORMAY» (Польша), «Юнимед» (Россия), «Вектор-бест» (Россия) . Пробы крови брали свободным истечением из локтевой вены утром натощак через 12—14 ч после приема пищи.

Определение концентрации макро- и микроэлементов в сыворотке крови проводилось методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой (прибор NexION 300D, Perkin Elmer, США). Была определена концентрация в сыворотке крови: макроэлемента — магния (Mg) и микроэлементов — меди (Cu), марганца (Mn), селена (Se), цинка (Zn) и железа (Fe) (мкг/мл).

Пробоподготовка сыворотки крови для определения концентрации микроэлементов. Образцы сыворотки разбавлялись в пропорции 1:15 подкисленным дилюентом. Дилюент состоит по объему из 1% 1-Butanol (#1.00988, Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany), 0,1% Triton X-100 (Sigma #T9284 Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, MO 63103 USA) и 0,07% HNO3 (Fluka #02650 Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, MO 63103 USA), растворенных в дистиллированной деионизованной воде с удельным сопротивлением 18,2 Мом/см, полученной с использованием деионизатора (9000602, Labconco Corp., Kansas City, MO 64132, USA). Такой дилюент имеет pH=2,0, он быстро и полностью растворяет клетки крови и протеины, позволяя получать чистые и стабильные растворы образцов.

На этом пробоподготовка заканчивается и полученный раствор образца вводится для анализа в масс-спектрометр с индуктивно связанной плазмой (или в англоязычной литературе ICP-MS — inductively coupled plasma mass spectrometry) ИСП-МС систему Nexion 300D (PerkinElmer Inc., Shelton, CT 06484, USA). Такая технология пробоподготовки разработана в Центре биотической медицины проф. А.В. Скальным.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета прикладных программ Statistica 10 и метода оптимальных достоверных разбиений (ОДР), входящего в группу методов интеллектуального анализа данных Data mining [6—8].

На первом этапе исследования были определены значения концентрации VEGF (пг/мл) в сыворотке крови у пациентов с ИИ и здоровых. Пациенты были разделены на две группы, различающиеся по концентрации VEGF: в одну группу вошли пациенты с концентрацией VEGF <246 пг/мл, (нормальное значение показателя), в другую вошли пациенты с концентрацией VEGF >246 пг/мл (патологическое значение показателя).

Как показали уже первые результаты нашего исследования, у мужчин с ИИ по сравнению со здоровыми концентрация VEGF была значительно выше и составила 708,596 и 152,21 пг/мл соответственно (p=0,000000) (табл. 1).

Таблица 1. Средние значения VEGF (пг/мл), макро- и микроэлементов в группах мужчин с ИИ и здоровых

В табл. 1 представлены значения макро- и микроэлементов у мужчин больных ИИ и здоровых с разной концентрацией VEGF (пг/мл). Были зарегистрированы статистически значимые различия концентрации микроэлементов в сыворотке в группах мужчин с ИИ и здоровых.

На следующем этапе исследования нами была определена концентрация макро- и микроэлементов в группе мужчин с ИИ, характеризующихся высокой концентрацией VEGF >246 пг/мл (табл. 2).

Таблица 2. Значение фактора VEGF, макро- и микроэлементов (мкг/мл) у мужчин (n=87) с ИИ при высоком уровне VEGF >246 пг/мл

Примечание. Здесь и в табл. 3: M — среднее значение; SD — стандартное отклонение; Me — медиана; Min — минимальное значение; Max — максимальное значение.

Были обнаружены статистически значимые различия между концентрацией VEGF в группе больных ИИ и здоровых.

Аналогичное сравнение концентрации макро- и микроэлементов в сыворотке крови в группе женщин с ИИ, храктеризующихся высокой концентрацией VEGF >246 пг/мл и в группе здоровых женщин (табл. 3).

Таблица 3. Значение фактора роста VEGF, макро- и микроэлементов у женщин с ИИ (n=71), при высоком уровне VEGF >246 пг/мл

В сыворотке крови у мужчин и женщин с ИИ не наблюдается достоверной разницы в концентрациях VEGF и макро- и микроэлементов.

Данные результаты свидетельствуют о наличии многоуровневых механизмов ИИ, представленных на молекулярном и биохимическом уровнях. Участие специфического белка VEGF в многофакторном этиопатогенезе ИИ в комплексе с показателями концентрации макро- и микроэлементов дает основание для разработки стратегии оптимизации репаративных процессов ишемизированной нервной ткани с помощью модуляции металло-лигандного гомеостаза.

На следующем этапе статистической обработки результатов был использован метод ОДР, входящий в группу методов интеллектуального математического анализа Data mining. Для анализа было проведено разделение пациентов с ИИ на две группы: 1) с VEGF >750 пг/мл и 2) с VEGF <750 пг/мл. В качестве целевой переменной Y был выбран бинарный показатель уровня VEGF, задаваемым с помощью порога 750 пг/мл (верхняя граница нормы) [8].

Нами выявлены закономерности, которым подчиняется соотношение концентраций VEGF, Cu и Zn.

Наблюдения, соответствующие уровню VEGF >750 пг/мл, на диаграммах обозначены +. Наблюдения, соответствующие уровню VEGF <750 пг/мл, на диаграммах обозначены О.

На рисунке показано распределение значений Mn и Cu друг относительно друга с разделением на подгруппы в зависимости от уровня VEGF.

График рассеяния с квадрантами распределения значений Mn и Cu друг относительно друга с разделением на подгруппы в зависимости от уровня VEGF у пациентов с ИИ.

При уровне Mn выше 0,921 мкг/мл и уровне Cu ниже 1,115 мкг/мл (верхний левый квадрант I) содержится только 4 наблюдения, соответствующие пациентам с VEGF >750 пг/мл. В верхнем правом квадранте II, напротив, преобладают наблюдения с VEGF <750 пг/мл: 6 наблюдений, соответствующих уровню VEGF >750 и 16 наблюдений, соответствующих уровню VEGF <750 пг/мл. При уровне Mn <0,000185 мкг/мл уровень VEGF повышается с ростом содержания Cu.

Такое соотношение показателей является закономерным, если учесть, что Cu является обязательным фактором во всех ангиогенных сигнальных каскадах настолько, что дефицит Cu приводит к уменьшению неоваскуляризации [9].

В то же время Mn играет важную роль в предупреждении апоптоза посредством Mn-зависимых эндонуклеаз и регуляции Mn — супероксиддисмутаза: связь между уровнем VEGF и содержанием Cu носит противоположный характер при уровне Mn выше и ниже границы 0,00185 [10—12].

Проведенное исследование подтвердило сопряженность комплекса показателей, находящихся на разных уровнях биологической организации (атомарном, как Mg, Cu, Mn, Se, Zn и Fe, и биохимическом, как VEGF, которые принимают участие в патогенезе ИИ). VEGF является ключевым фактором ангиогенеза и нейрогенеза, осуществляя еще и нейропротекторную функцию. Металло-лигандный гомеостаз является важным эндогенным звеном в механизмах патогенеза ИИ: макро- и микроэлементы принимают участие в ферментативных реакциях и входят в состав подавляющего большинства кофакторов ферментов, факторов танскрипции ДНК.

Выявленные механизмы формирования ишемии мозга и разработка стратегии устранения патологических звеньев ишемического каскада необходимы для оптимизации лечения больных с ИИ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.