Генетические и негенетические факторы лабораторной резистентности к клопидогрелу у больных с ишемическим инсультом

В России инсульт ежегодно поражает около 500 тыс. человек, его частота — 3—4,5 случая на 1000 населения в год. На долю ишемического инсульта (ИИ) приходится около 80—88% случаев [1, 2]. Более 100 тыс. пациентов переносят повторный инсульт [3], при этом летальность при повторных инсультах выше, чем при первичных [4]. Доминирующую долю среди повторных инсультов также занимает ИИ [5]. Почти 80% пациентов из-за последствий ИИ инвалидизируются и не могут вернуться к прежней трудовой деятельности [6]. Таким образом, повышение эффективности и безопасности лечения и вторичной профилактики ИИ остаются актуальной проблемой современной клинической неврологии.

Антиагрегантная терапия является основной в лечении и вторичной профилактике некардиоэмболического ИИ [7]. Одна из проблем применения антиагрегантов — резистентность к антитромбоцитарной терапии. Пациенты с лабораторной или клинической резистентностью к антиагрегантам имеют повышенный риск возникновения повторных сердечно-сосудистых событий [8]. Частота развития резистентности к ацетилсалициловой кислоте (АСК) достигает 65%, к клопидогрелу — значительно ниже — 30% [9]. Другая не менее важная проблема — развитие геморрагических осложнений на фоне применения антитромбоцитарных препаратов (геморрагическая трансформация ишемического очага или образование внутримозговой гематомы) [10], их частота в среднем составляет 1,4% [11], а желудочно-кишечные кровотечения возникают в 1—3% случаев [12].

На сегодняшний день наиболее часто применяемым в мире антитромбоцитарным препаратом является клопидогрел — антиагрегант из группы тиенопиридинов II поколения, пролекарство и необратимый антагонист P2Y12-рецепторов тромбоцитов [13, 14]. По данным Национального Датского регистра (2007—2010), включавшего больных с ИИ и транзиторными ишемическими атаками (ТИА), получавших АСК, клопидогрел или комбинацию дипиридамола с замедленным высвобождением и АСК, большинство пациентов принимали клопидогрел для вторичной профилактики ИИ [15].

Персонализированная стратегия с использованием фармакогенетического подхода к прогнозированию антиагрегантного действия клопидогрела у пациентов с ИИ является перспективным методом оптимизации применения антиагрегантов в рамках первичной и вторичной профилактики ИИ [16]. Несколько групп генов определяют эффекты клопидогрела. Ген ABCB1 кодирует гликопротеин-Р — белковый транспортер ABCB1, отвечающий за абсорбцию клопидогрела из желудочно-кишечного тракта. Гены семейства цитохрома Р-450 (CYP2C19 и др.) кодируют ферменты, обеспечивающие метаболизм клопидогрела в печени [17].

Цель исследования — выявить клинико-фармакогенетические предикторы эффективности клопидогрела у больных с ИИ на основе генотипирования по CYP2C19 (CYP2C19*2 (G681A, rs4244285), CYP2C19*3 (G363A, rs4986893), CYP2C19*17 (C806T, rs12248560) и ABCB1 (C3435T, rs1045642).

В исследование был включен 121 больной с некардиоэмболическим ИИ, госпитализированный в региональный сосудистый центр (ГБУЗ «Иркутская областная клиническая больница») в 2016—2017 гг. Диагноз И.И. выставляли в соответствии с критериями классификации сосудистых заболеваний головного мозга [18]. Этническую дифференциацию в группе больных с ИИ не проводили.

Были включены 82 (68%) мужчины и 39 (32%) женщин, средний возраст которых составил 61,6±7,7 года, что соответствует закону нормального распределения. Отмечено преобладание первичного ИИ — 93 (76,9%) пациента в сочетании с атеротромботическим патогенетическим подтипом ИИ — 81 (66,9%). Очаг инфаркта по данным магнитно-резонансной томографии (МРТ) локализовался в бассейне внутренней сонной артерии у 79 (65,3%) больных, в вертебрально-базилярной системе — у 42 (34,7%).

В динамике (при поступлении и при выписке на 13—21-е сутки) оценивали степень тяжести инсульта по шкале инсульта национального института здоровья (NIHSS), степень нетрудоспособности по шкале Рэнкина, индекс мобильности Ривермид. Оценивали риск повторных сердечно-сосудистых осложнений (ССО; The Essen Stroke Risk Score, ESRS).

Бо́льшая часть больных имели ряд сопутствующих заболеваний, являющихся факторами риска И.И. Избыточная масса тела при индексе массы тела (ИМТ) 30 кг/м² и более зарегистрирована у 40 (33%) больных, артериальной гипертензией страдали 120 (99,2%) пациентов, сахарным диабетом — 35 (28,9%), ранее перенесли инфаркт миокарда — 24 (19,8%), хроническая сердечная недостаточность и ишемическая болезнь сердца диагностированы у 113 (93,4%) больных с ИИ, ТИА в анамнезе — у 65 (53,7%), курение — у 54 (44,6%), заболевания периферических сосудов — у 19 (15,7%). У 108 (89,3%) больных с ИИ определен высокий риск повторных ССО в течение года.

У 101 (83,5%) больного с ИИ поражения центральных артерий головы (по данным ультразвуковой допплерографии) расценены как гемодинамически незначимые, гемодинамически значимые наблюдали только у 14 (11,5%) пациентов, и в 6 (5%) случаях поражения магистральных артерий головы отсутствовали.

Все исследуемые пациенты в рамках лечения и вторичной профилактики церебрального инсульта в первые 24 ч госпитализации или не ранее чем через 24 ч после тромболитической терапии (алтеплаза), получали 0,125 г АСК, далее — клопидогрел в дозе 0,075 г/сут.

Остаточную реактивность тромбоцитов (ОРТ) определяли в динамике (при поступлении, на 7-е и 13-е сутки) на четырехканальном светооптическом агрегометре (Helena AggRAM, Великобритания) с добавлением в качестве индукторов агрегации тромбоцитов адреналина и аденозиндифосфата (АДФ). Методика стандартизирована в лаборатории гемостаза ГБУЗ «Иркутская ордена «Знак Почета» областная клиническая больница». Референсные значения ОРТ с добавлением адреналина составляли 55—65%, АДФ — 65—75%. Схема обследования (кроме генотипирования) и лечения соответствовала стандарту оказания специализированной медицинской помощи при инфаркте мозга (приказ МЗ РФ № 1740 от 29.12.12).

Генотипирование проводили в Научно-исследовательском центре ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России (Москва), куда доставляли пробирки с 4 мл замороженной цельной крови. Взятие крови из вен локтевого сгиба осуществляли «закрытым» вакуумным способом в вакуумные пробирки («Вейхай Хониюй Медикал Девайсез Ко., Лтд», Китай) с К3 ЭДТА. Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из лейкоцитов проводили с помощью набора реагентов ДНК-Экстран-1, предназначенного для выделения геномной ДНК из цельной крови (ЗАО «Синтол», Москва, Россия). Носительство полиморфных маркеров генов CYP2C19*2 (G681A), CYP2C19*3 (G363A), CYP2C19*17 (C806T) и ABCB1 (C3435T) определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (Real-Time PCR) с помощью наборов реагентов SNP-Скрин (ЗАО «Синтол», Москва, Россия) на амплификаторе Real-Time CFX96 Touch («Bio-Rad Laboratories», Inc., USA). Программа включала предварительную денатурацию при 95 °C в течение 3 мин, затем 40 циклов: денатурация при 95 °C в течение 15 с, отжиг при 63 °C в течение 40 мин.

От каждого пациента было получено добровольное информированное согласие на обработку персональных данных, использование и хранение результатов, полученных в ходе клинико-фармакогенетического исследования. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ГБУЗ «Иркутская ордена «Знак Почета» областная клиническая больница» (протокол № 73 от 29.11.16) и выполнено в дизайне открытого обсервационного продольного проспективного когортного клинико-лабораторного исследования.

Статистическую обработку осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 и Instat. Средние значения количественных переменных представлены как средние значения (М) и стандартное отклонение (СО). Для подтверждения возможности использования данных статистических параметров с целью описания количественных данных определяли соответствие закону нормального распределения, при этом статистически значимыми считали значения р<0,05. Предварительно данные проверены на нормальность распределения и однородность дисперсных групп с использованием критериев Шапиро—Уилки или Колмогорова—Смирнова в зависимости от числа пациентов в исследуемых группах, а также на однородность дисперсных групп (критерий Левена). Для проверки статистических гипотез использовали параметрические и непараметрические критерии в зависимости от характера распределения признака, дисперсии вариационного ряда и количества вариант. Различия между независимыми выборками определяли с помощью t-критерия Стьюдента, критерия χ² и W-критерия Вилкоксона для парных сравнений.

Для подтверждения независимого распределения аллелей в изучаемых полиморфизмах оценивали соответствие закону Харди—Вайнберга с использованием авторского калькулятора, полученные результаты популяционного исследования соответствовали закону Харди—Вайнберга при значении р>0,05. Для оценки различий частот полиморфных аллелей использовали точный тест Фишера и отношение шансов.

При оценке неврологического статуса по шкале NIHSS число больных с ИИ, имеющих оценку менее 10 баллов при поступлении, составило 100 (82,6%), а при выписке — 107 (96,7%). Степень инвалидизации по шкале Рэнкина у 102 (84,33%) больных при поступлении расценено как тяжелое и крайне тяжелое нарушение жизнедеятельности (≥4 баллов), при выписке только у 8 (6,6%) пациентов сохранялась подобная степень инвалидизации. Индекс мобильности Ривермид менее 7 баллов, предполагающий невозможность самостоятельной ходьбы, в том числе с помощью вспомогательных средств, при поступлении в общей группе наблюдения определен у 108 (89,3%) больных, при выписке — только у 6 (5,0%).

В исследуемой группе определены и идентифицированы полиморфизмы CYP2C19 (CYP2C19*2 (G681A, rs4244285), CYP2C19*3 (G363A, rs4986893), CYP2C19*17 (C806T, rs12248560) и ABCB1 (C3435T, rs1045642). Распределение по всем исследуемым генотипам соответствовало закону Харди—Вайнберга: CYP2C19*2 (G681A) (χ²=0,0001, р=0,99), CYP2C19*3 (G363A) (χ²=0,03, р=0,85), CYP2C19*17 (C806T) (χ²=0,96, р=0,33), ABCB1 (C3435T) (χ²=1,81, р=0,18).

В зависимости от степени изменения ОРТ на 13-е сутки на фоне применения клопидогрела больные с ИИ были отнесены к двум основным группам: с лабораторной чувствительностью к клопидогрелу (ЛЧК) — эта группа включала пациентов, имеющих показатели АДФ-индуцированной агрегации от низкой ОРТ (≤20%) до ≤65%; с лабораторной резистентностью к клопидогрелу (ЛРК), включающая больных с ИИ с ОРТ от >65% до высокой ОРТ (>75%). Таким образом, группа больных с ИИ с ЛЧК составила 111 (91,7%), а группа с ЛРК — 10 (8,3%) пациентов. Сравнительная клинико-демографическая характеристика этих групп больных с ИИ представлена в табл. 1.

Между группами с ЛЧК и ЛРК отмечено статистически значимое гендерное различие: частота мужчин в группе с ЛЧК составила 70,3%, а в группе с ЛРК 60% составили женщины (р=0,0001). В исследовании Dong-mei Jia и соавт. [19] пол пациента также указан как один из прогностических критериев неэффективности клопидогрела. В группе больных ЛЧК статистически значимо превалировал первичный ИИ — 78,4% (р=0,0093). Атеротромботический И.И. чаще отмечен в группе больных ЛРК — 80% (р=0,0384). Частота ожирения в группе с ЛРК составила 60% (р<0,0001). Заболевания периферических сосудов чаще встречали в группе пациентов с ЛЧК — 16,2% (р<0,0001). В этой же группе больных с ИИ достоверно чаще верифицированы поражения магистральных артерий головы разной степени выраженности, их частота составила в общей сумме 96,4% по сравнению с группой с ЛРК — 80% (р=0,0008). Зарубежные авторы указывают на такие негенетические факторы, влияющие на изменчивость эффективности клопидогрела, как возраст, пол, ожирение, фоновые заболевания [20].

Сравнение групп больных с ИИ с ЛЧК и ЛРК по CYP2C19*2, CYP2C19*3, CYP2C19*17 и ABCB1 представлено в табл. 2.

Учитывая, что в данном исследовании не было выявлено четкой клинико-лабораторной ассоциации между «медленными», «быстрыми» аллелями по гену CYP2C19, полиморфизмами ABCB1, дополнительно был проведен однофакторный дисперсионный анализ для классификации изучаемых полиморфизмов по CYP2C19 (CYP2C19*2 (G681A, rs4244285), CYP2C19*3 (G363A, rs4986893), CYP2C19*17 (C806T, rs12248560) и ABCB1 (C3435T, rs1045642) методом касаний, который позволяет показать вклад, в данном случае, генетического маркера в изменение агрегации тромбоцитов (табл. 3).

Высокий (R²=0,7—1) и средний (R²=0,3—0,7) коэффициенты корреляции, имеющие место при исследовании полиморфизмов CYP2C19 — CYP2C19*2 (G681A), CYP2C19*3 (G363A), CYP2C19*17 (C806T) у больных с ИИ, свидетельствуют о значимом влиянии генотипов гена CYP2C19 на показатели ОРТ.

Изменения АДФ-индуцированной агрегации и индекса дезагрегации тромбоцитов на фоне терапии и вторичной профилактики клопидогрелом в зависимости от генотипа по CYP2C19*2 (G681A), CYP2C19*3 (G363A), CYP2C19*17 (C806T) и ABCB1 (C3435T) представлены в табл. 4.

Кроме того, анализ сопутствующей лекарственной терапии в группе обследуемых больных с ИИ продемонстрировал статистически значимое влияние на лабораторную эффективность клопидогрела тромболитической терапии в первые часы госпитализации, блокаторов кальциевых каналов, ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) и статинов (табл. 5).

При использовании в схеме лечения блокаторов кальциевых каналов частота случаев снижения эффективности в группе с ЛРК оказалась выше, чем в группе с ЛЧК — 80,0,0 и 61,3% соответственно (р=0,0053). При применении ингибиторов АПФ частота случаев в группе с ЛРК также была выше, чем в группе с ЛЧК — 100 и 92,8% соответственно (р=0,0210). Таким образом, блокаторы кальциевых каналов и ингибиторы АПФ могут способствовать снижению эффективности клопидогрела, что обусловлено межлекарственным взаимодействием [23]. Также выявлено, что применение гиполипидемических препаратов статистически значимо влияет на чувствительность тромбоцитов к клопидогрелу: частота применения статинов в группе с ЛРК составляет 100% по сравнению с группой с ЛЧК — 90,1% (р=0,0035). Это может объясняться тем, что функциональная активность гликопротеина-Р, который является белком-переносчиком, в том числе лекарственных средств, может как повышаться, так и снижаться под влиянием ряда лекарственных средств, а также конкуренции некоторых лекарственных средств за систему цитохрома Р-450. При совместном применении субстратов гликопротеина-Р, например клопидогрела, с его ингибиторами концентрация субстратов в плазме крови повышается, что может привести к развитию нежелательных побочных реакций. И наоборот, совместный прием субстратов и индукторов гликопротеина-Р способствует снижению концентрации субстратов в крови и, как следствие, уменьшению их эффективности. Блокаторы кальциевых каналов, аторвастатин, ловастатин, ингибиторы АПФ являются как субстратами, так и мощными ингибиторами гликопротеина-Р [24].

Таким образом, на эффективность и безопасное применение клопидогрела оказывают большое влияние две принципиально разные группы факторов: генетические и негенетические (клинико-демографические). Эти факторы могут влиять либо на фармакокинетику, либо на фармакодинамику антиагрегантов [25]. Поэтому персонализированный подход к подбору антиагрегантной терапии с учетом рисковых факторов является важным и перспективным в современной медицине.

Исследование ОРТ методом светооптической агрегометрии можно считать высокоинформативным методом контроля функции тромбоцитов и мониторинга антиагрегантной терапии. Дополнительным и клинически значимым с позиции клинической информативности является метод генотипирования по генам CYP2C19 (CYP2C19*2 (G681A, rs4244285), CYP2C19*3 (G363A, rs4986893), CYP2C19*17 (C806T, rs12248560) и ABCB1 (C3435T, rs1045642), который может использоваться в случае неэффективности клопидогрела или при наличии высокого риска геморрагических осложнений антиагрегантной терапии в рамках лечения и вторичной профилактики И.И. Совместное использование двух методик в данном случае может повысить эффективность и безопасность антиагрегантной терапии, позволит проводить своевременную и обоснованную коррекцию фармакотерапии антиагрегантами.

Хотя исследование имело ограниченный размер выборки, его результаты могут представлять интерес для практической ангионеврологии, учитывая вариабельность клинико-лабораторного ответа на применение клопидогрела, необходимость персонализированного подхода к назначению антиагрегантов больным с И.И. Необходимы дальнейшие исследования для более детального изучения других вероятных факторов, связанных с изменением эффективности клопидогрела, а также требуется более тщательное исследование роли фармакогенетических исследований в клинических алгоритмах антиагрегантной терапии и вторичной профилактики ИИ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Сычев Дмитрий Алексеевич — e-mail: dmitry.alex.sychev@gmail.com; https://orcid.org/0000-0002-4496-3680

Шпрах Владимир Викторович — e-mail: irkmapo@irk.ru; https://orcid.org/0000-0003-1650-1275

Китаева Елена Юрьевна — e-mail: kitaevaey@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-9498-4503

Мирзаев Карин Бадавиевич — e-mail: karin05doc@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-9307-4994

Михалевич Исай Моисеевич — https://orcid.org/0000-0003-4854-3277

Автор, ответственный за переписку: Китаева Елена Юрьевна —
e-mail: kitaevaey@mail.ru