Клеточная терапия ишемического инсульта (ИИ) является новым и быстро развивающимся методом. Как целое экспериментальное направление она возникла в 90-е годы, когда было предпринято несколько успешных попыток трансплантации нейральных стволовых клеток (НСК) при нейродегенеративных заболеваниях и хронических инфарктах головного мозга в области базальных ядер [1—3]. С тех пор было выполнено множество экспериментов по введению различных типов стволовых клеток (СК) и прогениторных клеток животным с моделью острой фокальной ишемии, которые показали положительный терапевтический эффект клеточной терапии. Обобщенные результаты доклинических исследований за последние три десятилетия, а также преимущества и недостатки каждого типа СК, различные пути их трансплантации были отражены в 1-й части статьи.

В настоящей работе обобщены предполагаемые механизмы действия СК и оптимальное время их трансплантации, представлены результаты завершенных клинических исследований, а также освещены правовые нормы использования клеточных технологий на территории Российской Федерации.

В отличие от тромболитической терапии предполагаемое терапевтическое окно клеточной терапии при ИИ составляет длительный промежуток времени: в экспериментальных исследованиях [4] сообщается о положительном эффекте клеточной трансплантации от 12 ч до нескольких месяцев после развития острого нарушения мозгового кровообращения. Оптимальное время трансплантации СК до сих пор не определено. Во многом это связано с тем, что выбор терапевтического окна напрямую зависит от предполагаемого механизма действия того или иного типа СК.

Трансплантация СК может иметь заместительный характер. Такой механизм в большей степени свойствен для фетальных НСК, а также нейральных прогениторных клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных СК (ИПСК) и эмбриональных СК (ЭСК). Известно, что клетки данных типов не только дифференцируются в зрелые нейроны, но и устанавливают синаптические контакты в мозге реципиента. Более того, использование методов электрофизиологии [5] показало, что трансплантированные клетки функционально активны и способны встраиваться в нейронные сети мозга реципиента. Однако основная часть трансплантированных клеток остается в недифференцированном состоянии и в мозг интегрируется лишь малая часть введенных клеток. Таким образом, положительный эффект в большей степени связан не с замещением погибших нейронов, а с тем, что СК способны производить разные факторы (например, фактор роста эндотелия сосудов, фактор роста нервов, нейротрофический фактор мозга, основной фактор роста фибробластов и др.), оказывающие воздействие на мозг реципиента [6, 7]. Данный механизм также объясняет и терапевтический эффект клеток с меньшим нейральным потенциалом, таких как мезенхимальные СК (МСК) и гематопоэтические СК (ГПСК). Выделяемые клетками факторы обладают рядом эффектов, в том числе и нейропротективными свойствами. В некоторых работах [8—10] показано, что МСК и ГПСК при внутривенном введении проникают в мозг в очень небольшом количестве (от 5 до 15%) или же вовсе не обнаруживаются в нервной системе. Несмотря на это, у экспериментальных животных улучшалось функциональное восстановление, а сами СК детектировались в периферических органах. Следовательно, может существовать еще один предполагаемый механизм эффектов СК — действие через органы-мишени, в частности подавление хронического воспаления опосредованно, через костный мозг и селезенку [11]. Еще одним механизмом воздействия на мозг реципиента является стимуляция эндогенного нейрогенеза. Трансплантация разных типов СК вызывает усиление нейрогенеза [12, 13]. Новообразованные нейробласты способны мигрировать, дифференцироваться и замещать погибшие клетки. Тем не менее большая часть новообразованных клеток все равно погибает [14]. Трансплантированные С.К. стимулируют не только нейрогенез, но также и ангиогенез. ИИ приводит к нарушению кровоснабжения головного мозга и, как следствие, к изменению метаболизма и гибели нейронов. Восстановление кровоснабжения может стимулировать репарацию, а также предотвратить дальнейшую гибель нейронов в зоне пенумбры [15]. Помимо этого, СК обладают иммуномодулирующими свойствами. Выделяемые трансплантированными клетками факторы способны снижать воспалительную реакцию в мозге реципиента [11]. Важным механизмом, задействованным при трансплантации СК, является стимуляция пластичности мозга. Термин «пластичность мозга» имеет крайне широкое толкование и включает в себя изменения в нервной системе от молекулярного до поведенческого уровня. Стимуляция ветвления дендритов, спрутинга аксонов и образование новых нейрональных связей между нейронами реципиента и между нейронами и трансплантированными СК могут объяснять положительный эффект клеточной терапии [16].

Таким образом, можно полагать, что при остром ИИ целесообразна системная трансплантация CК, которые обладают нейропротективным эффектом, способны подавлять воспаление, процессы апоптоза и уменьшать вазогенный отек вещества мозга. Также важна возможность быстрой аллогенной трансплантации. Для таких целей наиболее подходящими кандидатами могут быть МСК и ГПСК. В подостром периоде эффективным может быть системное введение различных типов СК, выделяющих паракринные факторы, стимулирующие пластичность мозга, процессы ангиогенеза, нейрогенеза. В отсроченном периоде, когда в веществе мозга уже сформированы постинфарктная киста или глиальный рубец, реципиенту может быть выполнена внутримозговая трансплантация разных НСК, которые могут дифференцироваться в нейрональном направлении, оказывать прямой замещающий эффект и встраиваться в нейронные сети [17].

Были проанализированы результаты завершенных клинических исследований в период с 2010 г. по настоящее время. В таблице представлены данные о 23 клинических исследованиях с указанием авторов, страны испытания, фазы и дизайна исследования, числа участников, типа и дозы СК, способа и срока введения СК после инсульта, эффективности и побочных эффектов клеточной терапии.

Большая часть клинических испытаний (16) проводилась в отсроченном периоде ИИ (от нескольких недель до 60 мес от начала заболевания). Вероятно, такая тактика при составлении дизайна исследований позволила упростить рекрутирование пациентов, оценку безопасности лечения в связи со стабильным состоянием больных, а также дала возможность подтвердить сам факт терапевтической эффективности именно в хроническом периоде, когда все прочие меры малоэффективны. Лишь в 3 исследованиях [18—20] трансплантация СК была выполнена в течение первых 12—72 ч от начала симптоматики и еще в 6 СК вводились в течение первой недели [21—26]. Авторы одного из таких исследований [27] поделились трудностями, с которыми они столкнулись при включении пациентов с острым инсультом, а также предложили пути их решения. Так, включение в исследование пациентов с обширными инфарктами мозга и риском развития дислокационного синдрома может затруднить оценку побочных эффектов от клеточной терапии и случаев смерти, так как такие больные могут нуждаться в проведении декомпрессионной краниотомии. Решить проблему сможет проведение магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного мозга перед трансплантацией с оценкой объема очага инфаркта мозга (в мм³) для определения критерия невключения. Также пациентов после проведения внутривенного тромболизиса следует оценивать на наличие предикторов геморрагической трансформации для облегчения дальнейшей интерпретации результатов [28]. Необходимо также учитывать, что пациентам, которые получают антикоагулянтную терапию, невозможно выполнить пункцию костного мозга и выделить аутологичные костномозговые МСК.

В более чем ½ части исследований пациентам вводились аутологичные СК, выделенные из костного мозга: МСК [29—32], CD34+ ГПСК [23, 33] и мононуклеарные клетки [18, 21, 22, 24—26, 34—39]. В остальных исследованиях использовались аллогенные СК из различных источников: МСК из пуповинной крови [19, 40] и костного мозга [20], трансфицированные МСК линии SB623 для улучшения выживаемости после трансплантации [41], фетальные НСК [19] и иммортализованные НСК [42]. Предпочтение врачей и ученых аутогенным СК можно объяснить этическими аспектами, отсутствием необходимости поиска доноров и создания банка СК, а также гарантированной иммунологической совместимостью. Важным недостатком аутотрансплантации является временной фактор. Если у пациента нет заранее замороженных в достаточном количестве СК, но трансплантация неизбежно будет ограничена сроками, необходимыми для аспирации костного мозга, приготовления клеточного препарата и его транспортировки до пациента, которые в большинстве работ составляли около недели. Также есть данные [43, 44], что возраст доноров может оказывать влияние на свойства полученных СК: с увеличением возраста характеристики СК могут изменяться в худшую сторону.

В проанализированных исследованиях превалировало системное внутривенное и внутриартериальное введение МСК, ГПСК, мононуклеарных клеток костного мозга. Дозировка С.К. для внутривенного введения пересчитывалась на 1 кг массы тела реципиента на основании данных доклинических исследований и в среднем была порядка 10⁷—10⁸ СК, разведенных в 250 мл физиологического раствора (или 1—2 млн СК/кг массы тела). Введение в вену осуществлялось через периферический катетер со средней скоростью 2 мл/мин. Во всех случаях внутриартериальную трансплантацию СК вводили в сегмент M1 средней мозговой артерии (СМА) при помощи постановки эндоваскулярного катетера под контролем ангиографии. Дозировки С.К. были порядка 10⁷, однако клеточный препарат вводился в меньшем объеме (10—15 мл) и с более низкой скоростью (в среднем 0,5—1 мл/мин). В 2 исследованиях было выполнено стереотаксическое внутримозговое введение иммортализованных НСК в область базальных ядер ипсилатерального полушария [42] или модифицированных МСК по периферии от очага инфаркта мозга [41]. Клеточная суспензия вводилась в концентрации порядка 10⁶ СК в объеме 20 мкл (на одну инъекцию). Было протестировано и интратекальное введение [33, 38] в дуральный мешок в сегменте L4—L5. Для такой трансплантации использовали только аллогенные НСК в концентрации порядка 10⁶—10⁷ в объеме около 2 мл. Также в одном из испытаний [19] была выполнена комбинированная трансплантация: внутривенно вводились МСК, выделенные из плаценты, а затем интратекально в мозжечково-мозговую цистерну фетальные НСК. Важно отметить, что трансплантация в остром периоде инсульта была только внутривенной или внутриартериальной, остальные типы введения выполнялись в отсроченном периоде из соображений безопасности.

Состояние пациентов в разных исследованиях мониторили в промежутке от 6 мес до 5 лет после трансплантации С.К. Ни в одном из клинических испытаний не было выявлено связанных с терапией жизнеугрожающих побочных реакций, в частности возникновения опухолей, реакции иммунологического отторжения, внезапной смерти, нарушений ритма сердца или функции дыхания. Стоит отметить, что с 2010 г. в клинических испытаниях пациентам не вводились эмбриональные или индуцированные плюрипотентные клетки, трансплантация которых вызывала образование тератокарцином в экспериментальных исследованиях на животных [45]. Также нет данных о клеточной эмболии при внутриартериальном введении клеток, хотя контрольная МРТ не всегда выполнялась сразу после трансплантации [46]. При внутримозговом введении отмечались выраженные побочные эффекты, связанные с самой процедурой трансплантации: асимптомные субдуральные и эпидуральные гематомы, кровотечения в области трепанационного отверстия, судорожный синдром, пневмонии, а также вазогенный отек вещества мозга вокруг трансплантата. Среди распространенных побочных реакций многие исследователи отметили озноб, кратковременное повышение температуры тела до субфебрильных и фебрильных цифр после системной трансплантации, головокружение, тошноту, потерю аппетита. Наиболее серьезным побочным эффектом явилось развитие парциальных или генерализованных судорожных приступов [22, 36] у пациентов после трансплантации, которые требовали затем назначения противоэпилептических препаратов. Патогенез развития судорожного синдрома в ответ на трансплантацию СК, особенно костномозгового происхождения, в настоящий момент неизвестен. Есть неподтвержденные гипотезы, что это может быть своеобразной реакцией отторжения трансплантата, результатом микроэмболии мозговых сосудов, следствием «встраивания» СК в нейронные сети реципиента [45] или реакцией на выделяемые СК паракринные факторы. В пользу последней гипотезы может свидетельствовать известный клиническим неврологам феномен развития эпилептических приступов после введения пептидных препаратов у предрасположенных пациентов (с обширными инфарктами мозга, объемными образованиями и эпилептиформной активностью, по данным электроэнцефалографии). Необходимо отметить, что судороги также составляют более ½ всех осложнений со стороны нервной системы при трансплантации ГПСК у детей с онкогематологическими заболеваниями [47]. Однако в экспериментальных исследованиях на грызунах с моделью инфаркта мозга никогда ранее не сообщалось о развитии подобного побочного эффекта после трансплантации СК. В связи с выявленными данными может быть целесообразно кратковременное превентивное назначение противоэпилептических препаратов пациентам, получающим клеточную терапию.

В 19 из 23 исследований, представленных в таблице, было отмечено улучшение функционального исхода больных по окончании периода наблюдения. Оценка неврологического статуса производилась по шкале тяжести инсульта Национального института здоровья (National Institutes of Health Stroke Scale — NIHSS), функционального статуса — по модифицированной шкале Рэнкина, а двигательная активность — по индексу Бартел. В некоторых работах эффективность была подтверждена результатами нейровизуализации. Так, S. Banerjee и соавт. [23] выявили уменьшение объема очага инфаркта мозга по данным МРТ после внутриартериальной трансплантации аутогенных ГПСК. A. Bhasin и соавт. [32] при помощи функциональной МРТ подтвердили улучшение функциональных тестов после внутривенного введения мононуклеарных клеток.

При анализе результатов вышеупомянутых исследований следует обратить внимание, что практически во всех из них критерием включения для пациентов было наличие инфаркта мозга только в системе СМА. Очевидно, что этот критерий был выбран для создания гомогенности выборки и удобства интерпретации данных, однако он не позволяет сделать вывод об эффективности терапии, например при стволовых инфарктах. Также большинство клинических исследований были открытыми нерандомизированными I фазы, включали небольшие когорты пациентов (от 4 до 40 участников), часто без группы контроля, основной целью которых явилась проверка в первую очередь безопасности клеточной терапии. Группа сравнения была только в 11 из 23 испытаний, а крупных (50 и более пациентов) рандомизированных контролируемых клинических исследований на текущий момент завершено только 4 [20, 29, 37]. Во время одного из таких многоцентровых исследований D. Hess и соавт. [20] выявили положительный терапевтический эффект только при системной трансплантации аллогенных МСК в окне 12—36 ч от момента появления симптоматики. При трансплантации спустя 48 ч статистически значимого положительного эффекта не отмечалось.

Несмотря на множество исследований, все авторы сходятся во мнении, что необходимы дальнейшее развитие и изучение данного направления, в особенности механизмов действия трансплантированных клеток после трансплантации человеку. В некоторых работах были предприняты первые шаги в этом направлении. В работе F. Moniche и соавт. [24] была выявлена корреляция улучшения неврологического статуса с уровнем цитокинов в плазме крови пациентов. В двух других испытаниях [34, 36] было показано распределение в организме меченных радиофармпрепаратом на основе ⁹⁹технеция мононуклераных клеток костного мозга после их внутриартериального введения. СК детектировались в мозге в полушарии введения через 2 ч после трансплантации, но в следующие 48 ч сигнал сохранялся только у части пациентов. Причина такой вариабельности остается неизученной. Большая часть введенных клеток накапливалась в паренхиматозных органах. Представленные данные о распределении СК после системного внутриартериального введения у человека согласуются с таковыми, полученным при экспериментальных исследованиях на животных.

В РФ правовые аспекты применения клеточных технологий в клинической медицине не были полноценно регламентированы до 2017 г. Лишь 1 января 2017 г. вступил в силу Федеральный закон № 180-ФЗ от 23.06.16 «О биомедицинских клеточных продуктах» (180-ФЗ), который является универсальным и регулирует весь спектр вопросов использования клеточных технологий, включая отношения, связанные с разработкой, исследованиями, экспертизами, государственной регистрацией, производством и медицинским применением биомедицинских клеточных продуктов (БКП), а также регулирует вопросы донорства биологического материала для производства клеточных продуктов, в том числе в целях проведения исследований.

Согласно 180-ФЗ, БКП, используемые в клинической медицине, могут быть только трех типов: аутологичный (БКП, содержащий клетки самого пациента), аллогенный (БКП, содержащий клетки донора), комбинированный (БКП, содержащий клетки нескольких доноров).

При этом законом строго запрещено использование биологического материала, полученного путем прерывания процесса развития эмбриона или плода человека. Согласно закону, получение биологического материала от донора возможно после прохождения полного обследования, необходимого для исключения противопоказаний для получения от него материала, за счет производителя БКП. Прижизненное донорство может быть только добровольным, безвозмездным и возможно при заполнении письменного информированного согласия самим потенциальным донором или его законным представителем. Посмертное донорство допускается при юридически заверенном прижизненном волеизъявлении; при отсутствии такового — с заверенного письменного согласия ближайших родственников погибшего.

Проведение клинических исследований БКП осуществляют организация, обладающая правами на результаты доклинических и клинических исследований БКП и/или на технологию производства БКП, или уполномоченное ею юридическое лицо, образовательная организация высшего образования, образовательная организация дополнительного профессионального образования, научная организация. Такая организация вправе привлекать к сотрудничеству иные юридические лица независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности. При этом финансирование клинического исследования может осуществляться из средств самой организации, бюджетных средств или иных источников, не запрещенных законодательством РФ.

Для проведения клинического исследования медицинскому учреждению необходимо пройти экспертизу качества БКП, предоставив все необходимые документы для получения разрешения на проведение клинического исследования (приложение необходимых документов указано в пунктах 1—11, 13 части 2, статья 9 180-ФЗ).

Государственный контроль в сфере обращения БКП будет осуществляться федеральным органом исполнительной власти (часть 1, статья 46 180-ФЗ). Регистрационное удостоверение на впервые регистрируемый в РФ БКП выдается со сроком действия 5 лет. Участие пациента должно быть добровольным и подтверждается его подписью или подписью его законного представителя на информационном листке пациента, в котором описаны продукт, его эффективность, цели и продолжительность исследования, а также степени риска, которому может подвергнуться пациент. При этом пациент или его законный представитель имеет право отказаться от участия в клиническом исследовании биомедицинского клеточного продукта на любой стадии. Статья 32 (утверждена 18.09.2018) настоящего закона регламентирует обязательное страхование жизни и здоровья испытуемого за счет организации, осуществляющей проведение клинического исследования биомедицинского клеточного продукта.

Таким образом, клеточная терапия при ИИ с использованием ауто- и аллогенных МСК, ГПСК, мононуклеарных СК костного мозга, НСК, по данным клинических исследований, показала свои безопасность и целесообразность. Хотя во многих проведенных испытаниях было показано улучшение неврологического статуса и функционального исхода у пациентов, окончательно эффективность клеточной терапии для каждого из типов СК еще предстоит подтвердить при многоцентровых рандомизированных контролируемых исследованиях. В настоящий момент во всем мире начато и продолжается около двух десятков таких исследований II фазы [45], основной целью которых является изучение эффектности клеточной терапии. В РФ на сегодняшний день разработана законодательная база для проведения подобных клинических исследований и внедрения в клиническую практику отечественных БКП.

Работа выполнена в рамках программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013—2020 гг., тема 0518−2018−0005.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: dadnam89@gmail.com