Несмотря на существование множества терапевтических подходов, эффективность лечения алкогольной зависимости в настоящее время остается невысокой. В связи с этим во всем мире продолжается активный поиск препаратов, которые должны соответствовать следующим основным критериям: снижать тягу к алкоголю, устранять эйфорию, вызванную алкоголем, т. е. блокировать механизмы подкрепления, обладать минимальными побочными явлениями, не иметь собственного аддиктивного потенциала [1—3].

Такой поиск может быть основан на знании фундаментальных механизмов нейрохимических нарушений, лежащих в основе формирования алкогольной зависимости. Показано, что высокий риск потребления алкоголя связан с функциональной недостаточностью мезолимбической дофаминовой системы [4]. Среди многих причин дисфункции дофаминовой нейромедиации в первую очередь следует назвать нарушение механизмов ее ауторегуляции. Как известно, вызванное алкоголем освобождение дофамина в окончаниях дофаминовых нейронов среднего мозга приводит к активации постсинаптических дофаминовых D1- и D2-рецепторов клеток-мишеней и дофаминовых ауторецепторов, расположенных на пресинаптических окончаниях аксонов дофаминовых нейронов [5]. Дофаминовые ауторецепторы являются одним из ключевых компонентов системы «обратной связи» [6]. Они принадлежат к семейству D2-рецепторов, сопряжены с ингибиторными G-белками, а их активация дофамином запускает внутриклеточный каскад реакций, приводящих к ингибированию аденилатциклазы и/или изменению активности К⁺— и Са²⁺-каналов, что в свою очередь приводит к блокаде освобождения медиатора [6, 7]. Известны две изоформы D2-рецептора, образующиеся в процессе альтернативного сплайсинга, причем «короткая» форма (D2-S) доминирует в качестве пресинаптического ауторецептора, а «длинная» (D2-L) — постсинаптического рецептора [6, 8]. Предполагают, что в физиологических условиях значение ауторегуляции не столь велико, как в условиях гиперактивации дофаминовых нейронов, например при действии психоактивных веществ [9]. В качестве доказательства участия D2-ауторецепторов в регуляции активности дофаминового нейрона можно привести данные, полученные в экспериментах на мышах с инактивированным геном D2-рецептора [10]. Кроме того, было показано, что эта регуляция осуществляется разными путями. Во-первых, активация D2-ауторецепторов может приводить к снижению активности тирозин-гидроксилазы (ТН) и, как следствие этого, к угнетению синтеза дофамина в среднем мозге [11]. Во-вторых, активация D2-ауторецепторов может приводить к усилению обратного захвата дофамина с помощью дофамин-транспортного белка (DAT) [12] и, в-третьих, к изменению экспрессии везикулярного транспортера моноаминов (VMAT2) [13]. В настоящее время накопилось достаточно данных о снижении числа пре- и постсинаптических D-рецепторов и их связывания с лигандами при хроническом действии алкоголя [14]. Однако механизмы этих нарушений до сих пор до конца не исследованы.

Есть основания предполагать, что терапия, направленная на усиление процессов ауторегуляции в дофаминовой системе, может быть эффективной при лечении алкогольной зависимости. В начале 70-х годов прошлого столетия были проведены исследования, показавшие возможность прямого стимулирующего влияния на дофаминовые ауторецепторы с помощью производных алкалоидов спорыньи (бромокриптин, лизурид, перголид, каберголин). Эти препараты отличаются селективностью и аффинностью по отношению к дофаминовым рецепторам разных подтипов [15]. Бромокриптин действует преимущественно на D2 пост- и пресинаптические рецепторы подкорковых ядер, в малой степени на D3-, D4- и D5-типы рецептора. Перголид в равной степени активирует D2-, D3- и D4-рецепторы, в меньшей степени D1- и D5-рецепторы в базальных ганглиях головного мозга. Каберголин обладает высокой аффинностью к D2- и D3-рецепторам, низкой — к D1- и D4-рецепторам и меньшими побочными эффектами, чем другие эрголиновые агонисты дофаминовых рецепторов [16]. Важной для клинического применения особенностью каберголина является длительный период полувыведения, что обеспечивает продолжительную равномерную физиологическую стимуляцию рецепторов [17, 18]. Благодаря своим фармакокинетическим и фармакодинамическим свойствам каберголин занял в свое время одну из первых позиций среди препаратов в терапии гиперлактинемии и болезни Паркинсона [18]. Одно из пионерских исследований эрголиновых агонистов дофаминовых рецепторов как возможных препаратов для лечения алкоголизма было проведено в НИИ общей и судебной психиатрии им. И.П. Сербского в 80-е годы [19]. Было показано, что бромокриптин в малых дозах снижает степень влечения к алкоголю у животных.

Несмотря на наличие достаточно большого числа исследований, целый ряд вопросов, касающихся эффективности и безопасности применения агонистов дофаминовых рецепторов при лечении алкогольной зависимости, остается открытым. В частности, до сих пор не известно, какие механизмы лежат в основе эффекта снижения потребления алкоголя, является ли этот эффект стойким и длительным, каким образом эти препараты влияют на уровень экспрессии генов дофаминовой системы и, прежде всего, самих D2-рецепторов.

Цель настоящего исследования — изучение влияния каберголина на потребление этанола и экспрессию гена DRD2 в мозге животных с использованием экспериментальной модели алкоголизма.

Эксперименты проводились на крысах — самцах линии Wistar (питомник лабораторных животных «Столбовая») в соответствии с требованиями этического комитета МЗ РФ. В период адаптации к условиям вивария животных содержали по 10 крыс в одной клетке, с естественным освещением, при температуре 22±2 °C и свободном доступе к пище и воде.

В работе использовали каберголин (Tocris bioscience). Препарат растворяли в смеси дистиллированной воды и медицинского спирта (3,3%) и вводили внутрибрюшинно. Контрольные животные получали эквивалентный объем растворителя.

После периода адаптации к условиям вивария животные на протяжении 3 мес получали 10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости. После этого они были помещены в индивидуальные клетки и протестированы в модели «свободного выбора» между водой и 10% раствором этанола. В период тестирования (5 дней) ежедневно проводились взвешивание животных и регистрация суточного потребления воды и этанола в граммах. На основании полученных результатов был произведен расчет среднесуточного потребления абсолютного алкоголя (в г/кг массы тела) и сформированы две экспериментальные группы так, чтобы средние показатели потребления алкоголя в них достоверно не отличались. Животным 1-й группы в дальнейшем на протяжении 24 дней внутрибрюшинно (в/б) вводили раствор каберголина в дозе 0,5 мг/кг 1 раз в сутки («алкоголь+каберголин»), а животным 2-й группы — растворитель в объеме, эквивалентном объему вводимого раствора каберголина («алкоголь»). Животные находились в индивидуальных клетках в условиях свободного выбора между водой и 10% раствором этанола при ежедневном контроле массы тела и регистрации суточного потребления воды и этанола.

Контрольная группа крыс (без хронической алкогольной интоксикации) параллельно получала в течение 24 дней внутрибрюшинные инъекции каберголина в дозе 0,5 мг/кг 1 раз в сутки («каберголин»; n=10) или растворителя («растворитель»; n=9). Через 24 ч после последней инъекции животных всех групп декапитировали, выделили структуры мозга для дальнейшего изучения экспрессии гена DRD2. Структуры мозга хранили при –70 °С.

Анализ экспрессии гена DRD2 проводили путем определения количества его продукта, матричной РНК (мРНК). Для выделения мРНК использовали набор RNeasy Lipid Tissue MiniKit (QIAGEN). Количество выделенной мРНК определяли спектрофотометрически («Eppendorf BioPhotometer», Германия). Синтез к-ДНК осуществляли с использованием набора Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit («Fermentas»). Полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (RT-PCR) проводили на амплификаторе Multicolor Real-Time PCR Detection System iQTW5 («BioRad», Германия).

В работе были использованы олигонуклеотидные праймеры (ДНК-синтез, Россия):

DRD2: прямой —5’-cttgatagtcagccttgctgtg-3’;

обратный — 5’- agggcacgtagaatgagacaat-3’;

β-актин: прямой — 5’-cactgccgcatcctcttcct-3’;

обратный — 5’-aaccgctcattgccgatagtg-3’.

Реакционная смесь (объемом 20 мкл) для проведения RT-РCR содержала: 25 нг матрицы (кДНК), 1 UTaq-полимеразы (5 U/mkl), по 0,5 мкл прямого и обратного праймеров (100 пмоль/мкл), 0,125 mM дезоксинуклеозид-трифосфатов (dNTP) (1 мкл 2,5 mM, 0,4-флуоресцентный зонд (SybrGreen, stock 10 000х), 2 мкл 10хПЦР-буфера (MgCl₂+) и 11,5 мкл стерильной воды (MiliQ).

В качестве отрицательного контроля служили пробы, содержащие вместо матрицы соответствующий объем воды.

RT-PCR проводили в следующем режиме: исходная денатурация матрицы — 3 мин при 95 °C; денатурация — 95 °C, 15 с; отжиг праймеров — 60 °C, 15 с; элонгация — 72 °C, 30 с. Реакцию проводили в течение 50 циклов с последующим анализом кривых плавления полученных ПЦР-продуктов. Для наблюдения за ходом реакции и регистрации данных использовали компьютерную программу Opticon Monitor 3.1.

Контроль целостности выделенной мРНК и специфичности полученного в результате RT-PCR продукта осуществляли при помощи электрофореза в 2% агарозном геле на 1хТАЕ буфере. Для визуализации результатов использовали трансиллюминатор («UVCInc.», USA). Для оценки относительного содержания мРНК DRD2 в образцах использовали анализ содержания мРНК референсного гена β-актина в том же образце. Расчет относительной экспрессии проводили на основании сравнительной оценки величин Сt, получаемых после проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для сравнения уровней экспрессии DRD2 относительно мРНК β-актина в опыте и контроле использовали метод «дельта — дельта Си-ти» (ΔΔ Сt) [20]. Измерения ПЦР в режиме реального времени проводили не менее чем в 3 параллельных пробах для каждого опыта и сравнивали между собой показания, полученные не менее чем для 8 животных.

Полученные результаты обрабатывали с помощью пакета программ Statistica 6 с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-теста Манна—Уитни для независимых выборок. Достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05.

После 3 мес принудительной алкоголизации и тестирования животных в условиях свободного выбора были сформированы две группы животных, у которых средние суточные показатели потребления этанола достоверно не различались и составляли 6,8±0,7 и 7,2±0,6 г/кг соответственно. Животные 1-й группы в течение 24 дней получали внутрибрюшинно инъекции каберголина (0,5 мг/кг 1 раз в сутки), 2-й группы — инъекции растворителя.

На рис. 1 можно видеть, что среднесуточное добровольное потребление абсолютного этанола снижалось уже после двух инъекций каберголина. Это снижение достигало максимума после восьмой инъекции каберголина и оставалось практически на одном уровне при дальнейшем введении препарата. Различия между показателями потребления этанола в опытной и контрольной группах были достоверными с 5-го по 24-й дни введения препарата при p<0,05.

Таким образом, каберголин в дозе 0,5 мг/кг снижает потребление алкоголя у длительно алкоголизированных животных и может рассматриваться в качестве препарата, подавляющего алкогольную мотивацию.

Задачей данного этапа исследований было выяснение влияния хронического введения каберголина на уровни мРНК DRD2 в структурах мезолимбической дофаминовой системы. Уровни мРНК определяли в среднем мозге и стриатуме у животных четырех групп: «алкоголь» (хронически алкоголизированные крысы, получавшие в течение 24 дней инъекции растворителя, n=8), «алкоголь+каберголин» (хронически алкоголизированные крысы, получавшие в течение 24 дней каберголин (0,5 мг/кг 1 раз в сутки, n=8), «контроль» (интактные животные, получавшие в течение 24 дней инъекции растворителя, n=9), «каберголин» (интактные животные, получавшие каберголин 0,5 мг/кг 1 раз в сутки, n=10).

На рис. 2 видно, что у животных с хронической алкогольной интоксикацией введение каберголина вызывало достоверное повышение уровня мРНК DRD2 в обеих структурах мозга (р<0,05), более выраженное в среднем мозге. Экспрессия DRD2 в среднем мозге животных, получавших каберголин на фоне потребления алкоголя, была в 3,3 раза, а в стриатуме — в 2,1 раза выше по сравнению с показателями экспрессии у животных без «лечения» каберголином.

У контрольных животных, параллельно с опытными группами получавших в течение 24 дней каберголин, наблюдалась тенденция к снижению уровней мРНК DRD2 в обеих структурах мозга, однако различия между опытной и контрольной группами не были достоверными (рис. 3).

В настоящее время считают, что основное фармакологическое действие каберголина — гипопролактинемическое [21]: каберголин показан при идиопатической или вызванной аденомой гипофиза гиперпролактинемии. По данным клинических исследований фармакокинетики каберголина на здоровых добровольцах, максимальная концентрация в крови (C_max) достигается через 2—3 ч и составляет 30—70 пг/мл при однократном приеме в дозе 0,5—1,5 мг. Каберголин минимально трансформируется в печени, не вызывает индукции или ингибирования цитохрома P450 [17], легко проникает через гематоэнцефалический барьер. Было показано, что в малых дозах каберголин обладает антиоксидантными свойствами [22], а также может оказывать антидепрессивное и анксиолитическое действие [23].

В настоящей работе показано, что каберголин при системном введении в дозе 0,5 мг/кг снижает потребление алкоголя у длительно алкоголизированных животных с высокими показателями добровольного потребления этанола. Возможность регуляции потребления этанола у крыс с помощью каберголина была показана также в работе S. Carnicella и соавт. [24]. В последнее время в литературе активно обсуждается возможная роль нейротрофических факторов в нормализации функций дофаминовой системы с помощью агонистов D2-рецепторов. Именно эта гипотеза нашла подтверждение в работах S. Carnicella и соавт. [24], установивших, что эффект снижения потребления алкоголя может быть связан с активацией экспрессии глиального фактора роста нервов (GDNF) в вентральной покрышке среднего мозга, так как он не выявляется у гетерозиготных GDNF-нокаутных животных. Авторы связывают эффект каберголина на потребление алкоголя, главным образом, с нейропротективными свойствами препарата в отношении дофаминовых нейронов вентральной покрышки, обусловленными активацией экспрессии GDNF. Действительно, нейропротективные свойства каберголина были подтверждены в ряде работ, предполагающих, что в основе терапевтических эффектов препарата лежат синтез белков, обладающих антиоксидантным действием, и, как следствие, стимуляция аутотрофической функции нейронов [18].

В настоящей работе впервые показано, что каберголин вызывает достоверное повышение уровней мРНК DRD2 в среднем мозге и стриатуме у животных с хронической алкогольной интоксикацией. Мы полагаем, что именно этот эффект препарата может лежать в основе наблюдаемого снижения потребления алкоголя животными. Клинические и экспериментальные исследования показали снижение эффективности дофаминовой нейропередачи при алкогольной зависимости. Было установлено уменьшение числа дофаминовых D2-рецепторов в стриатуме больных алкоголизмом [25] и высказана гипотеза, что этот эффект алкоголя лежит в основе дофаминовой дисфункции. Стриатум представляет собой сложную структуру переднего мозга, на нейронах которого происходит конвергенция мотивационных импульсов, импульсов, следующих по дофаминергическому мезолимбическому пути, сигналов от орбитофронтальной коры (обеспечивающих эмоциональную оценку внешних стимулов) и передней поясной извилины (регулирующих силу и характер аффективных реакций) [26]. Ключевую роль в обеспечении этих функций стриатума играют D2-рецепторы, локализованные как пост-, так и пресинаптически, т. е. на терминалях аксонов нейронов, тела которых расположены в среднем мозге. До сих пор не вполне понятно, какие именно из двух типов D2-рецепторов в большей мере подвержены действию алкоголя. Количественный анализ мРНК в среднем мозге и стриатуме позволяет изучать изменения экспрессии DRD2 как на пре-, так и на постсинаптическом уровнях. Уровень экспрессии гена DRD2 в среднем мозге отражает состояние пресинаптических D2-рецепторов, локализованных на окончаниях нейронов, проецирующихся в структуры-мишени (стриатум, префронтальная кора, миндалина) и выполняющих роль ауторецепторов. Уровень экспрессии DRD2 в стриатуме отражает состояние постсинаптического звена, т. е. постсинаптических D2-рецепторов, локализованных на телах, главным образом, ГАМКергических нейронов стриатума. В данном исследовании мы показали, что агонист дофаминовых рецепторов каберголин при хроническом введении приводит к повышению уровня экспрессии гена D2-рецептора в обеих структурах — среднем мозге и стриатуме, практически не влияя на этот показатель у интактных животных. В нашей работе наиболее выраженные изменения экспрессии гена DRD2 при системном введении каберголина были обнаружены в среднем мозге. Это позволяет предполагать, что эффект препарата направлен прежде всего на нормализацию функций ауторецепторного (пресинаптического) звена дофаминовой мезолимбической системы мозга.

Полученные в настоящем исследовании результаты позволяют по-новому взглянуть на возможную сферу применения каберголина. Показано, что каберголин при системном введении в малых дозах вызывает стабильное снижение потребления алкоголя на фоне повышения уровня экспрессии гена D2-рецептора в среднем мозге и стриатуме у животных с длительной хронической алкогольной интоксикацией, сказанное дает основание рассматривать каберголин в качестве перспективного препарата для лечения алкогольной зависимости.

Конфликт интересов отсутствует.