Связь полиморфизма 640a>g гена cyba с риском развития ишемического инсульта у русских в Центральной России

В последние годы большое внимание уделяется исследованию роли активных форм кислорода (АФК) в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), в том числе церебрального инсульта (ЦИ) [1]. Известно, что нарушения клеточного редокс-статуса (баланс между про- и антиоксидантными факторами) существенно влияют на риск развития цереброваскулярных заболеваний, поскольку избыточная продукция АФК способствует развитию дисфункции эндотелия, тромбоза и атеросклероза [2]. В сердечно-сосудистой системе продукцию АФК осуществляют несколько ферментных систем: никотинамидадениндинуклеотид фосфат (NAD (P)H)-оксидазы, эндотелиальная NO-синтаза, ферменты дыхательной цепи, цитохром Р450 монооксигеназы и ксантиноксидазы. Основным фактором, определяющим общий уровень АФК, является скорость генерации исходной молекулы O2–- (супероксидного анионного радикала). Данные исследований свидетельствуют о том, что NAD (P)H-оксидазы, продуцирующие O2–- в результате окисления NAD (P)H или NADH [3], являются одним из основных источников O2–- в церебральных артериях [4]. По своей структуре NAD (P)H-оксидаза представляет собой сложный молекулярный комплекс, включающий группу гетеромерных, ассоциированных с мембранами субъединиц, одной из которых является p22^phox (так называемые цитохром b или CYBA). Субъединица p22^phox является каналом для транспорта электронов NAD (P)H-оксидазы через мембрану и играет ключевую роль в поддержании активности и стабильности NAD (P)H-оксидазы [5].

У человека субъединица p22^phox кодируется геном CYBA, расположенным на длинном плече хромосомы 16. Ген состоит из 6 экзонов и 5 интронов [6]. В промоторной и структурной частях гена p22^phox было обнаружено значительное количество генетических полиморфизмов, некоторые из которых влияют на экспрессию гена и/или функциональную активность NAD (P)H-оксидазы [7]. Наиболее широко исследуемыми в аспекте их влияния на развитие ССЗ являются полиморфизмы C242T, локализованный в структурной части гена и приводящий к аминокислотной замене [8], и 640A>G, локализованный в 3′ нетранслируемой области гена [6]. В литературе имеются данные об ассоциации полиморфизма C242T с риском развития таких ССЗ, как гипертоническая болезнь (ГБ) [9], ишемическая болезнь сердца (ИБС) [10], а также ЦИ [11]. Исследования, посвященные связи полиморфизма 640A>G гена CYBA с риском развития ССЗ, немногочисленны и, в основном, противоречивы [10, 12]. В литературе нами была найдена одна публикация, посвященная связи данного генетического маркера с риском развития ЦИ. В частности, в исследовании G. Yan и соавт. [13] китайской популяции Хан ассоциации с ишемическим инсультом (ИИ) обнаружено не было. Тем не менее отмечен синергизм влияния данного полиморфизма с геном GCH1 на риск развития ИИ.

В связи с тем, что до настоящего момента исследований ассоциации полиморфного маркера 640A>G с развитием цереброваскулярной патологии в России не проводилось, целью настоящего исследования было изучение связи полиморфизма 640A>G гена CYBA с риском развития ЦИ в популяции русских жителей Центральной России.

Исследование проведено на выборке неродственных индивидов русской национальности, проживающих в Курской области (все — уроженцы Центральной России), общей численностью 887 человек.

Обследованы 279 пациентов с ЦИ, которые находились на стационарном лечении в неврологических отделениях Курской областной клинической больницы и Городской больницы скорой медицинской помощи Курска в период с 2007 по 2010 г. [14], а также 166 пациентов с ЦИ, проходивших лечение в Региональном сосудистом центре Курской областной клинической больницы в 2012—2013 гг. Из 445 пациентов ИИ перенесли 393, геморрагический инсульт (ГИ) — 52. Диагноз Ц.И. устанавливался квалифицированными врачами-неврологами на основании оценки неврологического статуса и подтверждался данными магнитно-резонансной томографии головного мозга.

В исследование не включали пациентов с хроническими болезнями сердца, почек, эндокринными, онкологическими и другими заболеваниями, которые могли быть причиной острого нарушения мозгового кровообращения. Все пациенты с инсультом имели ГБ в анамнезе и получали антигипертензивную терапию.

Контрольную группу составили 442 практически здоровых с нормальным уровнем артериального давления. Средний возраст больных с ЦИ (261 мужчина, 184 женщины) составил 61,01±10,03 года, контрольной группы (241 мужчина, 201 женщина) — 61,65±7,98 года. Исследуемые группы были сопоставимы по полу и возрасту. Проведение исследования было одобрено этическим комитетом.

У всех обследуемых проводился забор венозной крови. Геномную ДНК выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфизма 640A>G гена CYBA(rs1049255) проводилось методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени путем дискриминации аллелей с помощью TaqMan-зондов на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad) с использованием олигонуклеотидных праймеров и зондов, описанных в литературе (CGF sequencing^​1​᠎) и синтезированных фирмой «Синтол» (Москва).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программных пакетов Statistica for Windows 8.0. Для оценки ассоциаций аллелей и генотипов с риском развития ЦИ использовали критерий χ² и отношение шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ).

Отклонения частот аллелей и генотипов полиморфизма 640A>G генаCYBAот популяционного равновесия Харди—Вайнберга не наблюдалось. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов исследуемого полиморфизма гена CYBAв группах больных с ЦИ и контрольной представлен в табл. 1, которая свидетельствует, что у больных с ЦИ имело место преобладание частоты гомозиготного генотипа по аллелю дикого типа 640AA (ОШ=1,33, 95% ДИ=0,98—1,81, p=0,07). При этом в контрольной группе значительно чаще, чем среди больных с ЦИ, встречались гетерозиготы 640AG (ОШ=0,77, 95% ДИ=0,59—1,01, p=0,055), но выявленные межгрупповые различия не достигали статистически значимого уровня.

Был проведен стратифицированный анализ ассоциаций частот аллелей и генотипов с риском развития ЦИ в зависимости от типа инсульта. Результаты анализа представлены в табл. 2. Видно, что различий в частотах аллелей и генотипов исследуемого полиморфизма у больных с ГИ выявлено не было. У больных с ИИ наблюдалось преобладание гомозигот по дикому аллею 640AA, но различия не достигали уровня статистической значимости (ОШ=1,35, 95% ДИ=0,98—1,85, p=0,06). Гетерозиготный генотип 640AG достоверно преобладал в контрольной группе (ОШ=0,75, 95% ДИ=0,57—0,99, p=0,04).

В рамках настоящего исследования впервые установлена ассоциация полиморфизма 640A>G гена CYBA с риском развития И.И. Данные литературы о связи полиморфизма 640A>G с риском развития ССЗ крайне противоречивы. Согласно результатам недавно проведенного метаанализа, данный полиморфизм связан с риском развития ИБС [12]. В вышеупомянутом исследовании [13] ассоциации изучаемого генетического маркера с ИИ обнаружено не было. При этом одни исследователи [15] обнаружили протективный эффект G-аллеля, другие [16] — А-аллеля. Полиморфизм 640A>G не приводит к аминокислотной замене, однако его значение подтверждено в исследовании M. Schirmer и соавт. [17], в котором было показано, что продукция АФК у гомозигот GG примерно на 30% меньше, чем у носителей генотипа дикого типа 640AA. Таким образом, функциональные эффекты данного полиморфизма, видимо, могут быть связаны с механизмами посттранскрипционной регуляции NAD (P)H-оксидазы. В частности, было показано [18], что полиморфизм 640A>G влияет на стабильность мРНК и скорость трансляции [18].

Во многих экспериментальных и клинических исследованиях была продемонстрирована ключевая роль сосудистой NAD (P)H-оксидазы в патогенезе ССЗ человека, в том числе таких, как атеросклероз [19] и цереброваскулярные заболевания [20]. NAD (P)H-оксидаза экспрессируется в сосудистой стенке, а именно в эндотелиальных, гладкомышечных клетках, фибробластах и инфильтрирующих стенки сосудов иммунных клетках. Примечательно, что при атеросклерозе обнаружена повышенная экспрессия гена CYBA [5, 21, 22]. Кроме того, отмечена прямая связь между генерируемыми NAD (P)H-оксидазами АФК и уровнем окисленных липопротеинов низкой плотности [23], а также стабильностью атеросклеротических бляшек [24], что подтверждает связь с развитием атеросклероза сосудов.

Таким образом, в рамках настоящего исследования впервые установлено, что полиморфизм 640A>G гена CYBA является фактором риска развития ИИ у русских жителей Центральной России. Однако полученные результаты требуют проведения независимых исследований в других популяциях с целью подтверждения ассоциации. Данный маркер может использоваться в качестве предиктора при прогнозировании риска развития ИИ в семьях с повышенным генетическим риском развития болезни. Результаты проведенного исследования расширяют представления о генетической детерминации нарушений в системе редокс-регуляции, которая играет важную роль в патогенезе цереброваскулярных заболеваний, и могут быть востребованы при разработке и совершенствовании подходов к антиоксидантной терапии сосудистых заболеваний мозга с целью селективного ингибирования NAD (P)H-оксидаз.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15−15−10010).