В развитии рассеянного склероза (РС) большую роль играет наследственная предрасположенность, реализуемая полигенной системой, ответственной за формирование иммунного ответа [2, 6, 10, 29, 36, 38, 43]. Согласно современным генетическим представлениям, подверженность индивидов мультифакториальным заболеваниям определяется сочетанием вариантов генов, отдельные эффекты которых в отношении патологии могут быть невелики. Большое значение имеет определенный набор аллелей генов главного комплекса гистосовместимости, располагающегося на 6-й хромосоме [16, 32, 48]. Наряду с системой HLA генетический контроль иммунного ответа определяют гены цитокинов - растворимых регуляторных факторов [2, 3, 26]. Недавно проведенные масштабные генетические исследования дали статистические и функциональные свидетельства вовлечения также и иных, чем HLA, генов в патогенез заболевания [29]. Участие цитокинов разнонаправленного действия в патогенезе РС многократно показано в экспериментальных исследованиях. При этом обсуждается роль полиморфизма генов цитокинов в развитии различных типов заболевания, скорости прогрессирования, интенсивности воспалительной реакции и других важных клинико-патогенетических характеристик РС [4, 44].

Наиболее распространенным приемом анализа генов-кандидатов является исследование их ассоциаций с клиническими фенотипами заболеваний. В качестве генов подверженности РС преимущественно рассматриваются гены, так или иначе вовлеченные в иммунный ответ, гены миелина, некоторых гормонов, а также ряд генов, определяющих дегенеративные изменения (например, гены, управляющие процессом апоптоза) и ремиелинизацию [1-3, 9, 10].

В ходе исследований идентифицировано несколько регионов, возможно, связанных с восприимчивостью к РС [22-24, 27]. Было обнаружено 17 однонуклеотидных полиморфизмов (англ. single nucleotide polymorphism, SNP) в 13 разных генах, не относящихся к HLA-кластеру, показывающих значительную ассоциацию (от р=10^–3 до р=10^–81) с развитием у пациента РС [29].

SNP - вариация последовательности ДНК, при которой геномы или участки генетического кода двух особей одного вида или двух хромосом одной особи отличаются на один нуклеотид [29].

Недавно было сообщено, что рецептор TNFα (TNFR II) играет существенную роль в развитии и прогрессировании экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), модели РС у животных [25]. Ген TNFα представлен одной копией на 6-й хромосоме человека [39]. В исследованиях in vitro продемонстрировано, что аллель A полиморфного локуса в положении G-308A гена TNFα ассоциирован с более высокой генной транскрипцией TNF [18, 20]. Фактор некроза опухолей-α (ФНО-α) считается классическим провоспалительным цитокином, но недавно было показано, что этот цитокин обладает существенным противовоспалительным и нейропротективным эффектом при демиелинизирующих болезнях [21]. На сегодняшний день накоплен очень большой опыт изучения полиморфизма гена TNFα [1, 5, 12, 13, 15, 28]. Так, еще в Российских исследованиях 1995-1997 гг. было выявлено, что аллели TNFα1 и TNFα9 встречались достоверно чаще в группе больных РС [5, 6, 12]. В другой работе не обнаружено достоверной разницы в распределении аллелей TNFα (–308) у больных и в контрольной группе [1]. В одном из последних исследований [9] показано, что аллель TNFα (–308A) чаще передается больным детям от здоровых гетерозиготных родителей. Таким образом, имеющиеся данные свидетельствуют об участии гена TNFα в развитии предрасположенности к РС у русских.

CD40 - поверхностный рецептор, член семейства рецепторов TNF (TNFRS5), экспрессирующийся на В-лимфоцитах, дендритных клетках, активированных моноцитах, эндотелиальных клетках. Лиганд для CD40, CD40L экспрессируется на активированных T-клетках. CD40L/CD40-сигнальная система играет важную роль в регулировании Т-клеточной активации антиген-презентирующими клетками, развитии Т-зависимых ответов на чужеродные антигены и болезнетворные микроорганизмы. Прайминг Т-клеток и активация В-лимфоцитов может наблюдаться и в отсутствие CD40/CD40L-костимулирующих сигналов, но многие иммунные функции нарушаются без этого взаимодействия, что подчеркивает его важность для адекватного иммунного ответа. Таким образом, рецептор CD40 играет ключевую роль и является одним из компонентов патогенеза многочисленных аутоиммунных заболеваний, включая РС [19, 40]. Функциональная блокада CD40 мышиными антителами эффективно предотвращает клиническую манифестацию модели РС у животных [17, 30].

Цель исследования - изучение роли полиморфизмов системы генов цитокинов в патогенезе РС.

Задачами исследования были изучение полиморфизма генов цитокинов на примере генов TNFα (rs1800629), TNFRSF1A (rs4149584), CD40 (rs6074022 и rs11086998); связи отдельных генотипов со скоростью прогрессирования РС и клиническими характеристиками заболевания; оценка прогностического значения выявленных ассоциаций для больных РС.

В исследование были включены 119 пациентов с достоверным РС по критериям McDonald [41], наблюдавшихся в Новосибирском областном центре РС, русских по национальности (табл. 1).

В выборке преобладали женщины в соотношении 1,83:1 (77 женщин и 42 мужчины). Медиана возраста составила 32 года, средняя длительность заболевания - 8,98±8,7 года. У большинства больных (78%) этой группы был диагностирован ремиттирующий характер течения РС (РРС). Вторично-прогрессирующее течение (ВПРС) наблюдалось у 17% пациентов, а ремиттирующе-прогредиентное (РПРС) - у 2,5%. У 2,5% пациентов, включенных в исследуемую группу, заболевание находилось на стадии клинически изолированного синдрома (КИС).

Для объективизации клинической картины заболевания использовались оценка функциональных систем (FS) по Куртцке и расширенная шкала инвалидизации по Куртцке (EDSS). Средний показатель EDSS у больных РС был 2,5±1,04 балла (min 1, max 6,5), что говорит о преобладании пациентов с легкой и умеренной степенью инвалидизации. Сумма неврологического дефицита по FS как показатель глубины поражения структур нервной системы составила 5,6±3,03 балла (min 1, max 17). Оценивали скорость прогрессирования путем соотношения степени тяжести в баллах шкалы EDSS к длительности заболевания в годах [8, 46]. Средняя скорость прогрессирования составила 0,72±0,62 (min 0,05, max 7) балла в год, при этом у 36 (34%) пациентов скорость прогрессирования была менее 0,25 балла в год, у 46 (43%) больных - от 0,25 до 0,75, и у 25 (23%) - выше 0,75 балла в год. Длительность первой ремиссии в среднем составила 3,8±3,4 (min 0,08, max 24) года.

В контрольную группу были включены 437 здоровых, проживающих в Новосибирске (160 мужчин и 277 женщин), без воспалительных заболеваний ЦНС. Их средний возраст был 33,3±10,8 года. Группа контроля соответствовала по половому и национальному составу группе больных РС.

Молекулярно-генетическое исследование проводилось на базе Института химической биологии и фундаментальной медицины (дир. - акад. РАН В.В. Власов) Сибирского отделения РАН. Исследовано 4 полиморфизма: rs1800629 (TNF-a), rs4149584 (TNFRSF1A), rs6074022 и rs11086998 (CD40). Все изученные варианты содержат однонуклеотидные замены (SNP). Интерес именно к этим генам неслучаен, поскольку во многих исследованиях показана роль кодируемых ими белков в патогенезе РС.

ДНК выделяли из 3-5 мл венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол-хлороформом и осаждение ДНК этанолом [33]. Генотипирование проводилось с использованием технологии TaqMan. Амплификация осуществлялась с помощью амплификатора iCycler iQ5 («Bio-Rad», США).

Статистический анализ полученных результатов проводился на персональном компьютере с использованием статистических программ Statistica for Windows, v.8.0 («StatSoft, Inc.») и языка программирования R (version 2.11.0). Различия в возрасте пациентов анализировали с помощью U-критерия Манна-Уитни. В качестве нулевой гипотезы принималась гипотеза об отсутствии различий в группах. Для выявления ассоциации возраста начала, длительности заболевания, EDSS и средней скорости прогрессирования с генотипом использовали линейный регрессионный анализ (функция glm языка программирования R). Для выявления ассоциации генотипа с развитием заболевания использовали логистический регрессионный анализ (функция glm языка программирования R). Тесты на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия) [31]. Для всех видов статистического анализа различия считались статистически достоверным при достигнутом уровне значимости р<0,05.

Течение РС очень индивидуально - нет двух больных с одинаковыми клиническими проявлениями патологического процесса. В соответствии с международной классификацией выделяют 4 основных типа течения РС [35].

В 85-90% случаев РС на начальных стадиях наблюдается волнообразное (ремиттирующее) течение с чередованием обострений и ремиссий. В большинстве случаев после определенного периода времени, индивидуального для каждого больного, ремиттирующее течение РС переходит во вторично-прогрессирующее [7] с постепенным углублением неврологического дефицита, сокращением периодов клинической стабилизации, инвалидизацией пациентов. Выделяют ВПРС с обострениями (когда на фоне прогрессирующего ухудшения отмечается резкое нарастание симптомов) и без них. Без проведения специфического лечения вторичное прогрессирование развивается через 10 лет у 50% пациентов с РРС [42, 47], а через 25-30 лет - у 90% больных.

У 10-15% больных имеется изначально первично-прогредиентное течение РС, которое характеризуется постепенным, иногда с временной стабилизацией, нарастанием функциональных нарушений без явных обострений. Такое течение болезни наблюдается чаще у мужчин старшего возраста. В клинике превалирует спинальная симптоматика. Прогноз в целом хуже.

Интересным, на наш взгляд, представляется обсуждение таких крайних вариантов РС, как доброкачественный (медленно прогрессирующий) и злокачественный РС (быстропрогрессирующий), так как нет единства определения критериев и терминологии данных понятий. В настоящее время все чаще стали выявляться варианты РС с минимальными неврологическими симптомами при длительности заболевания более 10 лет. Нам ближе всего критерии, которые под доброкачественным («благоприятным») РС определяют такое течение, при котором через 10 лет EDSS не превышает 3 баллов [7, 8, 11, 14].

К злокачественному РС следует относить варианты с быстрым нарастанием инвалидизации и фармакорезистентностью, формы, при которых менее чем за 3-5 лет тяжесть течения заболевания достигает 5-6 баллов по EDSS [8, 14]. Также выделяют следующие прогностические факторы, характеризующие злокачественность течения РС: увеличение балла по шкале EDSS не менее чем на 1 балл в течение 6 мес; стойкость и необратимость неврологической симптоматики и инвалидизации; неэффективность применения глюкокортикостероидов; неэффективность или незначительная эффективность применения иммуномодулирующей терапии. При оценке прогноза заболевания учитываются характер симптомов дебюта заболевания, количество вовлеченных функциональных систем, возраст больного на момент начала болезни, продолжительность и глубина первой ремиссии РС [7, 14, 34, 45].

Клиническими прогностическими критериями благоприятного типа течения РС достоверно являются развитие в дебюте нарушений функций оптического нерва и расстройств чувствительности, длительная первая ремиссия, женский пол [14, 37]. При расстройстве мозжечковых функций и, еще более вероятно, при полисимптомном начале РС с первой ремиссией меньше 1 года высокодостоверно увеличивается риск развития злокачественного варианта заболевания. Начало заболевания в позднем возрасте является неблагоприятным прогностическим критерием вследствие достоверно более быстрого прогрессирования заболевания и перехода к вторично-прогредиентному течению РС [11, 14].

Патогенетические механизмы разных вариантов течения РС не ясны. Существует мнение о возможном различии патогенеза развития воспалительных изменений в ткани мозга при ремиттирующем, первично- и вторично-прогрессирующем течении РС. Уточнение этого вопроса окажет существенное влияние на выбор адекватной терапии для каждой стадии болезни.

В табл. 2 охарактеризован материал настоящего исследования - представлено распределение пациентов с РС и контрольной группы по генотипам.

Методом логистической регрессии оценивали различия в частотах встречаемости генотипов между группой пациентов с РС и контрольной группой. Анализ проводили для четырех моделей наследования признака: аддитивной, доминантной, рецессивной и кодоминантной. Статистически значимых различий в частотах встречаемости генотипов у больных РС и контрольной группы не выявлено (табл. 3).

На следующем этапе работы нами была предпринята попытка исследования влияния генотипа на такие характеристики течения заболевания, как возраст дебюта, длительность первой ремиссии и заболевания, частота обострений, оценка EDSS и средняя скорость прогрессирования РС. Для выбора модели, согласно которой наследуется признак, мы использовали критерий Акаике (Akaike's information criterion, ACI), который является критерием выбора из класса параметризованных регрессионных моделей. Чем ниже значение ACI, тем лучше модель. Проведен линейный регрессионный анализ, результаты которого представлены в табл. 4.

Методом линейного регрессионного анализа достоверно показано влияние полиморфизма гена TNFa (rs1800629) на среднегодовое количество обострений РС (OR 6,07, 95% ДИ 1,19-30,9, p=0,032). Признак наследуется согласно аддитивной модели. Таким образом, у гетерозигот (GA) и гомозигот AA по полиморфизму гена TNFa (G/A) отмечается более высокая клиническая активность заболевания по сравнению с гомозиготами GG.

Выявлена ассоциация полиморфизма rs6074022 гена CD40 (согласно рецессивной модели) и полиморфизма rs11086998 гена CD40 (согласно аддитивной модели) с уровнем инвалидизации по шкале EDSS (OR 1,92, 95% ДИ 1,05-3,52, p=0,036 и OR 3,77, 95% ДИ 1,39-10,24, p=0,010 соответственно). Иными словами, у носителей генотипа CC полиморфизма rs 6074022 (CD40) и генотипа CG полиморфизма rs11086998 (CD40) наблюдается достоверно более высокий уровень инвалидизации по шкале EDSS согласно результатам линейного регрессионного анализа.

При анализе связи полиморфизма генов цитокинов со скоростью прогрессирования выявлена значимая ассоциация только для полиморфизма rs11086998 гена CD40 (доминантная модель наследования). Т.е. у пациентов с генотипом CC и CT полиморфизма rs11086998 гена CD40 отмечается более высокая скорость прогрессирования РС (OR 9,19, 95% ДИ 3,06-27,53, p=0,00013).

Никаких достоверных ассоциаций полиморфизма гена TNFRSF1A c клиническими характеристиками заболевания выявлено не было, возможно, из-за малого размера выборки и отсутствия возможности применить соответствующие статистические методы.

В нашей работе не выявлено влияния генотипов rs1800629, rs4149584, rs6074022 и rs11086998 на риск развития РС. Мы предположили, что изучаемые полиморфные локусы могут быть связаны с клиническими характеристиками заболевания. После проведенного статистического анализа выявлены значимые ассоциации по 3 полиморфизмам. Отмечается связь генотипов GA и AA полиморфизма гена TNFa с более высокой среднегодовой частотой обострений РС. Генотипы CC полиморфизма rs6074022 (CD40) и CG полиморфизма rs11086998 (CD40) ассоциируются с более высоким уровнем инвалидизации. А генотип CC полиморфизма rs11086998 гена CD40 сопряжен с более высокой скоростью прогрессирования РС. С возрастом манифестации и длительностью заболевания до вступления пациента в исследование значимых ассоциаций не выявлено.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что имеется достоверное влияние генотипа на уровень инвалидизации и скорость прогрессирования РС. Подтверждена связь клинической активности заболевания, определяемой как среднегодовая частота обострений, с наследственным фактором на примере полиморфизма генов цитокинов, которые вовлечены в иммунный ответ. Выявленные полиморфные варианты изученных генов ассоциированы с неблагоприятными факторами прогноза. Эти вариации в генах могут рассматриваться как потенциальные предикторы более высокой среднегодовой частоты обострений, уровня инвалидизации и скорости прогрессирования РС и позволят индивидуализировать лечение на ранних стадиях заболевания.

Работа поддержана интеграционным проектом №17 «Геномные основы подверженности частым заболеваниям человека и проблема генетического тестирования».