Введение

В настоящее время благодаря достижениям медицинской науки выделена целая группа новых заболеваний — т.н. болезни клеточных органелл.

Благодаря изучению структуры и функций субклеточных образований при различной патологии человека исследователи выделили митохондриальные болезни, лизосомные болезни, пероксисомные болезни. Однако если изучение первых двух классов заболеваний существенно прогрессирует, то исследованию пероксисомных болезней уделяется недостаточное внимание [1].

Пероксисомы играют ключевую роль в катаболизме полиаминов, в процессах пероксисомного дыхания, в α-, β-окислении очень длинноцепочечных жирных кислот (ОДЦЖК) (24—26 углеродных атомов и более) и дикарбоновых жирных кислот (С26 и более). Важная роль принадлежит пероксисомам в процессах синтеза некоторых жизненно необходимых для организма соединений, например плазмалогенов [2]. В связи с многообразием функций пероксисом становится очевидным, что нарушение одной или нескольких метаболических функций может стать причиной возникновения пероксисомных болезней [2, 3]. Данные патогенетические механизмы обычно приводят к накоплению в тканях и биологических жидкостях одного, нескольких или всех соответствующих метаболитов в зависимости от количества функциональных нарушений [2, 4].

Пероксисомы широко представлены в клетках всех тканей человека, за исключением эритроцитов. Пероксисомы играют важную роль в защите клеток от образующегося в их матриксе атомарного кислорода (результат разложения перекиси водорода) [5, 6].

Последние исследования показали, что пероксисомы, образующиеся из специального субдомена эндоплазматического ретикулума и поэтому не имеющие собственной ДНК, являются полуавтономными органеллами, которые способны расти и делиться на дочерние пероксисомы. В настоящее время установлено, что пероксисомы катализируют ряд важных метаболических функций, которые не могут быть осуществлены другими органеллами [2].

На данный момент в классификацию пероксисомных болезней положены два критерия — морфологический (отсутствие или наличие пероксисом в печени) и биохимический (нарушение одной или нескольких функций пероксисом), которые необходимо оценивать в каждом случае одновременно [2]. Это позволяет выделить три группы пероксисомных болезней:

1-я группа — нозологические формы, этиопатогенез которых связан с генерализованным нарушением биологических функций пероксисом и отсутствием или значительным уменьшением количества пероксисом в печени. К данному типу относятся синдром Цельвегера, инфантильная форма болезни Рефсума, неонатальная адренолейкодистрофия, точечная остеохондродисплазия, ряд форм амавроза Лебера, гиперпипеколовая ацидемия, ризомелическая точечная хондродисплазия I типа и др.

2-я группа — нозологические формы, этиопатогенез которых обусловлен нарушением нескольких биологических функций пероксисом при нормальном количестве пероксисом в печени. Это такие нозологии, как цельвегероподобный синдром, синдром недостаточности бифункционального белка [7], синдром псевдоцельвегера и др. [2, 7].

3-я группа — включает болезни, при которых нарушена одна биологическая функция пероксисом и имеется нормальное содержание пероксисом в печени. Эта группа также подразделяются на различные подгруппы, в том числе нарушения пероксисомного бета-окисления — X-сцепленная адренолейкодистрофия, недостаточности ацил-КоА-оксидазы 1 [8], недостаточности 2-метил-ацил-КоА-редуктазы [9], недостаточности белка, транспортирующего стирол [10], нарушения биосинтеза эфиросодержащих липидов (недостаточности дигидроксиацетонфосфат-ацилтрансферазы и алкилдигидроксиацетонфосфат-синтазы) [11], нарушения альфа-окисления фитановой кислоты (болезнь Рефсума, взрослый тип) [12], а также в качестве единственной нозологической формы — нарушение детоксикации глиоксилата с гипероксалурией I типа, вызванное недостатком аланинглиоксилатаминотрансферазы [2].

Молекулярно-генетическая диагностика пероксисомных болезней у детей

Так как пероксисомные болезни являются моногенными заболеваниями, для подтверждения диагноза конкретного пероксисомного заболевания наряду с хроматографическим анализом рекомендуется проводить молекулярно-генетическое исследование [13, 14]. Сложность такого исследования заключается в том, что для наиболее распространенных пероксисомных болезней у детей не описаны мажорные мутации в генах, ответственных за данную патологию. Поэтому для молекулярно-генетической диагностики пероксисомных болезней у детей рекомендуется таргетное или полноэкзомное секвенирование методом NGS [15].

Цель исследования — изучить роль метода газовой хроматографии с масс-спектрометрией (ГХ-МС) и методов молекулярной генетики в диагностике пероксисомных заболеваний у детей.

Материал и методы

В исследование включены 35 пациентов детского возраста с подозрением на пероксисомное заболевание и 369 детей группы контроля. Исследование проводилось на базе Научно-исследовательского клинического института педиатрии и детской хирургии им. акад. Ю.Е. Вельтищева ФГАОУ ВО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России. Выполнение исследования одобрено этическим комитетом РНИМУ (протокол №94 от 14.12.2019). Предварительно от родителей всех детей было получено письменное согласие на проведение исследования. Стационарное наблюдение за пациентами проводилось врачами-генетиками. Основная группа включала больных с подозрением на пероксисомные патологии, а также с диагностически недифференцированными патологиями обмена. Возраст пациентов, вошедших в группу, составил от 1 мес до 17лет. По полу группа пациентов распределялась следующим образом: 19 мальчиков и 16 девочек.

Критерии включения: дети с момента рождения и до 17 лет, в анамнезе которых присутствует следующая симптоматика: резкие и характерные дефекты миграции нейронов, микроузелковый цирроз печени, кисты почек, точечные хондродисплазии, помутнение роговицы, катаракта, глаукома и ретинопатия, врожденные пороки сердца и дизморфические проявления.

Критерии исключения: несоответствие критериям включения (возраст старше 17 лет, наличие сопутствующих заболеваний с тяжелым течением, которое могло осложнить выполнение условий обследования или могло навредить пациенту). Группой сравнения для этой группы больных были 35 детей с подозрением на болезни обмена пуриновых и пиримидиновых оснований. Контрольная группа состояла из 369 практически здоровых детей разных возрастных групп.

Методика количественного определения длинноцепочечных жирных кислот в плазме крови — методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией. Данная методика предусматривает количественное определение пяти длинноцепочечных жирных кислот в плазме крови. В настоящем исследовании для улучшения разделения аналитов в масс-спектрометрии были изменены органические растворители в процедуре пробоподготовки биоматериала и некоторые параметры настройки газового хроматографа.

Реактивы: изопропанол (ч.д.а., «Химмед», Россия), дихлорметан (ч.д.а., «Химмед», Россия), метанол (LC/MS Grade) (Fisher Scientific, США), соляная кислота (х.ч., «Химмед», Россия), гексан (ч.д.а., «Химмед», Россия), пиридин (ч.д.а., Sigma-Aldrich, Германия), N-метил-бис-трифторацетамид (MBTFA) (Macherey-Nagel, Германия).

Стандартные образцы были приобретены в следующих компаниях:

— Sigma-Aldrich (Германия): пристановая кислота (98,0%), фитановая кислота (96,0%), бегеновая кислота (99,0%), лигноцериновая кислота (99,0%) (лот №5298, с.г. до 01.01.2023);

— Acros Organics: гексакозановая кислота (98,0%) (лот №9632, с.г. до 01.12.2022).

Забор биоматериала. В вакуумную пробирку (консерванты: K2-ЭДТА, K3-ЭДТА) отбиралась проба крови, которая сразу после отбора центрифугировалась при 3000 об/мин в течение 10 мин.

Пробоподготовка биоматериала. В пробирку к 200,0 мкл плазмы добавлялся изопропанол и дихлорметан в объемном соотношении 1:30:14,4, полученная смесь перемешивалась на шейкере при 350 об/мин в течение 10 мин. Затем фаза органических растворителей переносилась в чистую пробирку и упаривалась в токе гелия досуха. Далее в эту пробирку добавлялось 1,2 мл метанола и 200,0 мкл соляной кислоты (5N), после чего пробирка инкубировалась при температуре 80°C в течение 40 мин, затем охлаждалась до комнатной температуры. Для экстракции в пробирку добавлялось 5000,0 мкл гексана, после чего смесь встряхивалась на шейкере при 350 об/мин в течение 10 мин. Затем пробирка центрифугировалась при 3000 об/мин в течение 5 мин, после чего отбиралась верхняя фаза в виалу. После этого экстракт упаривался в токе гелия досуха. Затем к сухому остатку добавлялось 25 мкл пиридина и 50,0 мкл MBTFA, после чего виала закрывалась крышкой и инкубировалась при температуре 80°C в течение 30 мин. На последнем этапе к пробе добавлялось 150,0 мкл гексана, после чего она перемешивалась на шейкере. Объем инжекции составлял 2,0 мкл.

Хроматографические условия. Анализ проводился с использованием газового хроматографа с масс-спектрометром Agilent 7820/5977 (Agilent Technologies, Германия) и капиллярной колонки HP-5MS (30 м × 0,32 мм × 2,5 мкм) (Agilent Technologies, США). Параметры настройки газового хроматографа для определения жирных кислот представлены в табл. 1.

Таблица 1. Параметры системы для количественного определения длинноцепочечных жирных кислот в плазме крови методом ГХ-МС с капиллярной колонкой HP-5MS (30 м × 0,32 мм × 2,5 мкм)

Валидационные характеристики методики. Степень извлечения жирных кислот из плазмы крови составила 65—92% в зависимости от аналита; предел обнаружения каждого аналита составил 0,005 мкмоль/л, коэффициент вариации был в диапазоне от 2,4% до 10,1%; диапазон линейности для всех соединений находился в пределах концентраций 0,01—20 мкмоль/л.

Обработка данных проводилась с помощью программного обеспечения ChemStation (Agilent Technologies, США).

Количественное определение аналитов проводилось по методу внешнего стандарта по соответствующим калибровочным кривым, построенных с помощью метода наименьших квадратов. Концентрация аналита в образце вычислялась по формуле (1) как отношение интенсивности аналитического сигнала аналита в образце к угловому коэффициенту соответствующей калибровочной кривой:

(1)

где cA,mkmol/l — концентрация аналита в образце (мкмоль/л); А_А — интенсивность аналитического сигнала аналита в образце (абсолютные единицы); b — угловой коэффициент соответствующей калибровочной кривой (интенсивность аналитического сигнала в абсолютных единицах × л/мкмоль);

Для оценки различий между возрастными группами использовался непараметрический метод сравнения множества независимых групп — метод Краскела—Уоллиса, являющийся непараметрической альтернативой одномерному (межгрупповому) дисперсионному анализу. Он используется для сравнения трех или более выборок, так как проверяет нулевые гипотезы, согласно которым различные выборки были взяты из одного и того же распределения или из распределений с одинаковыми медианами. Сравнение средних значений проводилось по критерию Манна—Уитни.

Для доказательства диагностической значимости использовался метод построения ROC-кривых. Также использовались иерархический кластерный анализ и тепловые карты на основе корреляции по Спирмену.

Корреляционный анализ проводился с помощью языка программирования R. Также осуществлялось сравнение значений медиан с интерквартильными диапазонами. Расчеты проводились с помощью статистической программы Morpheus и пакета прикладных статистических программ для персонального компьютера Statistica 6.0.

Молекулярно-генетический анализ

Для подтверждения одного из вариантов пероксисомных болезней у детей — синдрома Цельвегера нами было проведено таргетное секвенирование генов PEX2, PEX10, PEX12, PEX16 и PEX11B методом NGS у 5 пациентов детского возраста с симптоматикой данного синдрома, у которых методами хроматографии не было выявлено повышение уровня ОДЦЖК. Из литературы известно, что именно при мутациях в данных генах у пациентов с синдромом Цельвегера повышение уровня ОДЦЖК может быть крайне мягким или отсутствовать [14]. NGS проводилось на приборе Ion Torrent PGM System for Next-Generation Sequencing (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific). Подготовка образцов ДНК проводилась набором реагентов Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 согласно протоколу производителя.

Результаты

Определение референтных интервалов концентраций длинноцепочечных жирных кислот в плазме крови детей разных возрастных групп

На основании результатов ретроспективного анализа образцов плазмы крови 369 детей контрольной группы были определены референтные интервалы (РИ) для пяти длинноцепочечных жирных кислот (ДЦЖК) и их двух диагностически значимых соотношений, детектируемых методом ГХ-МС (табл. 2).

Таблица 2. Референтные интервалы концентраций длинноцепочечных жирных кислот и их диагностически значимых соотношений в образцах плазмы крови обследованных разных возрастных групп (значения концентраций аналитов представлены в мкмоль/л, в скобках указаны медианы)

Примечание. * — различия считались статистически значимыми при уровне p<0,0170.

Границы РИ были вычислены как пределы, соответствующие 2,5—97,5% разбросу каждого показателя в выборке результатов контрольной группы, в которой дети были распределены по четырем возрастным группам: первая неделя жизни, от 8 дней до 1 мес, 1—23 мес, 2—17 лет. В связи с большей диагностической значимостью верхней границы РИ тренд изменения концентрации каждого показателя в зависимости от возрастной группы обследованных оценивался именно по ее величине.

По результатам анализа образцов плазмы крови 35 детей с подозрением на пероксисомные болезни на основании характерных клинико-лабораторных данных выявлены 17 пациентов с данной патологией (табл. 3). Результаты анализа образцов плазмы крови пациентов из выборки с выявленными заболеваниями и соответствующей группы сравнения приведены в табл. 4

Таблица 3. Заболевания, выявленные в группе пациентов детского возраста с подозрением на пероксисомные болезни по результатам исследования образцов плазмы крови методом ГХ-МС

Таблица 4. Результаты анализа на содержание длинноцепочечных жирных кислот в образцах плазмы крови пациентов детского возраста с подозрениями на пероксисомные болезни методом ГХ-МС

Примечание: ¹СТБ — белок, транспортирующий стирол; ²РТХД — ризомелическая точечная хондродисплазия.

У трех пациентов был выявлен синдром Цельвегера, концентрация гексакозаноевой кислоты (C26:0) у этих пациентов составляла 3,58 мкмоль/л, 9,22 мкмоль/л и 12,8 мкмоль/л, что превышает верхнюю границу РИ в 3—10 раз. Только у одного пациента концентрации бегеновой (С22:0) и лигноцериновой (С24:0) кислот превышали верхнюю границу РИ. У всех трех пациентов показатель соотношения С24:0/С22:0 был в пределах РИ, а показатель соотношения С26:0/С22:0 значительно превышал верхнюю границу РИ. Также у всех пациентов наблюдалось увеличение верхней границы РИ концентраций пристановой и фитановой кислот в 2—5 раз.

В трех случаях был подтвержден диагноз Х-сцепленной адренолейкодистрофии. Только у одного из трех пациентов были превышены уровни кислот С24:0 и С22:0. Необходимо отметить, что для кислоты С24:0 наблюдается значительное перекрывание между уровнями ее содержания у обследованных контрольной группы и у пациентов с выявленным заболеванием. У всех пациентов показатель соотношения С24:0/С22:0 был в пределах РИ, тогда как показатель соотношения С26:0/С22:0 превышал верхнюю границу РИ. У всех пациентов концентрации С26:0, фитановой и пристановой кислот входили в РИ.

У двух пациентов был подтвержден диагноз недостаточности белка, транспортирующего стирол, концентрации фитановой и пристановой кислот были 18,7 мкмоль/л, 29,8 мкмоль/л и 15,3 мкмоль/л, 22,8 мкмоль/л соответственно. Уровни других ДЦЖК и их соотношений находились в пределах, соответствующих РИ.

У пяти пациентов был подтвержден диагноз болезни Рефсума в инфантильной форме. Концентрация диагностического маркера фитановой кислоты находилась в диапазоне 525—1458 мкмоль/л, что значительно превышает верхнюю границу РИ.

У двух детей — в возрасте 3 года и 4,5 года была выявлена болезнь Рефсума во взрослой форме, концентрация фитановой кислоты была 622 мкмоль/л и 128 мкмоль/л соответственно, что выше возрастной нормы, но не так значительно, как у пациентов с инфантильной формой данного заболевания.

В двух случаях был подтвержден диагноз ризомелической точечной хондродисплазии I типа. При этом у пациентов наблюдалось незначительное повышение уровня фитановой кислоты (911 мкмоль/л и 412 мкмоль/л) и понижение уровня пристановой кислоты (0,2 мкмоль/л и 0,8 мкмоль/л).

У 2 пациентов с симптоматикой синдрома Цельвегера без повышения уровня ОДЦЖК выявлена описанная ранее миссенс-мутация W223X в гене PEX2 [16], у 3 пациентов мутаций в генах PEX2, PEX10, PEX12, PEX16 и PEX11B не обнаружены. Таким образом, для молекулярно-генетической диагностики пероксисомных болезней у детей больше подходит полноэкзомное секвенирование методом NGS, так как в случае использования узких таргетных панелей возможно не выявить патологическую мутацию из-за генетической гетерогенности данной группы заболеваний.

Выводы

Таким образом, наше исследование показывает важность хроматографической и молекулярно генетической диагностики пероксисомных болезней у детей. В качестве наиболее информативного хроматографического метода рекомендуется использовать ГХ-МС-анализ длинноцепочечных жирных кислот. Для молекулярно-генетического же анализа вследствие генетической гетерогенности данной группы болезней наиболее информативно проводить полноэкзомное секвенирование методом NGS, что позволит более точно поставить нозологический диагноз.

Следует также отметить, что небольшое число пациентов с пероксисомной дисфункцией не могут быть диагностированы с использованием только анализа плазмы. Авторами некоторых статей были описаны случаи нарушения биогенеза пероксисом, дефицита D-бифункциональных белков и ацил-СоА-оксидазы у пациентов, анализ плазмы которых не выявил отклонений уровня ДЦЖК, фитановой, пристановой или желчных кислот. Очевидно, подозрение на пероксисомные нарушения всегда следует подтверждать исследованием фибробластов, вне зависимости от результатов анализа плазмы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.