Влияние нитратов на исход острого экспериментального ишемического инсульта

В современном мире ишемический инсульт (ИИ) является ведущей причиной смертности и инвалидизации, ассоциированной с огромными материальными затратами [1-3]. Многие механизмы патогенеза ИИ остаются недостаточно изученными. Это касается, в частности, роли нитратов (NO₃-) и нитритов (NO₂), в ишемическом/гипоксическом повреждении мозга. Эти анионы являются химически инертными продуктами метаболизма оксида азота (NO). В настоящее время нитраты и нитриты рассматриваются не только как главная форма хранения NO в тканях [4-6], но также и в качестве активных участников ряда посттрансляционных цитопротекторных механизмов [7]. Имеются данные о том, что нитраты и нитриты могут оказывать свои протекторные свойства через NO-независимый механизм вследствие их прямого действия на ключевые белки и липиды, а также за счет образования оксида азота и азотистой кислоты [8, 9].

При ИИ нитраты и нитриты могут быть быстро восстановлены до NO [10-12]. Во время умеренной гипоксии и ишемии этот процесс также происходит, но при патологических условиях восстановление NO₃- и NO₂- до NO происходит интенсивнее [13]. Известно, что NO-синтаза (NOS) является важнейшим ферментом образования NO, который участвует как в физиологических, так и патофизиологических реакциях [14-16]. Ферментативная активность NOS требует присутствия кислорода, которого не хватает во время ишемии/гипоксии. В связи с этим в условиях ишемии/гипоксии мозга активизируются альтернативные источники образования NO [17, 18]. Возможно, это представляет собой достаточно древний механизм защиты организма от ишемии/гипоксии, который впоследствии утратил свою ведущую роль.

К альтернативным источникам образования NO относятся субстраты металлсодержащих ферментов (нитраты, нитриты и S-нитрозопротеины), такие как ксантиноксидоредуктаза и цитохромы [19-22]. Более того, в условиях ишемии/гипоксии многие ферменты изменяют направленность своего действия. Например, дезоксигемоглобин и дезоксимиоглобин в этих условиях выступают в роли нитритредуктаз [23-25]. Активация различных нитратредуктаз зависит не только от напряжения кислорода, рН и доступности субстрата этих ферментов, но также и от типа катионов, входящих в состав нитратов. Падение нитратредуцирующей активности отмечено в ряду катионов: К⁺, Na⁺, Mg²⁺, Са²⁺, Ва²⁺ [26].

Установлено, что чем раньше применялись нитраты, тем эффективнее они влияли на исход ИИ [27, 28]. При ИИ происходит значительная потеря организмом таких катионов, как Mg²⁺ и К⁺. Их раннее восполнение методами терапевтического воздействия ведет к уменьшению ишемического повреждения мозга [29-31]. В исследованиях, выполненных на модели геморрагического инсульта [32] и ИИ [33], авторами настоящей публикации было обнаружено защитное действие нитратов, введенных за 60 мин до начала эксперимента.

Цель настоящей работы - изучение влияния нитратов (NaNO₃, KNO₃ и Mg(NO₃)₂), введенных в дозе 5 и 50 мг/кг внутрибрюшинно через 1-2 c после окклюзии общих сонных артерий, на течение экспериментального ИИ.

В опытах использовали самцов крыс линии Вистар массой 120-150 г.

Для создания модели глобальной ишемии головного мозга применяли одномоментную двустороннюю перевязку общих сонных артерий [34]. Крысам под эфирным наркозом выделяли и перевязывали общие сонные артерии. Длительность операции составляла не более 10 мин. После эфирного наркоза у крыс быстро восстанавливалось сознание. Животных помещали в отдельные клетки и полуколичественно оценивали динамику неврологического дефицита [35]. Оценивали ограничение подвижности животного, птоз, гиперактивное поведение, насильственные движения (вращения, прыжки, судорожные и вращательные припадки), парезы конечностей, кому и смерть. В соответствии с использованной методикой оценки неврологической симптоматики, за 0-3 балла принимали состояние, близкое к нормальному; за 3-6 баллов - среднюю степень; за 7-24 балла - тяжелую степень ИИ; за 25 баллов - смерть животного. Неврологический дефицит оценивали через каждые 30 мин в течение 8 ч. Суммарный балл по каждому промежутку времени усредняли для всех животных в группе. На основе полученных данных строили графики динамики неврологических нарушений, отложив по оси ординат баллы, а по оси абсцисс - время.

В предварительной серии опытов изучали влияние нитратов - нитрата натрия (NaNO₃), нитрата калия (KNO3) и нитрата магния (Mg(NO₃)₂), введенных внутрибрюшинно в дозах 5, 50 и 500 мг/кг, а динамику неврологического дефицита и смертность интактных животных (без билатеральной окклюзии сонных артерий). Результаты экспериментов показали, что введение NaNO₃, KNO₃ и Mg(NO₃)₂ в дозах 5 и 50 мг/кг не оказывало влияния на неврологические нарушения и смертность животных. Введение NaNO₃ и Mg(NO₃)₂ в дозе 500 мг/кг также не вызвало неврологических нарушений. А внутрибрюшинное введение 500 мг/кг KNO₃ без окклюзии двух сонных артерий вызывало не только неврологические нарушения, но и смерть большинства животных. Исходя из результатов предварительных экспериментов, для исследования влияния нитратов на исход ИИ были использованы дозы 5 и 50 мг/кг.

Было проведено три серии экспериментов. Опытную и контрольную группы животных в каждой серии составили крысы с ишемией мозга. В первой серии животным через 1-2 с после окклюзии обеих сонных артерий вводили NaNO₃ в дозах 5 мг/кг (n=30) и 50 мг/кг (n=30). Контрольную группу (n=30) составили крысы, которым внутрибрюшинно в те же сроки в эквивалентном объеме вводили физиологический раствор (0,9% NaCl).

Во второй серии животным через 1-2 c после окклюзии обеих сонных артерий вводили KNO₃ в дозах 5 мг/кг (n=30) и 50 мг/кг (n=30). Контрольную группу (n=30) составили крысы, которым в те же сроки внутрибрюшинно вводили физиологический раствор (0,9% NaCl) в эквивалентном объеме.

В третьей серии подопытным животным через 1-2 с после окклюзии обеих сонных артерий вводили Mg(NO₃)₂ в дозах 5 мг/кг (n=30) и 50 мг/кг (n=30). Контрольную группу (n=30) составили крысы, которым в те же сроки внутрибрюшинно вводили в эквивалентном объеме физиологический раствор (0,9% NaCl).

Достоверность различий средних параметров в разных экспериментальных группах животных оценивали с помощью критерия Манна-Уитни (U-тест) в программе Statistika 6. Для оценки летальности неврологических проявлений применяли критерий Фишера.

При оценке динамики неврологических нарушений и смертности в первой серии опытов (5 мг/кг) статистически достоверных различий между опытной и контрольной группами животных (кривые 1 и 2) выявлено не было (рис. 1).

Введение KNO₃ в дозе 5 мг/кг оказывало значительное защитное действие. На протяжении 360-480-й минуты опыта интенсивность нарастания неврологических нарушений оказалась значительно ниже, чем в контрольной группе (р<0,01; рис. 2).

Введение Mg(NO₃)₂ в дозе 5 мг/кг оказывало статистически достоверный эффект на динамику неврологических нарушений и смертность (рис. 3).

На различных моделях ишемического/гипоксического повреждения мозга было показано цитопротективное действие нитратов [4-6]. Предполагается, что положительное влияние на сосудистую и нервную системы нитраты и нитриты осуществляют через образование NO [14-16]. Также имеются данные о том, что нитраты и нитриты реализуют свое цитопротективное действие NO-независимым способом, непосредственно воздействуя на ключевые протеины и липиды. Таким образом, механизм, посредством которого нитраты и нитриты оказывают защитный эффект в условиях ишемического/гипоксического повреждения, требует уточнения. Вместе с тем эффективный синтез NO может быть особенно важным в защите мозга при ишемии/гипоксии. Установлено, что нитраты и нитриты являются донорами NO, что особенно выражено в условиях ацидоза и гипоксии [13, 36-38].

Авторами настоящей публикации было показано, что введение нитратов способно оказывать значительное протективное действие в условиях неполной глобальной ишемии мозга. В то же время протекторный или повреждающий эффекты нитратов зависели не только от их дозы и типа катиона, входящего в их состав, но и от сроков их введения.

В наших предыдущих экспериментах было показано, что нитраты, введенные за 60 мин до окклюзии сонных артерий, оказывали меньший защитный эффект, чем при введении через 1-2 с после развития ишемии.

При введении 5 мг/кг NaNO₃ наблюдалась тенденция к уменьшению выраженности неврологического дефицита. Отсутствие выраженного защитного эффекта можно объяснить тем, что NaNO₃ применялся в дозе, недостаточной для оказания протективного эффекта. Применение NaNO₃ в дозе 50 мг/кг сопровождалось достоверным защитным эффектом, что может быть связано с трансформацией нитратов в нитриты, которые в свою очередь образуют NO. Известно, что при гипоксии/ишемии мозга увеличивается ферментативная активность нитрат/нитрит-редуктаз, которые осуществляют последовательную цепь трансформации NO₃^– ⇒ NO₂^– ⇒ NO [10-12]. Будучи мощным вазодилататором, NO способен увеличивать кровоток в мозге, а также ингибировать агрегацию тромбоцитов [14-16]. В связи с этим NO может уменьшать повреждающее действие гипоксии/ишемии мозга при окклюзии сонных артерий. Защитный эффект проявляется уменьшением выраженности неврологического дефицита и снижением летальности. Кроме того, умеренное увеличение концентрации NО и его производных усиливает переход белков из растворимого в мембранно-связанное состояние [10], что способно повысить стабильность белков и мембран. Ферменты, вовлеченные в гликолиз и синтез АТФ, также могут быть активизированы, что может уменьшить повреждающее действие ишемии/гипоксии мозга [10].

Способностью увеличивать продукцию NO можно объяснить протекторное действие KNO₃, вводимого в дозе 5 мг/кг. Поскольку нитрат-редуцирующая активность К⁺ выше, чем у Na⁺, то KNO₃ (5 мг/кг), введенный в дозе на порядок меньше, чем NaNO₃, оказывал такой же защитный эффект, как NaNO₃, введенный в дозе 50 мг/кг. Помимо протективного действия NO в отношении мозга в условиях ишемии, уменьшению неврологического дефицита могут способствовать сами ионы К⁺ [39, 40]. Очевидно, этим объясняется уменьшение выраженности неврологических нарушений при введении KNO₃ в дозе 5 мг/кг.

Поскольку нитрат/нитрит-редуцирующая активность ионов Mg²⁺ ниже, чем у ионов К⁺ и Na⁺, то протективный эффект Mg(NO₃)₂ в дозе 5 мг/кг при ишемии/гипоксии головного мозга, по всей видимости, связан не только с образованием NO, но и с действием катионов Mg²⁺. Известно, что ионы Mg²⁺ приводят к увеличению производства простагландина I₂, который в свою очередь уменьшает агрегацию тромбоцитов. Mg также блокирует кальциевые каналы, снижает поступление ионов Са²⁺ в клетки, способен блокировать NMDA-рецепторы, уменьшая эксайтотоксичность [29-31, 41].

Известно, что избыточное содержание NO усиливает повреждение тканей при ИИ [14-16]. Поэтому усиление повреждающего действия KNO₃, введенного в дозе 50 мг/кг в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вероятно, связано с высокой нитрат/нитрит-редуцирующей активностью К⁺, ведущей к гиперпродукции оксида азота. Несмотря на то что ионы Mg²⁺ обладают гипотензивным эффектом [29-31, 40], выраженного нарастания ишемически-гипоксических повреждений, связанных с внутрибрюшинным введением Mg(NO₃)2 в дозе 50 мг/кг, у крыс с окклюзией сонных артерий не наблюдалось. Очевидно, что кроме вышеперечисленных положительных эффектов Mg²⁺ на нервную и сосудистую системы, именно раннее введение Mg(NO₃)₂ ограничивает сочетанное негативное действие окклюзии сонных артерий и гипотензивного эффекта Mg²⁺.

Таким образом, полученные данные показывают, что нитраты (NaNO₃, KNO₃ и Mg(NO₃)₂), вводимые крысам с неполной глобальной ишемией мозга в дозах 5 и 50 мг/кг, оказывают как протекторный, так и повреждающий эффекты. Направленность этих эффектов зависит от концентрации нитратов, типа катиона, времени их введения. Полученные данные уточняют понимание нейропротективного действия нитратов и предлагают новые стратегии для эффективного применения этих NO-доноров для лечения ИИ.