Содержание серотонина в тромбоцитах является показателем активности серотонинергической системы, и его изменения обнаружены при различных патологических состояниях. В ряде исследований показано, что содержание серотонина в плазме определяется генетическими факторами, в частности зависит от варианта гена переносчика серотонина (полиморфизм 5-HTTLPR), который кодирует белок, осуществляющий обратный захват этого нейротрансмиттера и перенос его в пресинаптический нейрон. Ассоциация между уровнем серотонина в плазме и полиморфизмом 5-HTTLPR переносчика серотонина была обнаружена в нескольких исследованиях, в частности у родителей детей, больных аутизмом, у больных обсессивно-компульсивными расстройствами и мигренью [1-3].

Полиморфный участок 5-HTTLPR расположен в области гена, примыкающей к промотору. Он содержит разное число тринуклеотидных повторов длиной 22 пар оснований (п.о.). Наиболее часто в популяции встречаются 2 варианта, или аллеля, один из которых состоит из 16 повторов, его называют длинным (L) аллелем, а второй - из 14 повторов (короткий (S) аллель). Оказалось, что эти варианты оказывают влияние на функциональную активность гена. Так, при изучении экспрессии гена в культурах лимфобластов было показано, что клетки, содержащие 2 копии аллеля L, продуцировали м-РНК в бóльших концентрациях, чем клетки, содержащие генотипы с аллелем S [4].

Известно, что серотонин оказывает сосудистые эффекты и его содержание может изменяться у больных с ишемическим инсультом. Однако данные о направленности этих изменений весьма противоречивы. По данным одной из ранних публикаций [5], уровень серотонина в плазме снижался в остром периоде инсульта. В то же время в других исследованиях показано, что уровень серотонина в плазме у больных после инсульта был выше, чем у здоровых людей [6]. P. Blardi и соавт. [7] не обнаружили различий в содержании серотонина ни в плазме, ни в тромбоцитах больных по сравнению с контролем. В исследовании, проведенном нами ранее [8], содержание серотонина в тромбоцитах больных не отличалась от здоровых людей в 1-е сутки после инсульта. Однако была выявлена достоверная взаимосвязь между тяжестью состояния больных и содержанием тромбоцитарного серотонина (ТС) в этот период. У больных с низким содержанием ТС отмечалось более тяжелое состояние, чем у больных с достоверно повышенными относительно нормы значениями. Также было установлено, что содержание ТС в остром периоде инсульта и его последующая динамика связаны с развитием у больных аффективных и тревожных расстройств.

В настоящей работе мы продолжили исследования для того, чтобы выявить другие факторы, влияющие на содержание ТС у больных с инсультом. В частности, мы попытались найти ассоциацию между содержанием серотонина в остром периоде заболевания и полиморфизмом 2 генов - переносчика серотонина и мозгового нейротрофического фактора (BDNF, от англ. brain-derived neurotrophic factor). Поскольку ранее было показано, что содержание серотонина в остром периоде инсульта коррелирует с развитием аффективного расстройства, мы предположили, что генетический фактор может оказывать модулирующее влияние на связь между ТС и развитием аффективного или тревожного расстройства. При выборе генов мы руководствовались литературными данными, в которых описан эффект взаимодействия между BDNF и серотонином [9]. Известно, что BDNF оказывает влияние на состояние серотонинергической системы, способствуя выживанию и дифференциации серотонинергических нейронов, а активность передачи серотонина в свою очередь контролирует экспрессию BDNF. Молекулярно-генетические исследования выявили совместный эффект полиморфизмов Val66Met BDNF и 5-HTTLPR на развитие аффективных расстройств [9]. В одной из недавних работ была предпринята попытка исследовать связь между уровнем BDNF в плазме и содержанием серотонина в тромбоцитах больных с расстройствами пищевого поведения, однако результаты оказались отрицательными [10]. Изучения влияния генетических вариантов на содержание ТС у больных с инсультом до сих пор не проводилось.

Работа была проведена на базе нейрореанимационного и неврологического отделений Московской городской клинической больницы №31. В исследование включены 47 человек, 21 женщина и 26 мужчин в возрасте от 37 до 88 лет (средний возраст 66,2±11,8 года), с впервые возникшим церебральным ишемическим инсультом, поступивших в стационар в 1-е сутки развития заболевания. В исследование не включались больные с сопутствующими соматическими заболеваниями в стадии декомпенсации, онкологическими заболеваниями, алкоголизмом.

Психиатрическое обследование, направленное на выявление депрессивных и тревожных расстройств, было проведено у 44 человек. Диагнозы были поставлены на основании диагностических критериев DSM-IV. В остром периоде, т.е. на момент измерения уровня серотонина, у 24 больных был поставлен диагноз «депрессивный эпизод», а у 23 - «генерализованное тревожное расстройство» (ГТР), причем 21 пациент имел оба диагноза.

Все участники исследования дали информированное согласие на участие в нем.

Кровь брали из локтевой вены утром натощак, образцы центрифугировали, отделяли плазму, из которой затем с помощью гель-фильтрации на сефарозе CL-2B получали суспензию очищенных от белковых и других элементов плазмы тромбоцитов. К осадку белых клеток, полученному после центрифугирования образца крови, добавляли буфер, содержащий сахарозу, и лизировали клетки для последующего выделения ДНК. Очистку ДНК проводили с использованием фенол-хлороформного метода.

Определение генотипов 5-HTTLPR осуществляли с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Использовали олигонуклеотидные праймеры со следующей последовательностью:

5’-ggcgttgccgctcgtaatgc-3’ и 5’-gagggactgagctggacaacc-3’. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 4,0 мМ хлорида магния, 100 нг ДНК, 200 мкМ дезоксинуклеотидтрифосфатов, 10 пмоль каждого праймера, 1М моногидрата бетаина, 0,05 ед. Taq-полимеразы и 10х буфера для Taq-полимеразы. После денатурации ДНК при 94 оС в течение 2 мин проводили 30 циклов ПЦР при следующих условиях: 94 оС - 30 с, 55 оС - 30 с, 72 оС - 35 с. Полученные в результате ПЦР фрагменты ДНК длиной 484 и 528 п.о. разделяли в 8% полиакриламидном геле в течение 1,5 ч при 240 V. Фрагмент длиной 528 п.о. обозначали как аллель L, фрагмент длиной 484 п.о. - как аллель S.

При определении полиморфизма Val66Met гена BDNF использовали олигонуклетидные праймеры: 5’-GAGGCTTGACATCATTGGCT-3’ и 5’-CGTGTACAAGTCTGCGTCCT-3’. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала 2,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,05 ед.полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкмоль каждого из праймеров, 10х буфера для Taq-полимеразы. Денатурацию проводили в течение 2 мин при 94 оС, далее проводили 30 циклов амплификации (94 оС - 15 с, 60 оС - 15 с, 72 оС - 15 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 оС 4 мин. Полученную в результате ПЦР последовательность ДНК длиной 113 п.о. инкубировали с рестриктазой PmaCI при 37 оС с последующим разделением полученных фрагментов в 8% полиакриламидном геле в течение 1 ч при 240 V. Фрагмент длиной 113 п.о. обозначали как аллель Met, фрагменты длиной 78 и 35 п.о. соответствовали аллелю Val.

Содержание серотонина в тромбоцитах определяли микрофлуометрическим методом, как описано нами ранее [11].

Для обнаружения ассоциации между содержанием серотонина, генотипами и наличием депрессии и генерализованного тревожного расстройства применяли однофакторный или многофакторный дисперсионный анализ, в котором содержание серотонина рассматривалось в качестве независимой переменной, а генетический вариант и психическое расстройство были введены в качестве зависимых переменных. Для повышения мощности анализа было сокращено число генетических вариантов за счет объединения генотипов LS и SS, а также ValMet и MetMet. Такое объединение часто используется в литературе: в случае полиморфизма 5-HTTLPR оно считается возможным, так как аллель S рассматривается как функционально доминантный, а в случае полиморфизма Val66Met генотип MetMet часто объединяют с генотипом ValMet или же вообще не учитывают в анализе из-за его крайне низкой частоты в европейских популяциях. В соответствии с таким объединением генотипы, содержащие, по крайней мере, 1 копию аллеля S, т.е. LS или SS, обозначали как аллель S, а генотипы, содержащие, по крайней мере, одну копию аллеля Met, т.е. ValMet и MetMet - как аллель Met. При проведении анализа ассоциаций в качестве нулевой гипотезы принимали отсутствие ассоциации. Нулевая гипотеза отвергалась, если различия между группами сравнения были обнаружены при вероятности, меньшей принятого уровня значимости 0,05. При представлении всех количественных данных использовали их средние значения и стандартные отклонения, величины которых указывали в скобках.

Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что содержание серотонина зависит от эффекта взаимодействия генов переносчика серотонина и BDNF (F=4,1; df=1; p=0,049). Каждый из генов по отдельности значимого влияния на этот показатель не оказывал. Попарное сравнение между различными генетическими вариантами выявило значимые различия (р=0,03) в содержании серотонина между больными с диплотипом LL* аллель Met и диплотипом LL* ValVal (табл. 1).

Следующий анализ был проведен с введением в модель дополнительного фактора, связанного с наличием или отсутствием депрессии или ГТР. В связи с недостаточным объемом выборки включение в модель анализа 3 переменных (генотипы 5-HTTLPR, генотипы Val66Met и присутствие психического расстройства) было невозможно. Поэтому использовали модель двухфакторного анализа, в который в качестве независимых переменных включали один ген и наличие психического расстройства. Данные представлены в табл. 2 и 3.

Таким образом, обнаружено, что содержание ТС у больных с инсультом может различаться в зависимости от генетических вариантов переносчика серотонина и BDNF, носителем которых является больной. Наиболее низкое содержание серотонина обнаружено в группе больных с генетическим вариантом LL*ValVal, наиболее высокое - у больных с генотипом LL и генотипами, содержащими, по крайней мере, 1 копию аллеля Met. Нужно отметить, что генетический вариант LL*ValVal включает в себя аллели, отличающиеся более высокой активностью. Как уже упоминалось, культуральные клетки, содержащие аллель L, продуцировали больше мРНК и белка [4], в результате чего обратный захват серотонина шел более эффективно, и его содержание в клетках могло снижаться. Для гена BDNF обнаружено, что нейроны, в которые был введен вектор, содержащий аллель Met, демонстрировали пониженную секрецию, вызванную деполяризацией [12], по сравнению с генотипом ValVal. Эти особенности могут быть причиной снижения уровня серотонина, хотя механизм такого снижения остается неясным.

Не было обнаружено модулирующего влияния генетического варианта на корреляцию между содержанием ТС в остром периоде инсульта и последующим развитием у больного депрессии или ГТР, хотя оно представлялось весьма вероятным. Это можно объяснить тем, что исследование было проведено на небольшой группе больных, что снижало его мощность и, соответственно, увеличивало вероятность получения ложноотрицательных результатов. Таким образом, необходимо дальнейшее изучение роли генетических факторов в возникновении постинсультных аффективных и тревожных расстройств.

Работа выполнена при частичной поддержке грантом РФФИ №09-04-00349-а.